CN104878029B - 一种β‑琼脂酶AgaW及编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种β‐琼脂酶AgaW及编码基因和应用。琼脂酶基因agaW编码全长2676bp，序列如SEQ ID NO.1所示。AgaW稳定性好，酶活力高，能降解琼脂糖，最终产物为新琼二糖和新琼四糖。

Description

一种β-琼脂酶AgaW及编码基因和应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种β‐琼脂酶AgaW及编码基因和应用。

技术背景

琼脂糖的化学构成是由β‐D‐半乳糖和3,6‐内醚‐α‐L‐半乳糖等组成的链状线性聚合物。根据琼脂酶作用方式的不同，琼脂酶可以分为两类：(1)α‐琼脂酶，裂解琼脂糖中的α‐1,3糖苷键，生成以3,6‐内醚‐α‐L‐半乳糖为还原性末端的琼寡糖系列；(2)β‐琼脂酶，裂解琼脂糖中的β‐1,4糖苷键，生成以β‐D‐半乳糖为还原性末端的新琼低聚糖系列。在分子生物学实验中，可利用琼胶酶从琼脂糖凝胶中回收DNA和RNA。新琼寡糖是琼脂糖经β‐琼脂酶水解后形成聚合度为2～20的海洋功能性低聚糖，主要由琼脂二糖的重复单位连接而成。琼脂糖粘度高，不溶于水，难以分解利用，而新琼寡糖则有很好的水溶性，易于人体吸收利用。近些年的研究表明新琼寡糖具有很多有意义的生理功能特性，如具有抗癌症，抗炎症，抗病毒，抗氧化，抗龋齿，预防糖尿病，增殖肠道益生菌和美白保湿等生理功能。这表明新琼寡糖在医用药物，保健品，功能饲料和化妆品等方面有着很好的应用前景。目前获得新琼寡糖的主要方法有酸解法和酶解法，而酸解法存在污染大和效率低等缺点，酶解法有着效率高，污染小和反应条件温和等优势，代替酸解法是未来的趋势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种琼脂酶，为工业获得琼脂酶，制备新琼寡糖提供方法。

本发明还要解决的技术问题是提供上述琼脂酶的编码基因和蛋白序列。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述琼脂酶的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一个琼脂酶基因agaW，核苷酸序列为SEQ ID NO.1，该基因全长为2676bp。

本发明所述琼脂酶基因agaW编码的琼脂酶AgaW，氨基酸序列为SEQ ID NO.2，共含有891个氨基酸。

一种重组质粒，它包含本发明所述的琼脂酶基因。

其中，所述的质粒优选pET29a(+)，进一步优选琼脂酶基因片段与酶切好的pET29a(+)进行酶联，获得含琼脂酶基因的pET29a(+)重组质粒。

一种重组微生物，包含本发明所述的琼脂酶基因agaW，优选包含本发明所述的重组质粒。

其中，所述的微生物优选Escherichia coli BL21(DE3)。

所述的重组微生物更进一步优选酶联好的含琼脂酶基因的pET29a(+)重组质粒转化宿主表达菌Escherichia coli BL21(DE3)，获得重组微生物E.coli BL21(DE3)。

本发明所述的琼脂酶的制备方法，对所述的重组微生物进行IPTG诱导表达，对菌体进行超声破碎，离心，收集上清，上清经镍离子亲和层析柱进行纯化，得琼脂酶AgaW。

上述β‐琼脂酶及其编码基因在琼脂水解和获得新琼寡糖中的应用。

有益效果：

1.本发明克隆到了一种新的该琼脂酶基因及其编码的琼脂酶，全长为2676bp，编码819个氨基酸。

2.本发明的β‐琼脂酶降解琼脂糖的最终水解产物为新琼二糖和新琼四糖，中间产物有新琼6糖，具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1：琼脂酶AgaW蛋白电泳图谱

