TWI607087B - 洋菜酶、含其之組合物、及其應用 - Google Patents

洋菜酶、含其之組合物、及其應用 Download PDF

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Description

洋菜酶、含其之組合物、及其應用
本發明關於一種洋菜酶；尤指一種透過原核細胞表現系統生產的洋菜酶。
洋菜(agar)是一種由石花菜(Gelidium spp.)、龍鬚菜(Gracilaria spp.)及紫菜(Porphyra spp.)等紅藻之細胞壁所萃取之親水性多醣類，主要成分為瓊脂醣(agarose)與瓊脂膠(agaropectin)。瓊脂醣為可形成凝膠之中性多醣，分子量在100kDa以上，係由重複之D-半乳糖與3,6-無水-α-L-半乳糖(3,6-anhydro-α-L-galactopyranose)以α-1,3與β-1,4醣苷鍵連接所組成。瓊脂膠為不可形成凝膠之酸性多醣，分子量在20kDa以下，其組成與瓊脂醣相同，但某些3,6-無水-α-L-半乳糖之羥基會被置換成甲氧基(methoxy)、硫醯基(sulfoxy)及丙酮酸(pyruvate)。
可分解洋菜之水解酵素稱之為洋菜酶(agarase)；根據洋菜酶作用位置之不同，可將洋菜酶分為α-洋菜酶(EC 3.2.1.158)與β-洋菜酶(EC 3.2.1.81)。α-洋菜酶作用於瓊脂醣與瓊脂膠之α-1,3醣苷鍵，產生還原端具有3,6-無水-α-L-半乳糖基團之洋菜寡醣(agaro-oligosaccharides)。β-洋菜酶作用於瓊脂醣與瓊脂膠之β-1,4醣苷鍵，產生還原端具有D-半乳糖基團之新洋菜寡醣(neoagaro-oligosaccharides)。
洋菜酶具有多種用途，例如可應用於分子生物學實驗，進行瓊脂醣膠 體中DNA之回收；可應用於軟骨組織工程，處理支撐軟骨細胞之洋菜基材，促進軟骨細胞增殖與增加膠原蛋白含量，提高軟骨組織培養的效果；可應用於洋菜寡醣與新洋菜寡醣之製備；可應用於藻類原生質體(protoplast)之製作，進行DNA轉形或細胞融合；可應用於海藻多醣之水解，再藉由水解產物之組成，推測海藻多醣之結構；可應用於海藻單細胞之製備，作為海洋養殖動物之餌料。
此外，目前研究顯示，利用洋菜酶水解洋菜或海藻多醣粗萃物所得之寡醣具有多項生理與生物活性，例如抗氧化、免疫調節、抑菌、抑制酪胺酸酶(tyrosinase)、保濕、作為益生質(prebiotic)及降低血清總膽固醇等功效，可作為新一代之高價值功能性寡醣，應用於化妝品、保健食品及醫藥產業。目前雖已發現多種微生物可產生洋菜酶，但天然微生物所生產之洋菜酶於產業應用中實遭遇多種困難，例如，產量不足、產量不穩定、菌種安全性顧慮等，且有生產成本過高而不利於大量生產的缺點。
有鑑於此，領域中亦有考慮以酸水解洋菜或海藻多醣粗萃物來取得所需的寡醣，但酸水解法僅能獲得洋菜寡醣，且無法獲得聚合度均一之產物。相較於利用酸水解洋菜產生寡醣之方法，利用酵素水解法具有多項優勢，包括酵素可選擇性剪切特定醣苷鍵，獲得特定聚合度之寡醣；降解條件容易控制；酵素作用溫度較酸水解溫度為低，可降低能源消耗；操作流程較酸水解法簡單，不需進行酸鹼中和與脫鹽等過程；不需使用化學藥劑，較安全且減少污染環境之可能性；利用酵素水解法可生產洋菜寡醣或新洋菜寡醣等，仍較酸水解法來得理想。
綜上所述，為有利洋菜酶水解洋菜或海藻多醣粗萃物所得之寡醣於產業中利用，領域中需要一種新穎的洋菜酶，以提供產業中更多的選擇。此外，領域中也需要一種低成本之洋菜酶生產方法，以降低前述寡醣的生產成本，更有利於商業化。
爰是，本發明的一個目的為提供一種新穎的洋菜酶，讓產業有更多種 不同的選擇。
本發明的另一個目的為提供一種利用洋菜酶生產新洋菜寡醣的方法，其採用原核細胞表現系統進行異源性洋菜酶的大量生產，並將所取得的洋菜酶運用於洋菜、瓊脂醣或海藻多醣粗萃物之水解，而得以降低新洋菜寡醣的生產成本。
為了達到上述目的，本發明提供一種β-洋菜酶，其包含如SEQ ID NO 01所示之序列。較佳地，前述β-洋菜酶係由如SEQ ID NO 02所示之序列所轉譯而得。
