CN103146629A - 携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的菌株、构建方法及应用 - Google Patents
携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的菌株、构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株为地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)]，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2011345。本发明的目的在于提供一种能高产杆菌肽的携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的菌株、构建方法及应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌工程菌株。
背景技术
杆菌肽为淡黄色或类白色粉末，无嗅，味苦，是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌。杆菌肽通过组氨酸的咪唑基和噻唑环，与多种金属离子如Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+和Mn2+等生成络合物，其中以锌盐形式存在的杆菌肽，抑菌活性得到一定程度的增强，且稳定性最好。杆菌肽拥有在肠道内几乎不吸收，排泄迅速，体内不残留等优点，因此被广泛添加于饲料中。
杆菌肽的作用机理是：一、其络合物能吸附在细菌的细胞壁上，阻碍脱磷酸化作用，影响磷脂的运转和向胞壁支架输送粘肽复合物，导致细胞壁合成受到抑制，细胞逐渐死亡；二、结合敏感菌细胞膜脂蛋白中的游离磷酸盐，导致细胞膜损伤，通透性增加，各种离子、氨基酸、嘧啶、嘌呤等外流；三、干扰敏感菌细胞内原浆蛋白的合成。
目前，杆菌肽主要生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其通过微生物发酵法生产，微生物发酵过程中，氧气对好氧微生物的生长繁殖和进行能量物质代谢尤为重要，但微生物只能利用溶解在培养基中的氧，从而使氧气供应成为限制发酵产量的一大瓶颈。
透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)是在革兰氏阴性菌透明颤菌中发现的一种氧调节蛋白，透明颤菌在限氧条件下大量诱导合成该蛋白，使其在限氧条件下正常生长。VHb能特异性结合O2，并且高速释放，从而促进微生物细胞内氧的传递，提高氧的利用率，这种特性使之能够充分利用有限空间中的氧气。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能高产杆菌肽的携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的菌株、构建方法及应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株为地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)]，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2011345，保藏日期为2011年10月12日。
一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：质粒pDG1730-vgb+经BamH I和Hind III双酶切得到的1246bp vgb片段，该片段含有芽孢杆菌编码乙酰高丝氨酸内酯(AHL)自身诱导物(AI)合成酶luxS基因的启动子PluxS和vgb ORF；质粒pHY300PLK经BamH I和Hind III双酶切得到4870bp线性质粒片段；1246bp vgb片段与4870bp线性质粒片段经DNA连接酶连接作用，得到表达载体pHY300-vgb；将表达载体pHY300-vgb转入大肠杆菌进行保存，其后通过电转化转入原始菌株——地衣芽孢杆菌(B.licheniformis DW2)，以四环素抗性为筛选标记，筛选得到地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)]。
一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的应用，其特征在于：它在杆菌肽发酵中的应用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：在地衣芽孢杆菌的表达载体pHY300PLK中连接上透明颤菌血红蛋白基因，构建了一种能在低氧环境下诱导表达透明颤菌血红蛋白，提高宿主菌在低氧发酵环境下的摄氧能力，改善细胞在低氧环境下的生理状态，从而改善了含此基因的宿主菌在发酵中的供氧问题。地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)]单位菌体杆菌肽产量较原始菌株B.licheniformisDW2提高了9.4805%。
附图说明
图1是血红蛋白基因重组载体构建方法示意图。
图2为pHY300-vgb的阳性克隆的筛选鉴定图。
图3是转化子质粒VHb基因的PCR鉴定图。
图4是CO制备装置图。
图5是Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)、Bacillus licheniformis（pHY300）和Bacillus licheniformis DW2的CO差光光谱图。