图2：琼脂酶AgaW最适温度和温度稳定性分析图，实心折线图为最适温度分析，空心折线图为温度稳定性分析。

图3：琼脂酶AgaW最适pH和pH稳定性分析图，实心折线图为最适pH分析，空心折线图为pH稳定性分析。

图4：琼脂酶AgaW水解产物薄层层析分析图

图5：琼脂酶AgaW水解产物质谱分析图，A图为新琼二糖，B图为新琼四糖，C图为新琼六糖。

图6：琼脂酶AgaW作用方式核磁共振分析图

表1：不同试剂对琼脂酶AgaW的酶活影响

生物材料保藏信息

琼脂降解菌LGH，分类命名为柯恩氏菌Cohnella sp.，于2014年11月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC NO.10018。

具体实施方式

实施例1：琼脂酶基因的克隆

1.1细菌基因组总DNA的提取

采用高盐法提取Cohnella sp.LGH(CGMCC NO.10018)的基因组DNA。

1.2pUC118(BamH I)购买于宝生物工程(大连)有限公司。

1.3Cohnella sp.LGH的基因组DNA采用限制性内切酶Sau3A I酶切。

1.4DNA回收

酶切后的基因组DNA通过电泳(TAE缓冲液)进行纯化，采用DNA片段回收试剂盒(购自Axygen公司)进行回收，回收的DNA溶于l0mmol/L的Tris‐HCl(pH8.0)中，置于‐20℃保藏。

1.5酶连体系如下：

16℃温育12小时。

1.6转化及筛选

取10μl酶连产物转化200μl大肠杆菌DH5α感受态细胞(TaKaRa)，具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P23。涂布含有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，培养24小时。挑取能使平板产生凹陷的单菌落并用卢戈氏碘液进行验证，选取具有透明水解圈的单菌落，即为阳性转化子。

1.7基因核苷酸序列测定

将阳性转化子送交思普金测序公司(南京)进行核苷酸序列测定，琼脂酶基因agaW，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，琼脂酶AgaW，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例2：琼脂酶基因agaW在E.coli BL21(DE3)(pET29a(+))中的高效表达。

2.1琼脂酶基因的PCR扩增

正向引物F1：5’‐CGGGGTACCGCCACCCCGTTCCCTACTTTGAACTTC‐3’(SEQ ID NO.3)

反向引物R1：5’‐CCCAAGCTTCTTTGATATTAGCAAATGATCCATTATAAA‐3’(SEQ ID NO.4)

从Cohnella sp.LGH的基因组DNA中扩增获得琼脂酶基因片段。PCR扩增体系：

PCR扩增程序

a.95℃预变性5min

b.98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环

c.72℃5min，冷却至室温

2.2PCR产物双酶切

酶切体系：

在37℃水浴中，反应4小时以上

酶切产物进行0.75％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

2.3pET29a(+)用Kpn I和Hind III双酶切(参考上述反应条件)。

2.4酶连：酶切后的PCR片段与酶切后的质粒进行酶连(参考1.5)

2.5转化

酶连好的含琼脂酶基因的pET29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)，获得重组微生物BL21(DE3)。Kan 100mg/L、IPTG24mg/L的LB平板。挑取能使平板凹陷的单菌落并用卢戈氏碘液进行验证，选取具有透明水解圈的单菌落，即为阳性转化子BL21(AgaW)。

2.6AgaW的表达、纯化和功能验证

BL21(AgaW)在LB培养基中培养至OD600nm为0.6，加IPTG至浓度1mM，30℃培养4个小时。100ml菌液离心，用10ml(50mM,pH7.0)PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎，离心，收集上清，用镍离子亲和层析柱对AgaW进行了纯化，得琼脂酶AgaW，AgaW电泳图谱见图1，其条带大小和理论预测的大小(96.06kDa)相一致。

实施例3：重组琼脂酶AgaW的酶活性检测和酶学性质

3.1降解酶活验证

将2.6中纯化的琼脂酶取10μl与0.5％琼脂糖(溶pH 7.0PBS缓冲液)390μl混匀，50℃反应10分钟，加入400μl DNS试剂(3，5‐二硝基水杨酸3.15g，100mL 0.2g/mL的氢氧化钠溶液，四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g，加蒸馏水至1L)终止反应，沸水浴10min，于OD540nm检测，具有很好的酶活，可达250.4U。

