JP2011160755A - 褐藻類の核酸抽出方法、褐藻類の種判別方法および褐藻類核酸抽出キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 褐藻類の核酸を抽出する方法であって、海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が有する粘性多糖類を分解する工程と、キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程と、タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程とを有する。本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法および褐藻類核酸抽出キットによれば、褐藻類から簡便かつ効率的に高品質な核酸を抽出することができる。また、本発明に係る褐藻類の種判別方法によれば、前記抽出した核酸を用いて褐藻類の種を的確に判別することができる。
【選択図】 図7
Description
褐藻類から抽出された核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行う工程とを有する、前記方法。
(i)海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が有する粘性多糖類を分解する工程(粘性多糖類分解工程)
(ii)キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程(ゲル形成抑制工程)
(iii)タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程(核酸抽出工程)
以上(i)〜(iii)の工程を有する。
(i)海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が含有する粘性多糖類を分解する工程(粘性多糖類分解工程)
(ii)キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程(ゲル形成抑制工程)
(iii)タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程(核酸抽出工程)
(iv)褐藻類から抽出された核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行う工程(核酸増幅工程)
以上(i)〜(iv)の工程を有する。
(1)多糖類分解酵素液の調製
北海道函館市内の市場で生きたエゾアワビ5個体を購入した後、直ちに解体し、ピペットを用いて中腸腺内の消化液を採取したところ、1個体につき約0.8mL、計約4mLの消化液が得られた。このうち0.01mLを粗抽出液とし、−20℃で凍結保存した。一方、残りの消化液について、セルロースチューブ(三光純薬社)を用いて10mmol/Lリン酸緩衝液(pH8)に透析した後、4℃、100000×gの条件下で30分間遠心分離を行い、上清を回収した。続いて、定法に従って80〜100%(w/w)硫酸アンモニウム水溶液により硫安分画を行い、沈殿を回収した。得られた沈殿を10mmol/Lリン酸緩衝液(pH8)に溶解し、セルロースチューブ(三光純薬社)を用いて10mmol/Lリン酸緩衝液(pH8)に透析し、6mLの溶液を得た。この溶液を多糖類分解酵素液とし、使用するまで−20℃で凍結保存した(Shimizu E.ら、Carbohydr.Res.、第341巻、第1809−1819頁、2003年)。
本実施例(1)で調製した粗抽出液0.01mLおよび多糖類分解酵素液0.01mLについて、Porzio & Pearsonの方法(PORZIO,M.A.,PEARSON,A.M.、Biochimica et biophysica acta、第384巻、第235−241頁、1975年)に従いSDS−PAGEを行った。タンパク質分子量マーカーは、Broad Range Marker(New England Biolabs社)を用いた。泳動後のゲルは、0.1%(w/v)クマシーブリリアントブルー(Coomassie Brilliant Blue;CBB)、50%(v/v)メタノールおよび10%(v/v) 酢酸を含む水溶液で染色し、7%(v/v)酢酸および5%(v/v)メタノールを含む水溶液で脱色した。その結果を図1に示す。
本実施例(1)で調製した多糖類分解酵素液0.05mLに、リン酸ナトリウム(pH8)およびアルギン酸ナトリウム(SIGMA社)をそれぞれ10mmol/Lおよび0.2%(w/v)となるように加え、30℃でインキュベートした後、235nmにおける吸光度を測定した。
(1)マコンブの粘性多糖類の分解