图6是3L罐发酵过程中生物量的变化曲线图。
图7是3L罐发酵过程中杆菌肽产量的变化曲线图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的菌株，其特征在于：所述菌株为地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)]，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2011345，保藏日期为2011年10月12日。
如图1，一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：质粒pDG1730-vgb+经BamH I和Hind III双酶切得到的1246bp vgb片段，该片段含有芽孢杆菌编码乙酰高丝氨酸内酯(AHL)自身诱导物(AI)合成酶luxS基因的启动子PluxS和vgb ORF；质粒pHY300PLK经BamH I和Hind III双酶切得到4870bp线性质粒片段；1246bp vgb片段与4870bp线性质粒片段经DNA连接酶连接作用，得到表达载体pHY300-vgb；将表达载体pHY300-vgb转入大肠杆菌进行保存，其后通过电转化转入原始菌株——地衣芽孢杆菌(B.licheniformis DW2)，以四环素抗性为筛选标记，筛选得到地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)]。
所述原始菌株为地衣芽孢杆菌（B.licheniformi DW2），该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2011344，保藏日期为2011年10月12日。
携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的构建方法的具体实施例，如下：
（1）质粒pDG1730-vgb+的具体构建方法
①质粒pEG491-vgb+经BamHI和HindIII双酶切得到1246bp血红蛋白基因vgb片段；
②质粒pDG780经HindIII酶切得到1360bp卡那霉素抗性基因(Kanr)片断；
③两片段插入质粒pDG1730中对应的多克隆位点上，得到质粒pDG1730-vgb+。
（2）质粒pDG1730-vgb+的双酶切
②酶切条件：温度30℃，时间8小时。
BamH I、Hind III为DNA限制性内切酶，10×K buffer为配套的限制性内切酶缓冲液。BamH I、Hind III以及10×K buffer均购自宝生物工程（大连）有限公司。
经过上述双酶切操作并进行产物回收，以获得1246bp vgb片段。产物回收可采用上海赛百盛基因技术有限公司生产的PCR产物纯化及胶回收试剂盒（树脂型）进行回收。
（3）质粒pHY300PLK的双酶切
②酶切条件：温度30℃，时间8小时。
质粒pHY300PLK质粒为购自宝生物工程（大连）有限公司的商业质粒。
经过上述双酶切操作并进行产物回收，以获得4870bp线性质粒片段。产物回收可采用上海赛百盛基因技术有限公司生产的PCR产物纯化及胶回收试剂盒（树脂型）进行回收。
（4）DNA连接
②连接条件：温度16℃，时间12小时。
T4DNA ligase为商用的DNA连接酶，10×T4DNA ligase buffer为配套的连接酶缓冲液。T4DNA ligase以及10×T4DNA ligase buffer均购自宝生物工程（大连）有限公司。
（5）大肠杆菌感受态的制备
①大肠杆菌菌种从甘油管中以体积比1%接种于5ml LB培养基，并于37℃，250r/min振荡培养过夜；
②将步骤①获得的菌液以体积比1%接种于50mL LB培养基，37℃振荡培养2-4h；
③将步骤②获得的菌液置冰上10min，使菌液冷却，倒入50mL离心管中，4℃5000r/min离心3min，弃上清；
④用20mL预冷的CaCl2(0.1mol/L)洗涤步骤③获得的沉淀，4℃5000r/min离心3min，弃上清；
⑤用1.5mL预冷的CaCl2(0.1mol/L)重悬步骤④获得的沉淀，并分装于无菌1.5mL离心管中，置-70℃保存备用。
（6）大肠杆菌的转化
①取100-200μL步骤（5）获得的大肠杆菌感受态细胞与步骤（4）获得的DNA连接产物于离心管中混合，冰上吸附15min；
②经步骤①处理后，将离心管放到42℃循环水浴中热激90s；
③经步骤②处理后，快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却5min；
④经步骤③处理后，每支离心管加800μL LB培养基，37℃，150r/min培养45min；
⑤取200μL涂平板，用无菌的涂布棒将经步骤④获得的菌液均匀涂满整个涂平板表面；
⑥经步骤⑤处理的涂平板于37℃培养，正置30min后倒置培养12-16h，可出现菌落。
⑦经步骤⑥处理后，将长出的菌落挑出于平板上划线，置于37℃培养12h。
⑧经步骤⑦处理后，将长出的菌体挑出，接种于5ml LB液体培养基中，加入5ul50mg/ml的氨苄青霉素溶液，37℃振荡培养12h。
（7）pHY300-vgb的提取和阳性克隆的筛选
①5mL经步骤（6）大肠杆菌的转化处理后获得的菌液，离心收集，用STE洗涤一次，加入100μL Solution I溶液重悬菌体，置于冰上5min；
②经步骤①处理后，加入200μL Solution II，快速颠转混匀，置于冰上5min；