本發明亦提供一種轉譯為β-洋菜酶的基因，其包含如SEQ ID NO 02所示之序列。
本發明又提供一種用於分解瓊脂醣之組合物，其包含：0.1至10U/mL之前述β-洋菜酶；及1至2mM之鹽類；其中前述U/mL及前述mM之濃度單位係分別以前述組合物的總體積為基礎。
較佳地，前述組合物進一步包含一50至200mM之緩衝液，其係以前述組合物的總體積為基礎；其中前述緩衝液為：檸檬酸緩衝液(pH 5~6)、或磷酸緩衝溶液(pH 6~7)。
較佳地，其中前述鹽類為：CuSO4、KCl、FeSO4、BaCl2、NaCl、SrCl2、CoCl2、MgSO4、MnCl2、CaCl2、AlCl3、或其組合。
較佳地，前述β-洋菜酶係經由於一基因表現系統異源性地表現如SEQ ID NO 02所示之核苷酸序列而得。較佳地，前述基因表現系統為大腸桿菌表現系統。
較佳地，前述β-洋菜酶係經由一含有表現載體之大腸桿菌表現系統進行異源性地表現所製得；其中前述表現載體包含如SEQ ID NO 02所示之核苷酸序列。較佳地，前述表現載體具有如SEQ ID NO 05所示之核苷酸序列。較佳地，前述異源性地表現係於15至32℃下進行。
本發明更提供一種分解瓊脂醣的方法，其包含以下步驟：(A)提供一樣本，其包含一瓊脂醣；(B)使前述樣本與如前所述之β-洋菜酶接觸，並 取得一產物。
較佳地，前述產物中包含95重量百分比以上的新洋菜四糖，其中前述重量百分比係以前述產物的總重量為基礎。
較佳地，前述產物實質上不包含新洋菜二糖及/或新洋菜六糖。
較佳地，前述步驟(B)之反應係於40至45℃的溫度下進行。
較佳地，前述步驟(B)之反應係於pH值5至7下進行。
較佳地，前述步驟(B)之反應係進行1至24小時。
較佳地，前述樣本為：瓊脂醣、低熔點瓊脂醣、洋菜、海藻多醣粗萃物、或其組合。
較佳地，前述β-洋菜酶係經由於一基因表現系統異源性地表現如SEQ ID NO 02所示之核苷酸序列而得。較佳地，前述基因表現系統為一大腸桿菌表現系統。
較佳地，前述β-洋菜酶係經由一含表現載體之大腸桿菌表現系統進行異源地表現所製得；其中前述表現載體包含如SEQ ID NO 02所示之核苷酸序列。較佳地，前述表現載體具有如SEQ ID NO 05所示之核苷酸序列。較佳地，前述異源性地表現係於15至32℃下進行。
本發明再提供一種β-洋菜酶表現載體，其包含：一核苷酸序列，包含如SEQ ID NO 02所示之核苷酸序列；及一調控元件。較佳地，前述調控元件包含一啟動子與核糖體結合部位。
較佳地，前述表現載體具有如SEQ ID NO 05所示之核苷酸序列。
綜上所述，本發明提供一種新穎的洋菜酶，並教示使用該洋菜酶分解瓊脂醣的方法。值得注意的是，利用本發明之新穎洋菜酶分解瓊脂醣可取得實質上不含新洋菜二糖與新洋菜六糖的產物，且該產物中實質上僅含有新洋菜四糖。據此，透過本發明之洋菜酶可輕易取得高純度的新洋菜四糖，而有助於降低新洋菜四糖的生產成本。此外，本發明提供一種異源性表現洋菜酶的方法。該方法可藉由大腸桿菌表現系統表現本發明洋菜酶，從而可以大幅度降低洋菜酶的生產成本並增進生產穩定度，而有利於商業 化。
第一圖係一蛋白質電泳圖，其顯示實施例二中，於不同溫度下，在大腸桿菌表現系統中表現本發明洋菜酶的情況。(A)37℃，(B)30℃，(C)25℃，(D)20℃，(E)16℃；其中第1行係表現4個小時之後的數據，第2行係表現24個小時之後的數據。
第二圖係實施例三的酵素活性測定結果，其顯示可被本發明洋菜酶水解之受質。
第三圖係實施例三的薄層層析法結果，其顯示低熔點瓊脂醣經本發明洋菜酶水解後的產物。
第四圖係實施例三的DNA回收實驗的結果，其顯示本發明洋菜酶應用於回收DNA的效率。
如前所述，雖然領域中已知可利用微生物來生產洋菜酶，但這樣的生產方式仍有諸多缺點。另一方面，雖然領域中已知可利用原核細胞表現系統來表現標的蛋白質，但並非所有蛋白質皆可藉由原核細胞表現系統進行大量表現。影響原核細胞表現系統生產標的蛋白質之因素包括基因密碼子之分佈、mRNA之穩定性、標的蛋白質之穩定性、表現系統之選用、及表現系統之生產參數。若標的蛋白質本身就不適合以異源性的方式來生產，利用原核細胞表現系統生產該標的蛋白質自無成功的可能性。再者，表現系統的各項生產參數關鍵性地影響該表現系統是否可以商業規模生產標的蛋白質，從而決定生產成本。