北海道函館市沿岸で採取した生マコンブおよび同じ海域で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブからそれぞれ約0.02gの組織片をブレードで切り取り、各組織片をさらに細切りにした。続いてこれらを約0.01gずつに分け、生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群の4群を設定した。実施例1(1)で調製した多糖類分解酵素液をリン酸緩衝液(pH8)で100U/mLに希釈した後、生マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素処理群にそれぞれ1mLずつ加え、17℃で4時間、時々振盪しながらインキュベートした。生マコンブ酵素無処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群には、リン酸緩衝液(pH8)を1mL加えて、同様にインキュベートした。
本実施例(1)の生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群にエチレンジアミン四酢酸(EDTA)をそれぞれ10mmol/Lとなるように加え、17℃で1時間、インキュベートした。
[3−1]DNA抽出液の調製
まず、滅菌水を溶媒として、以下の組成のDNA抽出液を調製した。
Tris−HCl(pH7.5)(ニッポンジーン社) 50mmol/L
EDTA(ニッポンジーン社) 20mmol/L
NaCl(ニッポンジーン社) 100mmol/L
SDS(ニッポンジーン社) 1%(w/w)
メルカプトエタノール(ニッポンジーン社) 2%(w/w)
ProteinaseK(ニッポンジーン社) 0.5mg/mL
本実施例(2)の生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群のそれぞれを200μLずつ分取し、本実施例[3−1]で調製したDNA抽出液のうち800μLずつをそれぞれに加え、55℃で30分間インキュベートした。その後、室温、10000×gの条件下で10分間遠心分離を行い、上清を回収した。続いて、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)の等量をそれぞれに添加し、5分間転倒混和した。室温、11000×gの条件下で1分間遠心分離を行った後、水層を回収し、定法に従いエタノール沈殿を行って沈殿を回収した。これを真空乾燥後、それぞれ20μLの滅菌水に溶解し、DNA溶液とした。
本実施例(2)の生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群のそれぞれを500μLずつ分取し、市販DNA抽出キットのISOHAIR(ニッポンジーン社)を用いて、添付のプロトコールに従いDNAの抽出を行った後、それぞれ20μLの添付のトリスEDTA(TE)緩衝液(pH8)に溶解し、DNA溶液とした。
マコンブのミトコンドリアDNAに存在する16SrRNA遺伝子(アクセッション番号;AP011493)の一部分の約870bpを増幅するプライマーを設計した。設計したプライマーを以下に示す。
フォワードプライマー;5’−GGGTTCAAATCCCACCTTATCC−3’(配列番号3)
リバースプライマー ;5’−ACAACCTAAGCCTTCAATCCC−3’(配列番号4)
(1)マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害
北海道函館市沿岸で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブ12個体からそれぞれ約0.01gの組織片をブレードで切り取り、各組織片をさらに細切りにして1.5mLチューブに入れ、サンプルとした(サンプルNo.1〜No.12)。続いて、125mmol/LのEDTA(pH8)および1mol/LのNaClを含む水溶液0.5mLをそれぞれに添加し、30分間浸漬した。
[2−1]DNA抽出液によるマコンブからのDNA抽出
本実施例(1)のサンプルNo.1〜No.8について、室温、10000×gの条件下で1分間遠心分離を行って上清を除き、実施例2(3)[3−1]に記載の方法により調製したDNA抽出液450μLずつをそれぞれに加えて、55℃で30分間インキュベートした。その後、室温、10000×gの条件下で10分間遠心分離を行い、上清を回収した。続いて、等量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)をそれぞれに添加し、5分間転倒混和した。室温、11000×gの条件下で1分間遠心分離を行った後、水層を約100μLずつ各サンプルにつき2本の1.5mLチューブに分注した。No.1から得られた2本のサンプルをそれぞれNo.1aおよびNo.1b、No.2から得られた2本のサンプルをそれぞれNo.2aおよびNo.2bとし、以下、No.8aおよびNo.8bまでの計16本のサンプルをそれぞれ調製した。
本実施例(1)のサンプルNo.9〜No.12について、市販DNA抽出キットのISOHAIR(ニッポンジーン社)を用いて添付のプロトコールに従いDNAの抽出を行い、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール処理を行った後、室温、11000×gの条件下で1分間遠心分離を行って得られた水層を、約100μLずつ各サンプルにつき2本の1.5mLチューブに分注した。No.9から得られた2本のサンプルをそれぞれNo.9aおよびNo.9b、No.10から得られた2本のサンプルをそれぞれNo.10aおよびNo.10bとし、以下、No.12aおよびNo.12bまでの計8本のサンプルをそれぞれ調製した。
