CN105274081A - 一种d-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源表达及其应用 - Google Patents

一种d-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源表达及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程领域，具体公开一种优质D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源表达及其应用。所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的氨基酸序列如SEQNO.1所示。本发明通过酶活性测定和底物特异性的分析，所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶底物特异性专一强，所研究底物中针对性的将D-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)以及β键连接的D-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)脱乙酰化生成D-氨基葡萄糖(GlcN)或者β键连接的氨基葡萄糖(GlcN)。本发明利用基因工程手段克隆表达了重组D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶，实现了D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的大量表达，获得了优质的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶。

Description

一种D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源表达及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，一种优质D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源表达，酶活性条件优化及其应用。
背景技术
氨基葡萄糖(GlcN)又称葡萄糖胺、葡糖胺或氨基葡糖，在体内具有重要的生理意义：参与肝肾解毒，发挥抗炎、护肝、抗反应性、抗低氧的作用，刺激婴儿肠道中双歧杆菌的增生等；在食品，农业领域及化妆品领域中同样都有不同程度的应用。GlcN的用途如此广泛，而目前国内相关产品较少。
甲壳素(chitin)又叫几丁质，壳多糖广泛分布于虾壳，蟹壳，昆虫等的甲壳中，其主要组成单位是N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，经强酸水解可得到氨基葡萄糖。因此，工业上通常采用强酸水解的方法生产氨基葡萄糖盐酸盐。但是传统的生产工艺须消耗大量的酸碱，腐蚀设备，造成环境的污染，且产率低，产物不纯，新方法条件要求高。这些在某种程度上限制了氨基葡萄糖及其衍生物的广泛应用。利用基因工程技术构建生产氨基葡萄糖的重组大肠杆菌，然后通过发酵法产氨基葡萄糖是近期发展的另一种方法，目前，发酵法产氨基葡萄糖的研究集中在霉菌发酵与重组大肠杆菌研究上，但是该方法需要投入大量精力和资金到基因工程菌的研究上，没有形成规模化。
因此，一种更加温和，环境友好，产物纯度高生产氨基多糖的方法非常迫切。据报道甲壳素酶可以把甲壳素降解为大量D-乙酰氨基葡萄糖单糖分子，研究证明甲壳素降解率高达92.6％；然后利用D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶使D-乙酰氨基葡萄糖脱去乙酰基得到氨基葡萄糖，目前文献报道中一些脱乙酰基酶可以作用于GlcNAc，但是这些酶的主要活性不是针对D-乙酰氨基葡萄糖，或者这些酶的活性或产率不高。我们同样利用已经非常成熟的基因工程技术，通过基因搜索，克隆，重组表达和生化特性研究等获得产物单一，且转化率达到百分之百的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶。D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的反应式如下：
但是从甲壳素生成D-乙酰氨基葡萄糖，再生成氨基葡萄糖的仍处于研究阶段应用，需要进一步的实际试验研究，为实现该方法的规模化生产，是我们今后要努力的方向。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种优质的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶，实现D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源大量表达，相比于化学法生产氨基葡萄糖，酶法生产将具有极大的工业化潜力。
本发明的另一目的在于提供一种D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的编码基因。
本发明的又一目的在于提供D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的编码基因，具有下述核苷酸序列之一：
(1)序列表中的SEQIDNO.2的核苷酸序列；
(2)编码序列表中SEQIDNO.1氨基酸序列的多核苷酸。
含有上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系和转基因重组菌。
