CN103865862A

CN103865862A - 一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN103865862A
Application number: CN201410063546.1A
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 祁高富; 罗文�; 李俊辉; 楼丽君
Original assignee: LIFECOME BIOCHEMISTRY CO Ltd
Current assignee: LIFECOME BIOCHEMISTRY CO Ltd
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2014-02-25
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2034-02-25
Also published as: CN103865862B

Abstract

本发明提供一种能够高产杆菌肽的携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株DW2(pHY300-cysE)，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2013402，保藏日期为2013年9月10日。本发明的携带丝氨酸乙酰转移酶基因cysE的地衣芽孢杆菌在杆菌肽中的应用，其应用步骤包括：A菌种活化，B种子发酵，C生产发酵。本发明使菌体杆菌肽产量提高了7%。

Description

一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌工程菌株。

背景技术

杆菌肽为淡黄色或类白色粉末，无嗅，味苦，是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌。杆菌肽拥有在肠道内几乎不吸收，排泄迅速，体内不残留等优点，因此被广泛添加于饲料中。

目前，杆菌肽大多通过微生物发酵法生产，其主要生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。杆菌肽发酵过程中，氨基酸底物的供应对其产量具有重要的影响，合理及充分的氨基酸供应可以提高杆菌肽的产量。

有研究表明某些氨基酸（例如半胱氨酸）的补料对于杆菌肽的产量有促进作用。但是，目前，在杆菌肽微生物发酵生产领域，大多数研究者和厂家采用向发酵培养基中添加半胱氨酸的方式（补料添加方式）来实现杆菌肽生产菌株生长过程中半胱氨酸的供应，从而提高杆菌肽的产量。但是，此通过半胱氨酸补料添加方式提高杆菌肽产量的方式存在诸多缺点：（1）杆菌肽产量依然较低；（2）半胱氨酸添加的量较大时，在培养基中溶解需要一定时间，未完全溶解的半胱氨酸容易沉积，堵塞发酵罐的管道口；（3）人工往培养基中添加半胱氨酸，会打乱生产菌株的正常代谢，影响菌株的生长周期，也容易造成染菌；（4）半胱氨酸的需求添加量由发酵罐中菌的个数决定，而发酵罐中菌量增加迅速，因此，半胱氨酸的加入量难以确定。

发明内容

本发明旨在提供一种能够高产杆菌肽的携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法与应用。

一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2(pHY300-cysE) [英文名称为：Bacillus licheniformis DW2(pHY300-cysE) ]，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO ：M 2013402，保藏日期为2013年9 月10日。

一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：（1）从原始地衣芽孢杆菌DW2 [英文名称为：B.licheniformis DW2] 的总DNA中扩增出cysE基因（即乙酰转移酶基因）片段；（2）在cysE基因片段上游连接启动子、下游连接终止子，构成完整的表达元件；（3）在表达元件的前、后分别加上EcoR I、Hind III酶切位点，构成目的基因片段；（4）采用EcoR I和Hind III限制性内切酶分别对目的基因片段和质粒pHY300PLK进行酶切，得到1284bp 的cysE片段和4870 bp的线性质粒片段；（5）将此1284bp 的cysE片段和4870 bp的线性质粒片段经DNA连接酶连接，得到表达载体pHY300-cysE；（6）将表达载体pHY300-cysE转入B.licheniformis DW2，以四环素抗性或氨苄青霉素抗性为筛选标记，筛选得到携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌DW2[英文名称为：Bacillus licheniformis DW2(pHY300-cysE) ]。

其中，所述的原始地衣芽孢杆菌DW2[英文名称为：Bacillus licheniformis DW2]，保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344，保藏日期为2011年10月12日。

所述的启动子优选采用p43启动子，p43启动子为基因工程领域常用的启动子，不仅表达可靠，并且，p43启动子属于组成型启动子，此种类型的启动子不受组织器官和发育阶段的基因表达的影响，适用性强。

所述的终止子优选采用淀粉酶终止子，淀粉酶终止子的基因序列容易获得。当所述的启动子采用p43启动子，同时，所述的终止子采用淀粉酶终止子时，所得到的完整表达元件为1284bp的基因片段、目的基因片段为1302bp的基因片段。

在cysE基因片段上游连接p43启动子、下游连接淀粉酶终止子(amy1)均采用重叠延伸PCR进行。当然，采用酶切酶连的方式也可达到同样的效果，但是却容易引起基因移码、表达效率下降等问题。

本发明的携带丝氨酸乙酰转移酶基因cysE的地衣芽孢杆菌在杆菌肽中的应用，其应用步骤包括：A菌种活化，B种子发酵，C生产发酵。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