本実施例(1)および本実施例(2)で調製したa標識のサンプルNo.1a〜No.12aの12本を酵素処理群とし、本実施例(1)および本実施例(2)で調製したb標識のサンプルNo.1b〜No.12bの12本を酵素無処理群とした。実施例1(1)で調製した多糖類分解酵素液10Uを125mmol/LのEDTA(pH8)で100μLにメスアップして酵素処理群のサンプルNo.1a〜No.12aにそれぞれ添加した。また、コントロールとして多糖類分解酵素液10Uを125mmol/LのEDTA(pH8)で200μLにメスアップしたサンプルを作成した。酵素無処理群のサンプルNo.1b〜No.12bには125mmol/LのEDTA(pH8)100μLをそれぞれ添加した。その後、すべてのサンプルを30℃で4時間インキュベートし、さらに90℃で10分間インキュベートした。続いて、定法に従いエタノール沈殿を行って得られた沈殿を風乾した後、100μLのTE緩衝液{10mM Tris−HCl(pH8)、1mM EDTA}に溶解し、GENECLEAN SPIN KIT(Q−BIO gene社)を用いて精製した。
本実施例(3)の各サンプルからそれぞれ5μLずつ分取し、これらを鋳型として、実施例2(5)に記載の方法によりPCRおよびアガロースゲル電気泳動を行った。サンプルNo.1a〜No.8aおよびサンプルNo.1b〜No.8bについての結果を図3に、サンプルNo.9a〜No.12aおよびサンプルNo.9b〜No.12bについての結果を図4に示す。
(1)アメフラシ由来多糖類分解酵素液の調製
北海道函館市沿岸で生きたアメフラシ20個体を採取した後、直ちに解体し、ピペットを用いて中腸腺内の消化液を採取したところ、1個体につき約0.5mL、計約10mLの消化液が得られた。これを、実施例1(1)に記載の方法により精製し、12mLの溶液を得た。この溶液をアメフラシ由来多糖類分解酵素液とし、使用するまで−20℃で凍結保存した。
北海道函館市沿岸で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブ9個体をサンプル(サンプルNo.13〜No.21)として、実施例3(1)に記載の方法により、ゲル形成阻害を行った。
本実施例(2)のサンプルNo.13〜No.21について、実施例3[2−2]に記載の方法によりDNA抽出を行い、a標識のサンプルNo.13a〜No.21aおよびb標識のサンプルNo.13b〜No.21bの、計18本のサンプルを調製した。
本実施例(3)で調製したa標識のサンプルNo.13a〜No.16aの4本について、実施例1(1)の多糖類分解酵素液を本実施例(1)のアメフラシ由来多糖類分解酵素液に代えて、実施例3(3)に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。続いて、実施例3(4)に記載の方法により、a標識のサンプルNo.13a〜No.16aを鋳型としたPCRおよびアガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図5に示す。
本実施例(3)で調製したa標識のサンプルNo.17a〜No.21aの5本については、実施例1(1)で調製した多糖類分解酵素液を市販のアルギン酸分解酵素(Flavobacterium sp.由来アルギン酸リアーゼ;SIGMA社)に代えて、実施例3(3)に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。本実施例(3)で調製したb標識のサンプルNo.17b〜No.21bの5本については、実施例1(1)で調製した多糖類分解酵素液を市販の多糖類分解酵素(Aspergillus niger由来ペクチナーゼ;SIGMA社)に代えて、実施例3(3)に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。
(1)マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害
北海道函館市沿岸で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブ5個体をサンプルNo.22〜No.26とし、1個体につき約0.04gずつ組織片をブレードで切り取り、各組織片をさらに細切りにした後、それぞれを約0.01gずつに分けた。No.22から得られた4本のサンプルをそれぞれNo.22a、No.22b、No.22cおよびNo.22d、No.23から得られた4本のサンプルをそれぞれNo.23a、No.23b、No,23cおよびNo.23dとし、以下、No.26a、No.26b、No.26cおよびNo.26dまでの計20本のサンプルをそれぞれ調製した。
本実施例(1)のa標識のサンプルNo.22a〜No.26a、b標識のサンプルNo.22b〜No.26b、c標識のサンプルNo.22c〜No.26cおよびd標識のサンプルNo.22d〜No.26dの全てについて、実施例3(2)[2−2]に記載の方法によりDNA抽出を行い、各サンプルにつき2本のDNA溶液を調製した。そのうち各サンプルにつき1本のDNA溶液を以下の処理に供した。