所述的重组表达载体为将权利要求2或3所述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的重组表达载体；所述的大肠杆菌表达载体优选为大肠杆菌质粒pET28a(+)。
上述的重组表达载体的制备方法为：采用权利要求2或3所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的核苷酸序列经EcoRI和XhoI双酶切后与EcoRI和XhoI双酶切的pET28a(+)载体连接，得到重组表达载体pET28a(+)-N-acetylglucosaminedeacetylase。
所述的转基因重组菌是将权利要求5或6所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的转基因重组菌；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源表达，所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的核苷酸序列编码，实现在大肠杆菌中异源可溶性表达。
上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的制备方法，培养含有D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的转基因细胞系或培养包含D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的重组表达载体转化的转基因重组菌，诱导其表达，收获表达产物，得到粗酶，通过Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和柱纯化得到纯酶形式的目的蛋白。
上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶在水解D-乙酰氨基葡萄糖使其脱乙酰基制备氨基葡萄糖中的应用。
上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶在水解β-键连接D-乙酰氨基葡萄糖的物质使其脱乙酰基得到β-键连接的氨基葡萄糖中的应用。
所述β-键连接D-乙酰氨基葡萄糖的物质优选为PNP-β-GlcNAc和X-β-GlcNAc。
一种制备氨基葡萄糖或β-键连接的氨基葡萄糖的方法，是用上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶水解D-乙酰氨基葡萄糖或β-键连接D-乙酰氨基葡萄糖的物质使其脱乙酰基得到氨基葡萄糖或β-键连接的氨基葡萄糖。
所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶水解D-乙酰氨基葡萄糖或β-键连接D-乙酰氨基葡萄糖的物质的反应条件为：反应温度为4～60℃，反应pH为7.0～10.5，反应底物的浓度为20～200mM；优选的：反应温度为42℃，反应pH为9.0，反应底物浓度为95.78mM，此时，反应速率达到最大。
本发明涉及从一种海洋圆杆菌(Cyclobacteriummarinum)中克隆的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶基因。所述编码序列如SEQNO.2所示。本发明还涉及包含所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码序列的重组表达载体，D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶基因的核苷酸序列经EcoRI和XhoI双酶切后与EcoRI和XhoI双酶切的pET28a(+)载体连接，得到大肠重组表达载体pET28a(+)-N-acetylglucosaminedeacetylase。本发明还制备包含本发明D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的转基因重组菌，将重组好的表达载体pET28a(+)-N-acetylglucosaminedeacetylase转化到大肠杆菌BL21(DE3)，构成表达D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的转基因重组菌。
将转基因重组菌通过正常的振荡培养，用IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白，通过超声裂解细胞，收获表达产物，表达产物利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和纯化。对得到的纯化形式的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的活性条件进行优化，酶的活性受如底物特异性，pH，温度和金属离子等的影响。本发明中也对D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的活性进行这些方面的优化。
本发明还对D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的应用进行简单涉及，利用核磁共振技术检测D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶在没有任何反应缓冲液和添加物的状态下的转化效率。其转化结果如图5所示。
本发明的有益效果：