Paenibacillus agarexedens為科學家Miehlmann於西元1972年自濕草原土(meadow soil)中所分離之細菌。在本發明之前，從未有任何關於該菌種洋菜酶基因的報導。本發明自該細菌中分離出特定的基因片段，並從而取得一新穎的洋菜酶，可提供領域中另一個洋菜酶的選擇。
具體來說，本發明的一個面向中提供一種β-洋菜酶，其包含如SEQ ID NO 01所示之序列。前述SEQ ID NO 01所示者為本發明之洋菜酶的胺基酸序列。依據胺基酸與密碼子的對應關係，所屬領域具有通常知識者自可推估出可轉譯出前述SEQ ID NO 01所示序列的核苷酸序列。於一較佳實施態樣中，前述β-洋菜酶係由如SEQ ID NO 02所示之序列所轉譯而得。
本發明的另一個面向中提供一種用於分解瓊脂醣之組合物。前述組合物可應用於產業中以供取得瓊脂醣的水解產物，如新洋菜四糖。前述組合物包含0.1至10U/mL之前述β-洋菜酶及1至2mM之鹽類；其中前述U/mL及前述mM之濃度單位係分別以前述組合物的總體積為基礎。
於較佳實施態樣中，前述鹽類包含：CuSO4、KCl、FeSO4、BaCl2、NaCl、SrCl2、CoCl2、MgSO4、MnCl2、CaCl2、AlCl3、或其組合。所屬領域具有通常知識者當可理解，前述鹽類於本發明之組合物中可能經解離而以金屬離子與非金屬離子之狀態存在、或同時存在解離及未解離的狀態。
於一較佳實施態樣中，前述組合物可進一步包含一50至200mM之緩衝液，其係以前述組合物的體積為基礎。前述緩衝液的選用以不破壞前述β-洋菜酶的結構、功能、或其他特性為原則。舉例來說，前述緩衝液例如檸檬酸緩衝液(pH 5~6)、或磷酸緩衝溶液(pH 6~7)。
本發明的又一個面向中提供一種分解瓊脂醣的方法。前述方法以下步驟：(A)提供一樣本，其包含一瓊脂醣；(B)使前述樣本與前述β-洋菜酶接觸，並取得一產物。前述樣本可為：瓊脂醣、低熔點瓊脂醣、洋菜、海藻多醣粗萃物、或其組合。
在一較佳實施態樣中，前述方法所得之前述產物中包含95重量百分比以上的新洋菜四糖，其中前述重量百分比係以前述產物的總重量為基礎。在又一較佳實施態樣中，前述產物實質上不包含新洋菜二糖及/或新洋菜六糖。由於新洋菜二糖、新洋菜四糖、及新洋菜六糖分別有不同的產業應用，以本發明方法分解瓊脂醣可取得具有高純度之新洋菜四糖的產物，無須再進行額外的純化步驟，可直接供產業中使用，從而節省製程成本與時間。
在一較佳實施態樣中，前述步驟(B)之前述接觸係於40至45℃的溫度下進行。在一較佳實施態樣中，前述步驟(B)之前述接觸係於pH值5至7下進行。在一較佳實施態樣中，前述步驟(B)之前述接觸係進行1至24小時。
於一較佳實施態樣中，前述β-洋菜酶係經由於一基因表現系統異源性地表現如SEQ ID NO 02所示之核苷酸序列而得。本發明所述之「異源性地表現」或其他類似之詞彙係指前述β-洋菜酶係於一非其自然來源之微生物中表現。舉例來說，前述β-洋菜酶的自然來源之微生物係P.agarexedens，若於一大腸桿菌表現系統中表現前述β-洋菜酶即屬本發明所述之「異源性地表現」。
於一較佳實施態樣中，前述β-洋菜酶係經由一含表現載體之大腸桿菌表現系統進行異源性地表現所製得。可行地，前述表現載體包含如SEQ ID NO 02所示之核苷酸序列。在一可行實施態樣中，前述表現載體具有如SEQ ID NO 05所示之核苷酸序列。
如前所述，表現系統的各項生產參數影響標的蛋白質之產量，並影響生產成本。若能取得關鍵性生產參數的數值，將可有效率的於一表現系統中大量生產標的蛋白質。在本發明的一個較佳實施態樣中，本發明經大量試驗後獲致於一大腸桿菌表現系統中異源性地表現本發明之β-洋菜酶的較佳溫度條件：15至32℃。β-洋菜酶於前述溫度範圍中之可溶性表現量較佳，而有助於大規模商業化生產作業。