③经步骤②处理后，加入150μL Solution III混匀，置于冰上5min；
④经步骤③处理后，12000r/min离心5min，取上清；
⑤往步骤④获得的上清液中加入500μL苯酚/氯仿震荡，12000r/min离心5min，取上清；
⑥往步骤⑤获得的上清液中加入2倍无水乙醇-20℃沉淀2h，12000r/min离心5min，弃上清；
⑦经步骤⑥处理获得的沉淀用70%乙醇洗一遍，去上清，干燥后溶于20-40μL RNase(20μg/mL)中。
⑧经步骤⑥处理获得的质粒溶液利用引物:
vgbR：5’CGT GAA TTC TTA TTC AAC CGC TTG AGC GTA3’
vgbL：5’GTC AAG CTT TCT TGT TGA ATT ATT ACC AAA A3’
进行PCR扩增验证。
扩增vgb的PCR反应条件:
a)在95℃下反应5min；
b)经步骤a)后，以95℃45sec、55℃50sec和72℃70sec依次进行30个循环；
c)经步骤b)后，在72℃下延伸10min。
如图2所示，转化子P1～P4均能成功扩增出血红蛋白基因vgb条带，大小约为1.2Kb,与以pDG1730-vgb质粒为模板扩增的产物条带一致，说明转化子P1～P4转化的是成功连接vgb基因的pHY300PLK质粒。从此四株质粒中选取P1号，命名为pHY300-vgb。
（8）地衣芽孢杆菌感受态的制备
①接种Bacillus licheniformis DW2于5mL的LB培养基中，37℃，200r/min过夜培养；
②菌液用生长培养基稀释20倍后，37℃，200rpm～250rpm，培养2～3h（600nm吸光度值OD600为0.5～1.0）；
③将菌液放置于冰上，预冷10min，倒入50mL离心管中，置冰上放置15min后，4℃以5000g的离心力离心5min，收集菌体；
④经步骤③收集得到的菌体用预冷的电转化培养基重悬沉淀，洗涤菌体4次；
⑤用1/40体积的电转化培养基悬浮经步骤④处理获得的菌体，分装于1.5mL无菌离心管（约60μL/管），即为地衣芽孢杆菌感受态细胞。
（9）电转化
①60μL经步骤（8）获得的地衣芽孢杆菌感受态细胞加1μLpHY300-vgb质粒DNA（50ng/μL）放于预冷的2mm电转杯1～1.5分钟；
②经步骤①处理的菌液电击21kV/cm,时间4.5～5ms；
③经步骤②处理后，立即加入1mL恢复培养基，37℃培养3h后；
④将经步骤③处理获得的菌液涂在布含四环素的LB平板，过夜培养。
（10）转化子质粒的聚合酶链式反应（PCR）鉴定
在筛选到具有四环素抗性的地衣芽孢杆菌菌株中，随机挑取9株转化子，分别命名为PV1～PV9，抽提质粒，利用引物
vgbR：5’CGT GAA TTC TTA TTC AAC CGC TTG AGC GTA3’
vgbL：5’GTC AAG CTT TCT TGT TGA ATT ATT ACC AAA A3’
进行PCR扩增验证。
扩增vgb的PCR反应条件:
①在95℃下反应5min；
②经步骤①后，以95℃45sec、55℃50sec和72℃70sec依次进行30个循环；
③经步骤②后，在72℃下延伸10min。
如图3所示，转化子PV2～PV8均能成功扩增出血红蛋白基因vgb条带，大小约为1.2Kb,与以pDG1730-vgb质粒为模板扩增的产物条带一致，说明转化子PV2～PV8成功转化pHY300-vgb质粒。从成功转化pHY300-vgb质粒的转化子中随机选取（如选取PV2菌株），命名为Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)。
一氧化碳差光光谱法检测血红蛋白表达
（1）CO的制备
采用浓硫酸催化脱水法制备一氧化碳。圆底烧瓶内加入40mL左右的浓硫 酸，用洁净湿布擦去烧瓶口残留的浓硫酸；再向分液漏斗中注入100mL甲酸，连接好后，对烧瓶进行加热，接近沸腾时，开启活塞，使甲酸逐滴滴入到浓硫酸中，通过滴加甲酸的速度控制鼓出的气体约为每秒3个气泡，洗气瓶内加入稀NaOH溶液，气体通过洗气瓶去除挥发的酸性气体，即可得到一氧化碳。CO制备装置可采用图4所示结构。
（2）样品处理与扫描
地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)过夜活化，即将在PA瓶中用LB培养基培养的菌液以体积百分比1%接种于50mL LB培养基，于37℃振荡培养10h。取10ml经过夜活化的菌液，9000r/min，10min离心收集菌体后，以50mMol，pH7.0的磷酸钾缓冲液洗涤三次后，重悬于10mL磷酸钾缓冲液中。菌悬液在冰浴条件下，以20s作用时间、40s间隔时间进行超声波振荡以破碎细胞。破碎细胞的菌悬液每毫升加入20mg连二亚硫酸钠，然后分为等体积2份，一份通入一氧化碳气体(约每秒3-4个气泡)3min作为供试样品，另一份通入空气作为参比样品。首先在分光光度计中扫描参比样品400-500nm的光吸收值，然后扫描供试样品400-500nm的光吸收值，相应波长处两样品光吸收的差值即为差光吸收值，以差光吸收值为纵坐标，对应的波长为横坐标所得曲线即为样品的CO差光光谱图。与通入空气的参比样品相比，通入CO气体以后，Bacillus licheniformis (pHY300-vgb)能够在419nm波长下产生光吸收，这与典型的VHb特征吸收曲线吻和，而Bacillus licheniformisDW2和Bacillus licheniformis（pHY300）则没有特征吸收峰（参见图5）。结果表明VHb在Bacillus licheniformis（pHY300-vgb）中有表达活性。