本技术方案可以通过生物工程技术得到一种优质的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶，实现D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源大量表达，底物特异性强，反应效率高，相比于化学法生产氨基葡萄糖，酶法生产将更具有极大的工业化潜力。
附图说明
图1为海洋圆杆菌(Cyclobacteriummarinum)来源的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因在质粒pET28a(+)上的结构图。
图2为大肠杆菌表达海洋圆杆菌(Cyclobacteriummarinum)来源的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的SDS-PAGE。
图3为大肠杆菌表达海洋圆杆菌(Cyclobacteriummarinum)来源的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的底物特异性检测。其中，A.游离糖检测；B.修饰的D-乙酰氨基葡萄糖/半乳糖检测。
图4为大肠杆菌表达海洋圆杆菌(Cyclobacteriummarinum)来源的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的优化结果。
图5为基于核磁共振的大肠杆菌表达海洋圆杆菌(Cyclobacteriummarinum)来源的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶转化底物的能力。
具体实施方式
结合以下具体实施例，对本发明作进一步详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实例。
实验材料和试剂
1、菌株和载体：
常规菌种海洋圆杆菌Cyclobacteriummarinum购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号：DSM745。大肠杆菌Top10、BL21(DE3)级表达载体pET28a(+)购自Novagen公司。
2、酶类及其他生化试剂：
限制性内切酶、DNAMarker、ProteinMarker购自TaKaRa公司；AxyPrepDNA胶回收试剂盒和AxyPrep质粒提取试剂盒为Axygen公司产品。其他常规试剂为上海生工或南京寿德公司。
3、本发明中所使用的生物化学技术均为本领域中的常规技术：
在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的部分进行，包括：[美]J.沙姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)；朱检等，生物化学实验[M]，本发明中所有相关的酶、酶活力或酶活性均指D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶。
实施例1D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶基因的获得：
(1)用移液枪蘸取一点Cyclobacteriummarinum1.5mL离心管，加入500μl海洋圆杆菌DNA提取液(50mMTris-base，50mM氯化钠，500mMEDTA，110％SDS，1％Triton-X100和0.2mU/μl蛋白酶K，pH8.0)，于55℃温浴3小时后90℃高温灭活蛋白酶K。置-20℃保存备用。
(2)PCR获取目的基因
根据GeneBank中D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的基因设计引物，引物两端带有限制性内切酶EcoRI和XhoI碱基序列以及保护性碱基。有南京金斯瑞公司合成：
EcoRIF:5’CGGAATTCATGAATGCAGCACAAAAATTAG3’
XhoIR:5’CCGCTCGAGTTAGTCTTTATATATTTTTTCCCT3’
PCR程序为：95℃10秒，55℃15秒，72℃1分钟，共35个循环。PCR反应结束后，用1.2％的琼脂糖凝胶跑电泳，goldview染色后在蓝光板下检测结果并根据试剂盒说明书回收目标条带。
将回收的目的基因和pET28a(+)分别进行双酶切。pET28a(+)进行切胶回收，然后将目的基因和载体进行常规连接反应。
将连接产物转化到大肠杆菌Top10，复苏后的细胞均匀涂布于含有卡纳抗生素的LB平板，过夜培养。从培养基上挑取单菌落利用PCR方法进一步确定目的基因时候导入载体。将检测正确的单克隆菌培养，送到南京金斯瑞公司进行DNA序列测定，并在NCBI数据库进行比对分析如SEQNO.2。测序正确即得到重组载体得到重组载体pET28a(+)-N-acetylglucosaminedeacetylase。如图1所示。
实施例2D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因在BL(DE21)中的表达
将实施例1中得到的带有重组质粒的大肠杆菌Top10细胞中的质粒抽提出来，转化到制备好的感受态细胞BL21(DE3)中。挑取重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)到5ml含卡纳抗生素的LB液体培养基中37℃，250rpm振荡过夜培养。按1％接种量(v/v)转接到新鲜LB(400ml)培养液中，37℃，250rpm振荡培养至OD600≈0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度1.0mM，25℃，250rpm振荡培养3小时。