本發明的再一個面向中提供一種β-洋菜酶表現載體，其包含：一核苷酸序列，包含如SEQ ID NO 02所示之核苷酸序列；及一調控元件。前述調控元件是指於表現系統中啟動基因轉錄與轉譯過程所需的元件。前述調控元件至少應包含啟動子(promoter)與核糖體結合部位。較佳地，前述調控元件可額外包含：操縱子(operator)、轉錄/轉譯的加強子序列(enhancer sequences)、或其組合。
於一較佳實施態樣中，前述表現載體具有如SEQ ID NO 05所示之核苷酸序列。
實施例一：選殖本發明之洋菜酶基因與建構本發明之表現載體。
本實施例自P.agarexedens的全基因體中挑選出一基因序列(其胺基酸序列如SEQ ID NO 01，共883個胺基酸；其核苷酸序列如SEQ ID NO 02，共2652個核苷酸)，經蛋白質比對分析後認為可能轉譯出具有分解瓊脂醣能力的蛋白質(即，一洋菜酶)。在本發明之前，從未有任何研究揭露該基因與其基因產物可能的生理活性。此外，該基因與本發明申請時領域中所習知的洋菜酶基因亦不具明顯的相似度。本發明進一步透過基因工程將該序列建構於一表現載體中，以期在一原核細胞表現系統中大量且穩定的表現所需的洋菜酶。
菌種與培養基
以購自食品工業研究所之P.agarexedens BCRC 17346作為洋菜酶基因研究對象。以大腸桿菌(Escherichia coli)ECOS 9-5(Yeastern,Taiwan)作為DNA選殖用之宿主細胞。
利用含有0.1%尿素之營養培養基(nutrient broth)培養基(BD Difco,USA)進行P.agarexedens之培養，視需要添加1.5%(w/v)洋菜(agar)(BD Difco,USA)製備固體培養基。利用Lurai-Bertani(LB)培養基(BD Difco,USA)進行大腸桿菌之培養，視需要添加適量抗生素或1.5%洋菜。
基因體DNA(genomic DNA)之抽取
挑取單一BCRC 17346菌落接種於含有0.1%尿素之營養培養基中。於30℃下以180rpm之轉速進行振盪培養24小時後，利用DNA純化套組(Tissue & Cell Genomic DNA Purification kit；GMbiolab,Taiwan)進行菌株基因體DNA之抽取。首先取4mL之培養菌液至離心管中，經離心(5,870×g，5分鐘)後，倒除上清液，收集菌體部分。加入200μL之溶液A(10mM Tris-HCl,pH 8.0；10mM EDTA；50mM；NaCl；20%(w/v)sucrose；10mg/mL lysozyme)重新懸浮菌體，並於37℃下作用1小時。此步驟之目的在於分解菌體之細胞壁。接著加入20μL的蛋白酶K(proteinase K；10mg/mL)及200μL的萃取試劑，於56℃下作用3小時，其中每5 分鐘便輕緩地上下搖晃以使菌體與試劑充分混合。之後，加入200μL的結合試劑(Binding solution)並於70℃下作用10分鐘。接著加入200μL的無水酒精至微量離心管中並均勻混合，再吸取所有溶液(包括沉澱物)至一離心分離小管(spin column)。將該離心分離小管放置於收集小管(collection tube)中，並進行離心。離心2分鐘(17,970×g)倒除流出液後，加入300μL的結合試劑至離心分離小管，再離心2分鐘(17,970×g)，倒除流出液。之後，再加入700μL的清洗試劑(wash solution)至離心分離小管，經離心2分鐘(17,970×g)後，倒除流出液，並重複上述步驟一次。最後以17,970×g之條件離心5分鐘，去除殘留酒精。將離心分離小管放入一滅菌微量離心管中，加入適量無菌去離子水引流基因體DNA。
本發明洋菜酶基因之選殖
以P.agarexdens基因體DNA為模板，利用聚合酶連鎖反應增幅本發明之洋菜酶基因片段。於該聚合酶連鎖反應使用下列引子對。
在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP及dCTP，1μM擴增引子，100ng P.agarexdens基因體DNA及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為98℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。
PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。利用PCR-MTM Clean Up system kit(GeneMark,Taiwan)並依據產品使用說明進行PCR產物之回收。接著使用CloneJET PCR Cloning Kit來進行洋菜酶基因之選殖。選殖之實驗步驟係參考廠商提供之操作手冊進行。 將黏合混合物(ligation mixture)轉形入大腸桿菌ECOSTM 9-5中。轉形的詳細步驟可參酌產品使用說明，或由領域中的標準實驗步驟加以修飾調整。
將轉形後之菌體培養於含安比西林(ampicillin,100μg/mL)之LB固態培養基上，待長成菌落後，以菌落聚合酶連鎖反應(colony PCR)篩選轉形株。PCR反應條件為：95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃，反應3分鐘(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。經colony PCR確認轉形株中之重組質體帶有外插DNA(insert DNA)後，再抽取轉形株中之質體進行DNA定序(源資國際生物科技股份有限公司)。將含有洋菜酶基因之質體命名為pJET-AGAB-4。
建構本發明之表現載體
將pJET-AGAB-4以KpnI與XhoI剪切後，利用T4 DNA ligase將本發明之洋菜酶基因片段接入以相同限制酶剪切之pET29a質體中。將黏合產物(黏合有本發明之洋菜酶基因片段的pET29a質體)轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。確認轉形株中之重組質體帶有外插DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤之質體命名為pET-AGAB-4，即為本發明之表現載體，其具有如SEQ ID NO 05所示之序列。
實施例二：建立表現本發明洋菜酶的原核細胞表現系統
在本發明之前，領域中從未有人於原核細胞表現系統中成功表現本發明之洋菜酶。本實施例將嘗試於一大腸桿菌表現系統中表現本發明之洋菜酶，以達到大量與穩定表現的目標。
菌種與培養基
以大腸桿菌BL21(DE3)作為本實施例之基因表現宿主。利用Lurai-Bertani(LB)培養基(BD Difco,USA)進行大腸桿菌之培養，視需要添加適量抗生素或1.5%洋菜。
本發明洋菜酶於不同溫度下的表現情況
將本發明表現載體pET-AGAB-4轉形入E.coli BL21(DE3)。挑選單一菌落接種於含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30μg/mL)之5mL LB培養基中，於37℃、180rpm之條件下進行培養。經隔夜培養後，取100μL前培養菌液加入含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30μg/mL)之10mL LB培養基中，振盪培養(37℃，180rpm)至OD600約為0.4~0.6左右，加入0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)並於特定溫度(37℃、30℃、25℃、20℃或16℃)下進行重組蛋白質之誘導表現。分別於誘導4與24小時後，取2mL菌液進行離心(20,630×g，5分鐘，4℃)，收集菌體部分，進行可溶性蛋白質與不可溶性蛋白質之劃分(即，可溶性與否)。利用蛋白質電泳觀察重組洋菜酶之可溶性表現情形。
從第一圖的結果可知，在16至37℃的溫度範圍內，本發明洋菜酶皆順利於大腸桿菌表現系統中表現。進一步分析在不同溫度下所表現之本發明洋菜酶的可溶性可觀察到(如下表一中所示)，雖然本發明洋菜酶於16至37℃的溫度範圍內皆可順利被表現，但在37℃下表現出的可溶性洋菜酶的產量較低。反觀在30℃、25℃、20℃或16℃的溫度下，皆可在短時間內取得大量的可溶性洋菜酶。相較於不可溶性洋菜酶的純化步驟而言，可溶性洋菜酶的純化步驟較簡單，因此，可溶性洋菜酶對於商業化規模的生產特別有利。