本実施例(2)で調製したa標識のサンプルNo.22a〜No.26の5本については、125mmol/LのEDTA(pH8)を10mmol/Lのクエン酸に代えて、本実施例(2)で調製したb標識のサンプルNo.22b〜No.26bの5本については、前記EDTAを10mmol/Lのグリコールエーテルジアミン四酢酸(EGTA)に代えて、調製したc標識のサンプルNo.22c〜No.26cの5本については、前記EDTAを10mmol/Lの酒石酸に代えて、調製したd標識のサンプルNo.22d〜No.26dの5本については、前記EDTAを10mmol/Lのフィチン酸に代えて、それぞれ、実施例3(3)に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。
(1)マコンブの粘性多糖類の分解
北海道函館市沿岸で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブから約0.05gの組織片をブレードで切り取り、これをさらに細切りにした後、約0.01gずつに分け、サンプルとした(サンプルNo.27〜No.32)。これら5つのサンプルについて、実施例2(1)に記載の方法により、マコンブの粘性多糖類の分解を行った。
続いて、本実施例(1)で調製したサンプルNo.27〜No.31について、実施例2(2)に記載の方法によりゲル形成阻害を行った。
[3−1]DNA抽出液の調製
実施例2(3)[3−1]に記載のDNA抽出液の組成において、以下の1.〜4.の点で異なるDNA抽出液をそれぞれ調製した。
1.ProteinaseKを添加しないDNA抽出液(タンパク質分解酵素無添加DNA抽出液)
2.ProteinaseKをパパイン(製品名パパイン;メルク社)に代えたDNA抽出液(パパイン−DNA抽出液)
3.ProteinaseKをキモトリプシン(製品名α−キモトリプシン;和光純薬工業社)に代えたDNA抽出液(キモトリプシン−DNA抽出液)
4.ProteinaseKをトリプシン(製品名トリプシン;ロシュ・アプライド・サイエンス社)に代えたDNA抽出液(トリプシン−DNA抽出液)
本実施例(2)で調製したサンプルNo.27については、実施例2(3)[3−1]で調製したDNA抽出液を本実施例(3)[3−1]で調製したタンパク質分解酵素無添加DNA抽出液に代えて、本実施例(2)で調製したサンプルNo.28については、実施例2[3−1]で調製したDNA抽出液を本実施例(3)[3−1]で調製したパパイン−DNA抽出液に代えて、本実施例(2)で調製したサンプルNo.29については、実施例2(3)[3−1]で調製したDNA抽出液を本実施例(3)[3−1]で調製したキモトリプシン−DNA抽出液に代えて、本実施例(2)で調製したサンプルNo.30については、実施例2(3)[3−1]で調製したDNA抽出液を本実施例(3)[3−1]で調製したトリプシン−DNA抽出液に代えて、本実施例(2)で調製したサンプルNo.31については、実施例2(3)[3−1]で調製したDNA抽出液を用いて、それぞれ、実施例2(3)[3−2]に記載の方法によりマコンブからのDNA抽出を行った。
(1)様々な褐藻類の粘性多糖類のゲル形成阻害
コンブ属8種(マコンブ、ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ)、トロロコンブ属2種(ガゴメ、トロロコンブ)、スジメ属1種(スジメ)およびワカメを北海道沿岸で採取した後、天日で乾燥させた。その後、それぞれ乾燥重量で約0.01gの組織片をブレードで切り取り、実施例3(1)に記載の方法により粘性多糖類のゲル形成阻害を行った。
本実施例(1)の全てのサンプルについて、実施例3(2)[2−1]に記載の方法によりDNAを抽出し、各サンプルにつき2本ずつ、DNA溶液を調製した。そのうち、各サンプルにつき1本ずつ、DNA溶液を以下の処理に供した。
本実施例(2)で調製した各サンプルのDNA溶液について、実施例3(3)に記載の方法により粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。また、コントロールのサンプルも同様に作成した。
マコンブのミトコンドリアDNAに存在するNAD5遺伝子(アクセッション番号;AP011493)の一部分の約490bpを増幅するプライマーを設計した。設計したプライマーを以下に示す。
フォワードプライマー;5’−TCTATACGCCTTTTAGCTTT−3’(配列番号5)
リバースプライマー ;5’−CTAAACTTTCAATAAGACCACG−3’(配列番号6)
実施例7で得たマコンブ、ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブコンブおよびスジメの約490bpのPCR産物を、GENECLEAN Kit(Q−BIO gene社)を用いてそれぞれ精製した後、制限酵素EcoT14IおよびPstIで消化した。
実施例7に記載の方法により得たガゴメ28個体の約490bpのPCR産物を、GENECLEAN Kit(Q−BIO gene社)を用いてそれぞれ精製した後、各サンプルにつき半量を制限酵素EcoT14IおよびPstIで消化した。その後、制限酵素で消化しなかったサンプルと制限酵素で消化したサンプルとを並べて、実施例2(5)に記載の方法により、アガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図10に示す。