升罐发酵对比实验
①将图6所示的三种地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisDW2、Bacillus licheniformis（pHY300）和Bacillus licheniformis（pHY300-vgb）（以上三菌株依次对应图中的B.licheniformisDW2、B.licheniformisP3和B.licheniformisPV2）的发酵种子分别以体积比1%的接种量接种在对应的LB培养基中，接种后180r/min，37℃培养10～12h；
②将经步骤①获得的三种地衣芽孢杆菌分别采用3L发酵罐，装液量1.5L发酵培养基，2%的接种量，37℃，500r/min，通气比2vvm，从开始发酵后3小时开始，每隔3小时取样一次，直到发酵至培养基pH8.5，时间共为36小时；
③采用稀释涂平板法测定发酵过程中各时间点的生物量（参见图6）
图6显示，前9小时三个菌株生物量基本相同，并都从9小时以后进入对数生长期。从9小时到21小时的对数生长期内Bacillus licheniformisDW2的生长速度明显快于其他两株菌，Bacillus licheniformisDW2的生长在21小时左右到达稳定期，并在21小时之后保持稳定。Bacillus licheniformis（pHY300）和Bacillus licheniformis（pHY300-vgb）在前18小时都保持相似的生长速度，18小时以后Bacillus licheniformis（pHY300-vgb）的生长速度开始快于Bacillus licheniformis （pHY300）。Bacillus licheniformis（pHY300）和Bacillus licheniformis （pHY300-vgb）的生长在21小时左右到达稳定期。在稳定期Bacillus licheniformisDW2的生物量最高，Bacillus licheniformis（pHY300）生物量最低，Bacillus licheniformis（pHY300-vgb）居中。
④采用高效液相色谱法测定发酵液杆菌肽效价（参见图7）
（1）样品制备：取发酵液2.0mL于10mL的离心管中，加入等体积无水乙醇，充分混合，10000r/min离心10min，取上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤后用于测定杆菌肽的色谱效价。
（2）标准品制备：取4g EDTA用蒸馏水定容到100mL，用NaOH调至pH7.0。取0.1g杆菌肽锌标准品溶于10mL EDTA溶液，用EDTA溶液做稀释，制备不同浓度的标准品溶液。
流动相配置：
溶液A：①称取3.48g K2HPO4，溶于100mL蒸馏水；
②称取13.6g KH2PO4，溶于500mL蒸馏水；
③将②加入①中，至pH6.0；
④取100mL③溶液，加入300mL蒸馏水；
溶液B：650mL甲醇（色谱纯）+50mL乙腈（色谱纯）。
将溶液A和B按350：650的体积混合制备成流动相，并真空抽滤除菌。
色谱条件：
色谱柱：大连伊利特BDS C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；进样量：20μL。
如图7显示，前6小时Bacillus licheniformisDW2、Bacillus licheniformis （pHY300）、Bacillus licheniformis（pHY300-vgb）（以上三菌株依次对应图中的B.licheniformisDW2、B.licheniformisP3和B.licheniformisPV2）三株菌都未开始产生杆菌肽，从9小时起Bacillus licheniformisDW2和Bacillus licheniformis （pHY300-vgb）开始可以检测到20U/mL左右的杆菌肽产量，且两株菌的杆菌肽产量相近。在12小时到24小时之间Bacillus licheniformisDW2开始快速合成杆菌肽，在发酵24小时左右杆菌肽产量达到最高，为480U/mL，24小时之后继续发酵杆菌肽效价则会有所下降。在12小时之后Bacillus licheniformis （pHY300-vgb）产杆菌肽的速度开始低于Bacillus licheniformisDW2，在30小时左右Bacillus licheniformis（pHY300-vgb）杆菌肽产量达到最高，为300U/mL。Bacillus licheniformis（pHY300）从9小时起开始产生杆菌肽，但速度一直较慢，产杆菌肽的速度在整个发酵过程中变化不大，在发酵终点36小时时杆菌肽产量为175U/mL。
以发酵30个小时为例，Bacillus licheniformisDW2的CFU为518亿，发酵液杆菌肽效价为398.7U/mL，单位菌体效价0.77U/108；Bacillus licheniformis （pHY300-vgb）的CFU为330亿，发酵液杆菌肽效价为278.3U/mL，单位菌体效价0.843U/108；Bacillus licheniformis（pHY300-vgb）地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)]单位菌体杆菌肽产量较原始菌株B.licheniformisDW2提高了9.4805%。
一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的应用，其特征在于：它在杆菌肽发酵中的应用。