實施例三：本發明洋菜酶的特性分析
本實施例係以實施例二所建構的表現系統進行本發明洋菜酶之表現，並進一步進行重組洋菜酶之純化以供特性分析之用。
本發明洋菜酶之表現與純化
挑選實施例二中之表現菌株E.coli BL21(DE3)(pET-AGAB-4)之單一菌落，並將其接種於含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30μg/mL)之12mL LB培養基中，於37℃、180rpm之條件下進行培養。經隔夜培養後，取10mL前培養菌液加入含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30μg/mL)之1L LB培養基中，振盪培養(37℃,180rpm)至OD600約為0.4~0.6左右。接著加入0.1mM IPTG並於20℃下進行重組蛋白質之誘導表現。誘導24小時後，離心(10,000×g，10分鐘，4℃)收集菌體部份。再將菌體懸浮於10mL lysis buffer(20mM sodium phosphate，500mM NaCl，pH 7.4)中，並利用超音波破碎儀將菌體破碎後，進行離心(8,000×g，15分鐘)以收集上清液部分。最後再以0.22μm過濾膜過濾所收集到的上清液。
然後，利用重組蛋白質C端之His tag能與鎳或鈷離子形成配位共價鍵之特性，採用固定化金屬離子親和層析法(immobilized-metal affinity chromatography)進行蛋白質純化。重組洋菜酶之純化之方式係利用蛋白質液相層析系統ÄKTA prime plus(GE Healthcare,Sweden)搭配5mL HiTrapTM Ni excel管柱(GE Healthcare,Sweden)進行。首先，以25mL Lysis buffer平衡管柱後，將前述上清液注入HiTrapTM Ni excel管柱。待樣品注入完成後，以100mL含30mM咪唑(imidazole)之清洗緩衝液(20mM磷酸鈉，500mM NaCl，30mM咪唑，pH 7.4)洗除非特異性結合之蛋白質。最後以150mL含250mM咪唑之溶離緩衝液(20mM磷酸鈉，500mM NaCl，250mM咪唑，pH 7.4)沖提樹脂上的洋菜酶，其原理係藉助高濃度的咪唑與重組蛋白質競爭樹脂結合部位，致使重組洋菜酶自樹脂上被沖提下來。將純化之蛋白質溶液放入Amicon ultra-15 ultracel-30K離心管(Merck Millipore,USA)中，於4℃下以2,600xg離心至適當體積後，貯存於4℃中備用。
本發明洋菜酶之受質特性分析
本實驗係探討可被本發明洋菜酶水解的物質。將850μL 0.24%(w/v)之瓊脂醣、低熔點瓊脂醣、洋菜、海藻酸鈉(sodium alginate)、鹿角菜膠(carrageenan)、可溶性澱粉及羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose)溶液分別與100μL 0.5M磷酸緩衝溶液(pH 6)混合均勻後，加熱至完全溶解並於55℃下放置10分鐘。接著加入50μL經適當稀釋之洋菜酶溶液至酵素反應受質中，於55℃下反應10分鐘。反應完畢後，立即加入1.0mL DNS溶液(1% 3,5-dinitrosalicylic acid、30% potassium sodium tartrate tetrahydrate、1.6% NaOH)，並於100℃下加熱5分鐘。待反應液冷卻後，加入1mL去離子水進行混合，並取出100μL反應液至96孔盤中，再以ELISA reader於540nm下測定吸光值。利用不同濃度之半乳糖(D-galactose)溶液進行DNS呈色反應，建立還原糖之標準曲線。最後將樣品於540nm下所測得之吸光值利用半乳糖標準曲線計算酵素反應所釋出之還原糖量。一個活性單位(activity unit,U)定義為每分鐘產生相當於1μmole半乳糖所需之酵素量。
實驗結果如第二圖中所示，本發明洋菜酶可水解瓊脂醣、低熔點瓊脂醣與洋菜，對瓊脂醣的水解能力最佳，但無法水解海藻酸鈉、鹿角菜膠、可溶性澱粉及羧甲基纖維素鈉。