Claims (20)
- 褐藻類の核酸を抽出する方法であって、
海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が有する粘性多糖類を分解する工程と、
キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程と、
タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程と
を有する、前記方法。 - 海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、請求項1に記載の方法。
- キレート剤がEDTAである、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 粘性多糖類がアルギン酸を含有する粘性多糖類である、請求項1から請求項3のいずれかに記載の方法。
- 多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、請求項1から請求項4のいずれかに記載の方法。
- アルギン酸リアーゼがHdAlyおよび/またはHdAlexである、請求項1から請求項5のいずれかに記載の方法。
- タンパク質分解酵素がProteinaseKである、請求項1から請求項6のいずれかに記載の方法。
- 褐藻類の種を判別する方法であって、
海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が含有する粘性多糖類を分解する工程と、
キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程と、
タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程と、
褐藻類から抽出された核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行う工程と
を有する、前記方法。 - 海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、請求項8に記載の方法。
- キレート剤がEDTAである、請求項8または請求項9に記載の方法。
- 粘性多糖類がアルギン酸を含有する粘性多糖類である、請求項8から請求項10のいずれかに記載の方法。
- 多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、請求項8から請求項11のいずれかに記載の方法。
- アルギン酸リアーゼがHdAlyおよび/またはHdAlexである、請求項8から請求項12のいずれかに記載の方法。
- タンパク質分解酵素がProteinaseKである、請求項8から請求項13のいずれかに記載の方法。
- 海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素と、キレート剤と、タンパク質分解酵素とを有してなる、褐藻類核酸抽出キット。
- 海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、請求項15に記載の褐藻類核酸抽出キット。
- キレート剤がEDTAである、請求項15または請求項16に記載の褐藻類核酸抽出キット。
- 多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、請求項15から請求項17のいずれかに記載の褐藻類核酸抽出キット。
- アルギン酸リアーゼがHdAlyおよび/またはHdAlexである、請求項15から請求項18のいずれかに記載の褐藻類核酸抽出キット。
- タンパク質分解酵素がProteinaseKである、請求項15から請求項19のいずれかに記載の方法。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015159787A (ja) * | 2014-02-28 | 2015-09-07 | 公益財団法人函館地域産業振興財団 | コンブの原産国判別方法並びにプライマー及びプライマーを含むキット |
KR102249241B1 (ko) * | 2020-08-13 | 2021-05-07 | 한지성 | 신혈관생성 및 세포재생 효과를 갖는 해조류 유래 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 추출방법 |
KR102622003B1 (ko) * | 2022-10-24 | 2024-01-10 | 포리바이오 주식회사 | 어류 생식세포 유래 dna 단편 중합체의 제조 방법 |
-
2010
- 2010-02-12 JP JP2010029136A patent/JP2011160755A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6014018156; 2007年(平成19年)度日本水産学会秋季大会講演要旨集 (2007) p.63(519) * |
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