实施例3D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的纯化
将实施例2中表达的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的菌液4℃，4000rpm离心20min收集菌体，向菌体沉淀中加入10ml裂解缓冲液(pH7.550mM氯化钠；50mMTris-HCl；1％Triton)，100μlPMSF，使菌体重悬于裂解液中，进行超声波破碎仪中破碎细胞20min。将破碎后的细胞裂解液4℃，4000rpm离心20min收集上清。
由于设计的重组表达载体pET28a(+)-N-acetylglucosaminedeacetylase表达产物N端带有6个连续的组氨酸，可以通过亲和层析柱(Ni-NTA琼脂糖凝胶)亲和纯化。首先用平衡液平衡柱子(pH8.0100mM氯化钠50mMTris-HCl)，将粗酶液负载上柱；采用10倍体积冲洗液(pH8.0100mM氯化钠50mMTris-HCl)进行洗脱除去杂蛋白，然后用一定量的洗脱液(pH8.050mM氯化钠50mMTris-HCl100mM咪唑)收集目的蛋白，每管大约1ml。保存含有目的蛋白样品管，用于后续实验。将诱导前，诱导后，上清以及纯化后的蛋白做SDS-PAGE蛋白电泳。如图2所示。
实施例4将实施例3中得到的纯酶进行底物特异性分析
本实施例将实施例3中得到的纯酶进行底物特异性分析，选取的不同乙酰氨基糖等游离糖如壳聚二糖(Chitobiose)，乙酰氨基葡萄糖，乙酰氨基半乳糖(GalNAc)，乙酰氨基岩藻糖(ManNAc)，乙酰氨基半乳糖-6-磷酸(GalNAc)-6-P和乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸为底物。反应体系如下：
不加酶的反应作为空白对照，将样品置于37℃，过夜反应。
由于生产的产物氨基糖不能直接通过荧光或者紫外检测到，但是，利用含有紫外或荧光基团的衍生试剂如邻氨基苯甲酸(2-AA)对氨基糖进行修饰，使之能够用高灵敏度的分析检测仪器如高效液相色谱(HPLC)分析。因此，本实施例中通过2-AA标记GlcN使用HPLC进行荧光检测，而达到分析D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的底物特异性的目的。本实施例中使用的HPLC是岛津LCMS-2020型超高效液相色谱质谱联用仪(Shimadzu，Tokyo，Japan)。该系统配备有SIL-30AC自动进样器、LC-30AD四元低压梯度泵、DGU-20A5R真空脱气机、RF-20Axs荧光检测器和LCMS-2020单极四级杆质谱。
将反应结束的样品95℃加热终止反应，然后将样品旋干，将标准的2-AA试剂加到已干燥的样品中，同时标记氨基糖作为阳性标准品，然后置于80℃反应1小时，然后进样。
液相色谱分离条件
色谱柱：反相C18色谱柱Hyperclone5μmODS120，250×4.60mm(美国phenomenex公司)
流动相A：50mM甲酸铵(pH4.5)缓冲液；流动相B：乙腈；
流速：1.5mL/min；
进液量：5μL；
检测波长：Ex330nm，Em390nm；
洗脱方式：梯度洗脱，初始梯度比例10％(B相)如图3A为游离糖检测；
在检测游离糖的基础上，本发明中又进一步对修饰后的氨基糖做活性鉴定。本发明中选取4-硝基苯-N-乙酰-α-D-氨基葡萄糖苷(PNP-α-GlcNAc)，4-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(PNP-β-GlcNAc)，4-硝基苯-N-乙酰-α-D-氨基半乳糖苷(PNP-α-GalNAc)，4-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷(PNP-β-GalNAc)，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰-beta-D-氨基葡萄糖苷(X-β-GlcNAc)为检测底物，对D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的活性做进一步探讨。反应体系如上。不加酶的反应作为阴性对照对照，将样品置于37℃，过夜反应。
4-硝基苯-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷可以通过UV检测到，产物氨基糖又可以通过茚三酮显色，因此，检测结果可以通过TLC简单清晰的检测到。所用延展剂为：乙酸乙酯/甲醇/无水乙醇＝7/2/1。结果如图3B。
实施例5D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的最佳反应条件及反应动力学测定
利用实施例3中纯化得到的酶做该酶的生化特性测定，包括：最适反应pH、最适反应温度、金属离子影响和Km值等方面。反应体系如下表：
上述体系应不同反应要求会作适当改变。反应结束后通过加入等体积的氯仿除去反应体系中的酶并达到终止的目的。
为了测定最适酶反应的pH，在标准反应体系基础上，采用不同的pH的缓冲液，具体包括：柠檬酸钠缓冲液(pH5.0、5.5、6.0和6.5)和磷酸钠缓冲液(pH7.5、8.0、8.5，9.0、9.5、10.0和10.5)。反应温度采用37℃，反应时间5分钟。
为了测定最适酶反应的温度，在标准反应体系基础上，以磷酸钠pH8.0溶液为缓冲液，不同的反应温度为：4、16、25、37、42、52、60和70℃，反应时间5分钟。