地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)在杆菌肽发酵中的应用步骤包括：A菌种活化，B种子发酵，C生产发酵。
所述步骤A菌种活化的菌种活化培养基配方为：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl10g/L，pH值为7.0-7.4。
所述步骤A菌种活化的培养条件为从甘油管以体积百分比1%接种于装有5ml LB培养基的PA瓶中，180～300rpm，温度37℃，培养10～14h。
所述步骤B种子发酵的种子发酵培养基配方为：黄豆饼粉8～15g/L、玉米 淀粉2.5～7.5g/L、CaCO30.5～2.5g/L、(NH4)2SO40.1～1.0g/L、花生饼粉0.5～2.5g/L，pH值为6.5～7.5。
所述步骤B种子发酵的培养条件为将经步骤A菌种活化后的菌液以体积百分比1%接种后180～300r/min，温度37℃，培养10～12h。
所述步骤C生产发酵的生产发酵培养基配方为（g/L）：黄豆饼粉45～55g/L、玉米淀粉15～25g/L、CaCO34～8g/L、(NH4)2SO40.5～2g/L、花生饼粉4～8g/L、玉米浆6～14g/L，pH值为6.5～7.5。
所述步骤C生产发酵的培养条件为500mL三角瓶装生产发酵培养基的液量为25～150mL，将经步骤B种子发酵后的菌液以体积百分比2%接种量，180～300r/min，温度37℃，发酵培养48h。
所述玉米浆可从浚县永康玉米加工有限公司、鲁洲生物科技（山东）有限公司或山东寿光聚能金玉米开发有限公司等企业购得，通常玉米浆的干物质含量≥40%。
Claims (7)
1.一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株为地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)]，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2011345，保藏日期为2011年10月12日。
2.一种权利要求1所述携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：质粒pDG1730-vgb+经BamH I和Hind III双酶切得到的1246bp vgb片段，该片段含有芽孢杆菌编码乙酰高丝氨酸内酯(AHL)自身诱导物(AI)合成酶luxS基因的启动子PluxS和vgb ORF；质粒pHY300PLK经BamH I和Hind III双酶切得到4870bp线性质粒片段；1246bp vgb片段与4870bp线性质粒片段经DNA连接酶连接作用，得到表达载体pHY300-vgb；将表达载体pHY300-vgb转入大肠杆菌进行保存，其后通过电转化转入原始菌株——地衣芽孢杆菌(B.licheniformis DW2)，以四环素抗性为筛选标记，筛选得到地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)]。
3.一种权利要求1或2所述携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的应用，其特征在于：它在杆菌肽发酵中的应用。
4.根据权利要求3所述携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的应用，其特征在于：地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)在杆菌肽发酵中的应用步骤包括：A菌种活化，B种子发酵，C生产发酵。
5.根据权利要求4所述的携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述步骤A菌种活化的菌种活化培养基配方为：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl10g/L，pH值为7.0-7.4；
所述步骤A菌种活化的培养条件为从甘油管以体积百分比1%接种于装有5ml LB培养基的PA瓶中，180～300rpm，温度37℃，培养10～14h。
6.根据权利要求5所述的携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述步骤B种子发酵的种子发酵培养基配方为：黄豆饼粉8～15g/L、玉米淀粉2.5～7.5g/L、CaCO30.5～2.5g/L、(NH4)2SO40.1～1.0g/L、花生饼粉0.5～2.5g/L，pH值为6.5～7.5；
所述步骤B种子发酵的培养条件为将经步骤A菌种活化后的菌液以体积百分比1%接种后180～300r/min，温度37℃，培养10～12h。
7.根据权利要求6所述的携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的应 用，其特征在于：所述步骤C生产发酵的生产发酵培养基配方为（g/L）：黄豆饼粉45～55g/L、玉米淀粉15～25g/L、CaCO34～8g/L、(NH4)2SO40.5～2g/L、花生饼粉4～8g/L、玉米浆6～14g/L，pH值为6.5～7.5；
所述步骤C生产发酵的培养条件为500mL三角瓶装生产发酵培养基的液量为25～150mL，将经步骤B种子发酵后的菌液以体积百分比2%接种量，180～300r/min，温度37℃，发酵培养48h。
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