本發明洋菜酶水解瓊脂醣之產物分析
本實驗採用薄層層析法(Thin layer chromatography,TLC)分析洋菜酶水解瓊脂醣之產物。將850μL 0.24%(w/v)低熔點瓊脂醣溶液與100μL 0.5M磷酸緩衝溶液(pH 6)混合均勻為一混合物後，加熱至完全溶解，並在40℃下放置10分鐘。然後加入50μL之洋菜酶溶液(2U/mL)至前述混合物中，於40℃下反應24小時。接著離心該反應液(15,000rpm，4℃，10分鐘)，再以0.22μm過濾膜進行過濾除菌，並儲存於-20℃下備用。將8μL洋菜酶水解產物、2μL新洋菜二糖溶液(10μg/μL)、2μL新洋菜四糖溶液(10μg/μL)及2μL新洋菜六糖溶液(10μg/μL)點樣於矽膠60 TLC片(Merck Millipore,USA)上。待樣品風乾後，將膠片傾斜放入含有展開液(50%正丁醇，25%醋酸，25%去離子水)之展開槽中。待展開完成後，將TLC片取出風乾，再將0.1M鄰苯二甲酸苯胺溶液(aniline phthalate solution)(Sigma-Aldrich,USA)噴灑至膠片上。經風乾後，利用加熱方式進行呈色，並計算樣品與標準品訊號之Rf值(retention factor value)。由Rf值判斷洋菜酶水解產物之種類。
實驗結果如第三圖中所示，六個獨立的實驗中顯示經本發明洋菜酶水解低熔點瓊脂醣後所得產物實質上皆為新洋菜四糖，且實質上不包含新洋菜二糖與新洋菜六糖。此實驗結果顯示，利用本發明洋菜酶可生產高純度的新洋菜四糖，對於新洋菜四糖的產業利用特別有用。
本發明洋菜酶於膠體中DNA回收之應用
將2.5μg之pUC19質體與200μL以0.5倍TAE緩衝液配製而成之1%低熔點瓊脂醣混合均勻後，置於4℃下使其凝固。將DNA瓊脂醣凝膠樣品置於70℃下加熱10分鐘，使瓊脂醣熔解，再將樣品放置於40℃下10分鐘。加入1U洋菜酶，於40℃下反應1小時後，進行離心(20,630×g，5分鐘，4℃)並收取上清液。然後加入肝醣與10M之醋酸銨，使肝醣與醋酸銨之最終濃度分別為1μg/μL與2.5M。之後，加入0.6倍上清液體積之異丙醇混合均勻，並放置於-20℃下30分鐘。於4℃下以20,630×g離心15分鐘，倒去上清液，再加入1mL 70%乙醇進行沉澱物之懸浮。將懸浮液於4℃下以20,630×g離心10分鐘並倒除上清液。將沈澱之DNA放置於室溫下乾燥，最後以適量之滅菌10mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)進行DNA之回溶。將回收DNA樣品與原始DNA樣品(pUC19質體)以0.7% 瓊脂醣膠體進行DNA電泳分析，並計算DNA回收率。
實驗結果如第四圖中所示，利用本發明洋菜酶進行膠體中核酸樣品回收之效率高達95%以上，代表本發明洋菜酶可用於膠體中DNA之回收。
金屬離子對本發明之洋菜酶的活性影響
將50μL 20mM之金屬鹽類溶液、750μL 0.27%(w/v)之瓊脂醣及100μL 0.5M磷酸緩衝溶液(pH 6)混合均勻後，加熱至完全溶解並於55℃下放置10分鐘。加入50μL經適當稀釋之洋菜酶溶液至酵素反應受質中，於55℃下反應10分鐘。後續之DNS呈色與酵素活性計算方法係如前揭實驗中所述。利用相對活性比較不同金屬鹽類對於本發明之重組洋菜酶水解能力的影響。實驗結果如下表二所示，可觀察到添加CuSO4、KCl、FeSO4、BaCl2、NaCl、SrCl2、CoCl2、MgSO4、MnCl2、CaCl2及AlCl3等金屬鹽類可使本發明之洋菜酶的活性明顯的增加。
<110> 財團法人農業科技研究院
<120> 洋菜酶、含其之組合物、及其應用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 883
<212> PRT
<213> Paenibacillus agarexedens
<400> 1
<210> 2
<211> 2652
<212> DNA
<213> Paenibacillus agarexdens
<400> 2