3.2酶学性质测定

最适温度：选取30℃,35℃,40℃,45℃,50℃,55℃,60℃,65℃,70℃进行酶促反应，体系参考3.1，测定AgaW最适温度为50℃，见图2。

温度稳定性：将酶在30℃,35℃,40℃,45℃,50℃,55℃,60℃,65℃,70℃孵育1h后进行酶促反应，体系参考3.1，其中30‐50℃保留超过95％的活性，60℃以下还能保持超过43％的活性，见图2。

最适pH：选取pH 3‐12的缓冲液进行酶促反应，体系参考3.1，测定AgaW最适pH为7，见图3。

pH稳定性：将酶在pH 3‐12的缓冲液中孵育1h后进行酶促反应，体系参考3.1，其中pH 5‐11中能保留超过70％的活性，见图3。

不同试剂对酶活的影响：酶促反应体系参考3.1，酶促反应体系中加入不同的试剂。浓度为10mmol的Cu²⁺，Zn²⁺,Fe³⁺和SDS对酶活有明显抑制作用，浓度为10mmol的Mn²⁺,Ba^{2 +},和EDTA对酶活有较弱的抑制作用，浓度为10mmol的Ca²⁺,Na⁺,K⁺,Mg²⁺,和DTT对酶活有促进作用，见表1。

表1

酶动力学参数：Km＝3.43mg/ml；Vmax＝387.11U/mg。

实施例4：重组琼脂酶AgaW的降解产物鉴定和制备

酶反应体系参考3.1，反应不同时间1min，2min，5min，10min，30min，60min，120min，1440min，沸水浴终止反应，12000rpm离心15min，取上清20μl点入预先105℃烘干的薄层层析G板，标准样品为新琼二糖，新琼四糖和新琼六糖。吹干后置于层析缸中，展开剂选取正丁醇：冰乙酸：水＝1:2:1(体积比)。层析结束后自然晾干，滴加显色剂(10％的硫酸溶于乙醇)，105℃反应10min。结果表明重组琼脂酶AgaW水解琼脂糖的终产物为新琼二糖和新琼四糖，有较高量的中间产物新琼六糖，见图4。

根据上述结果，同一块薄层层析板上点多个样品，展层结束后，遮住层析板，只留下一个样品滴加上述显色剂进行显色。显色后对照显色部分的条带，将未显色部位的对应条带刮下，加入一定体积的去离子水浸泡，12000rpm离心15min，取上清冻干后即作为做质谱的样品。质谱(Agilent 6410B串联质谱)分析结果表明重组琼脂酶AgaW的终产物为新琼二糖和新琼四糖，中间产物有新琼六糖，见图5。

实施例5：重组酶的作用方式

酶反应体系为1ml的酶液与40ml 0.5％的琼脂糖(溶于pH 7.0PBS缓冲液)混匀，反应24h后14000rpm离心20分钟，取上清冻干后溶于氘代水中，使用核磁共振波谱仪(400MHz,DRX‐400；Bruker)测定¹³C谱。

结果表明在92.360ppm和96.182ppm信号而在90.8ppm无信号，见图6，说明该琼脂酶的作用方式为断裂β‐1,4糖苷键，AgaW为β‐琼脂酶。

Claims (10)

1.一个琼脂酶基因agaW，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述琼脂酶基因agaW编码的琼脂酶，其特征在于氨基酸序列为SEQ IDNO.2。

3.一种重组质粒，其特征在于该重组质粒包含权利要求1所述的琼脂酶基因agaW。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述的质粒为pET29a(+)。

5.一种重组微生物，其特征在于，包含权利要求1所述的琼脂酶基因agaW。

6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于包含权利要求3或4所述的重组质粒。

7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述的微生物为Escherichia coliBL21(DE3)。

8.权利要求2所述的琼脂酶的制备方法，其特征在于对权利要求5～7中任一项所述的重组微生物进行IPTG诱导表达，对菌体进行超声破碎，离心，收集上清，上清经镍离子亲和层析柱进行纯化，得琼脂酶AgaW。

9.根据权利要求1所述的琼脂酶基因agaW在琼脂水解和获得新琼寡糖中的应用。

10.根据权利要求2所述的琼脂酶AgaW在琼脂水解和获得新琼寡糖中的应用。