为了检测该酶的活性是否受金属离子的影响，在标准反应体系基础上，每个样品额外添加终浓度为2mM的金属离子溶液，金属离子种类包括：Ni2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2、Cu2+，添加2mMEDTA和不加任何离子或EDTA的样品为对照样品，反应缓冲液是磷酸钠pH8.0溶液，反应温度为37℃，反应时间5分钟。如图4。
为了检测该酶的反应动力常数Km，最大反应速度Vmax以及Kcat等反应参数，在标准反应体系基础上，即以磷酸钠pH8.0溶液为缓冲液，反应温度为37℃，反应时间5分钟的条件下，设置含有不同浓度的底物(GlcNAc)的酶反应，GlcNAc浓度分别为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1，2，5，10，20，50，100和200mM，Km和最大反应速度的数据最终由Origin9.0软件中非线性回归模型处理处理获得。
利用高效液相色谱仪检测2-AA标记的GlcN的反应步骤复杂，耗时长，而邻苯二醛(OPA)衍生法可以通过酶标仪快速检测GlcN的浓度。因此本实施例中，选用酶标仪作为检测上述参数。首先配制所需OPA检测试剂(5mgofOPA100μl乙醇，5μlβ-巯基乙醇和10ml50mMpH10.5的碳酸钠缓冲液)和标准曲线所需不同浓度的GlcN(0，10，25，50，100，200，400，800，1600μM)，通过酶标仪绘制标准曲线；然后利用酶标仪检测产物GlcN，每100μlOPA中加10μl的去除酶后的反应样品，读取反应1.5分钟处的吸光度。最后根据绘制的标准曲线计算产物的浓度。

Claims (13)

1.一种D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的编码基因，其特征在于：该编码基因具有下述核苷酸序列之一：
(1)序列表中的SEQIDNO.2的核苷酸序列；
(2)编码序列表中SEQIDNO.1氨基酸序列的多核苷酸。
3.含有权利要求2所述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系和转基因重组菌。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体为将权利要求2或3所述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的重组表达载体；所述的大肠杆菌表达载体优选为大肠杆菌质粒pET28a(+)。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的制备方法为：采用权利要求2或3所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的核苷酸序列经EcoRI和XhoI双酶切后与EcoRI和XhoI双酶切的pET28a(+)载体连接，得到重组表达载体pET28a(+)-N-acetylglucosaminedeacetylase。
6.根据权利要求3所述的转基因重组菌，其特征在于：所述的转基因重组菌是将权利要求5或6所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的转基因重组菌；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.权利要求1～6任意一项中所述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源表达，其特征在于：所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的核苷酸序列编码，实现在大肠杆菌中异源可溶性表达。
8.一种如权利要求1所述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的制备方法，其特征在于：培养含有D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的转基因细胞系或培养包含D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的重组表达载体转化的转基因重组菌，诱导其表达，收获表达产物，得到粗酶，进行纯化得到纯酶形式的目的蛋白。
9.权利要求1所述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶在水解D-乙酰氨基葡萄糖使其脱乙酰基制备氨基葡萄糖中的应用。
10.权利要求1所述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶在水解β-键连接D-乙酰氨基葡萄糖的物质使其脱乙酰基得到β-键连接的氨基葡萄糖中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于所述β-键连接D-乙酰氨基葡萄糖的物质为PNP-β-GlcNAc和X-β-GlcNAc。
12.一种制备氨基葡萄糖或β-键连接的氨基葡萄糖的方法，其特征在于是用权利要求1所述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶水解D-乙酰氨基葡萄糖或β-键连接D-乙酰氨基葡萄糖的物质使其脱乙酰基得到氨基葡萄糖或β-键连接的氨基葡萄糖。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶水解D-乙酰氨基葡萄糖或β-键连接D-乙酰氨基葡萄糖的物质的反应条件为：反应温度为4～60℃，反应pH为7.0～10.5，反应底物的浓度为20～200mM。
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