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
<210> 5
<211> 7899
<212> DNA
<213> Paenibacillus agarexdens
<400> 5

Claims (26)

  1. 一種β-洋菜酶，其包含如SEQ ID NO 01所示之序列。
  2. 如請求項第1項所述之β-洋菜酶，其係由如SEQ ID NO 02所示之序列所轉譯而得。
  3. 一種轉譯為β-洋菜酶的基因，其包含如SEQ ID NO 02所示之序列。
  4. 一種用於分解瓊脂醣之組合物，其包含：0.1至10U/mL如請求項第1或2項所述之β-洋菜酶；及1至2mM之鹽類；其中前述U/mL及mM之濃度單位係以前述組合物的總體積為基礎。
  5. 如請求項第4項所述之組合物，其進一步包含一50至200mM之緩衝液，其係以前述組合物的總體積為基礎；其中前述緩衝液為：檸檬酸緩衝液、或磷酸緩衝溶液；其中前述檸檬酸緩衝液的pH值為5至6，且其中前述磷酸緩衝溶液的pH值為6至7。
  6. 如請求項第4項所述之組合物，其中前述鹽類為：CuSO4、KCl、FeSO4、BaCl2、NaCl、SrCl2、CoCl2、MgSO4、MnCl2、CaCl2、AlCl3、或其組合。
  7. 如請求項第4項所述之組合物，其中前述β-洋菜酶係經由於一基因表現系統異源性地表現如SEQ ID NO 02所示之核苷酸序列而得。
  8. 如請求項第7項所述之組合物，其中前述基因表現系統為大腸桿菌表現系統。
  9. 如請求項第4項所述之組合物，其中前述β-洋菜酶係經由一含表現載體之大腸桿菌表現系統進行異源性地表現所製得；其中前述表現載體包含如SEQ ID NO 02所示之核苷酸序列。
  10. 如請求項第9項所述之組合物，其中前述表現載體具有如SEQ ID NO 05所示之核苷酸序列。
  11. 如請求項第9項所述之組合物，其中前述異源性地表現係於15至32℃下進行。
  12. 一種分解瓊脂醣的方法，其包含以下步驟： (A)提供一樣本，其包含一瓊脂醣；(B)使前述樣本與如請求項第1或2項所述之β-洋菜酶接觸，並取得一產物。
  13. 如請求項第12項所述之方法，其中前述產物中包含95重量百分比以上的新洋菜四糖，其中前述重量百分比係以前述產物的總重量為基礎。
  14. 如請求項第12項所述之方法，其中前述產物實質上不包含新洋菜二糖及/或新洋菜六糖。
  15. 如請求項第12項所述之方法，其中前述步驟(B)之反應係於40至45℃的溫度下進行。
  16. 如請求項第12項所述之方法，其中前述步驟(B)之反應係於pH值5至7下進行。
  17. 如請求項第15或16項所述之方法，其中前述步驟(B)之反應係進行1至24小時。
  18. 如請求項第12項所述之方法，其中前述樣本為：瓊脂醣、低熔點瓊脂醣、洋菜、海藻多醣粗萃物、或其組合。
  19. 如請求項第12項所述之方法，其中前述β-洋菜酶係經由於一基因表現系統異源性地表現如SEQ ID NO 02所示之核苷酸序列而得。
  20. 如請求項第19項所述之方法，其中前述基因表現系統為一大腸桿菌表現系統。
  21. 如請求項第12項所述之方法，其中前述β-洋菜酶係經由一含表現載體之大腸桿菌表現系統進行異源性地表現所製得；其中前述表現載體包含如SEQ ID NO 02所示之核苷酸序列。
  22. 如請求項第21項所述之方法，其中前述表現載體具有如SEQ ID NO 05所示之核苷酸序列。
  23. 如請求項第21項所述之方法，其中前述異源性地表現係於15至32℃下進行。
  24. 一種β-洋菜酶表現載體，其包含：一核苷酸序列，包含如SEQ ID NO 02所示之核苷酸序列；其中前述 SEQ ID NO 02轉譯為前述β-洋菜酶；及一調控元件。
  25. 如請求項第24項所述之表現載體，其中前述調控元件包含一啟動子與核糖體結合部位。
  26. 如請求項第24項所述之表現載體，其具有如SEQ ID NO 05所示之核苷酸序列。
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