（1）本发明首次通过在地衣芽孢杆菌的表达载体pHY300PLK中连接上丝氨酸乙酰转移酶基因cysE构建工程菌株的方式，来达到提高杆菌肽产量的目的；

（2）由于半胱氨酸为胞内生产，提高了半胱氨酸的利用率，同时，不会造成发酵罐的堵塞；

（3）半胱氨酸可以源源不断的生产，无需人工添加，不仅可避免人工添加造成的染菌，也避免打扰菌体的正常生长；

（4）本发明构建的工程菌株出现了二次生长和三次生长，提高了菌株的生长代谢周期；

（5）本发明采用的培养基降解后，产生的除半胱氨酸以外的杆菌肽合成必需氨基酸产量均较高，半胱氨酸的产量低，而本发明构建的菌株具有增强半胱氨酸表达的作用，因此，本发明的菌株与现有技术（公布号为CN 103146629 A的专利文件）中的发酵培养基配方的组合，使菌体杆菌肽产量提高了7%左右。

虽然，对于本领域普通技术人员来说，容易想到采用向受体菌中转入携带具有增强半胱氨酸表达的基因片段的重组质粒来达到提高半胱氨酸产量的目的，但是，由于半胱氨酸合成阶段所涉及到的酶的种类繁多，如何选择具有增强半胱氨酸表达的基因片段是一个大难题。并且，本发明人试验的过程中发现有些与半胱氨酸合成有关的酶的基因的加入并不能起到提高半胱氨酸产量的作用。而本发明经过无数次的试验，才发现采用丝氨酸乙酰转移酶基因cysE构建重组质粒可有效提高半胱氨酸的含量。并且，也并不是所有的能够产生杆菌肽的地衣芽孢杆菌均可以通过本发明的技术方案实现提高杆菌肽的产量，原因在于：半胱氨酸仅仅是杆菌肽合成所必需的氨基酸之一，因此，受体菌自身是否能够足量表达除半胱氨酸以外的杆菌肽合成必需氨基酸或培养基是否能够足量提供除半胱氨酸以外的杆菌肽合成必需氨基酸对本发明的技术效果有很大的影响。即本发明采用原始地衣芽孢杆菌DW2作为受体菌非常关键。本申请人通过以丝氨酸乙酰转移酶基因cysE作为目的基因片段构建重组质粒，增强了丝氨酸乙酰转移酶在菌体内的表达量，增强半胱氨酸在菌体内的合成效率，并且，构建的工程菌株出现了二次生长和三次生长，同时，通过采用地衣芽孢杆菌DW2作为受体菌，最终，使菌体杆菌肽产量提高了7%左右。

附图说明

图1为表达载体pHY300-cysE的结构示意图；

图2为 Bacillus licheniformis DW2（pHY300-cysE）琼脂糖凝胶电泳图；

图3为发酵培养基中Bacillus licheniformis DW2（pHY300-cysE）的生长曲线。

具体实施方式

一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：（1）从原始地衣芽孢杆菌菌株DW2[英文名称为：B.licheniformis DW2]的总DNA中扩增出cysE基因（即丝氨酸乙酰转移酶基因）片段；（2）在cysE基因片段上游连接p43启动子、下游连接淀粉酶终止子(amy1)，构成1284bp的完整表达元件；（3）在表达元件的前、后分别加上EcoR I、Hind III酶切位点，构成1302bp的目的基因片段；（4）采用EcoR I和Hind III限制性内切酶分别对目的基因片段和质粒pHY300PLK进行酶切，得到1284bp 的cysE片段和4870 bp的线性质粒片段；（5）将此1284bp 的cysE片段和4870 bp的线性质粒片段经DNA连接酶连接，得到表达载体pHY300-cysE（如图1所示，其中，图1中的ori-177和ori-pAMα1为两个转录起始基因、p43为p43启动子基因、cysE为丝氨酸乙酰转移酶基因、amy1为淀粉酶终止子基因、Tet为四环素基因、Amp为氨苄青霉素基因、EcoR I为EcoR I酶切位点、Hind III为Hind III酶切位点）；（6）将表达载体pHY300-cysE转入B.licheniformis DW2，以四环素抗性或氨苄青霉素抗性为筛选标记，筛选得到携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株DW2 [英文名称：B.licheniformis DW2(pHY300-cysE)]。

其中，所述的原始地衣芽孢杆菌菌株DW2，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344，保藏日期为2011 年10 月12 日。

当然，本发明的启动子不限于p43启动子，但是p43启动子为基因工程领域常用的启动子，不仅表达可靠，并且，p43启动子属于组成型启动子，此种类型的启动子不受组织器官和发育阶段的基因表达的影响，适用性强；本发明的终止子也不限于淀粉酶终止子，但是，淀粉酶终止子为常见的终止子，基因序列容易获得。

携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法的具体实施方式，如下：

1、步骤（1）的具体操作步骤为：

利用设计的引物，以地衣芽孢杆菌菌株DW2总DNA为模版经过普通PCR扩增得到cysE基因片段。

其中，在此普通PCR的反应体系中，采用的cysE基因片段的引物序列为：

cysE-1（即上游引物）：GTGTTCTTTAAAATGCTGA、

cysE-2（即下游引物）：TCACAGCTCATCTTCCCTTTC；

采用的普通PCR反应体系组成为：模版（总DNA） 1ul、fastPfu酶0.5ul、上下游引物各1ul、fastPfu 酶buffer 5ul和ddH2O 17.5ul，总体系：25ul；采用的普通PCR反应条件为：95℃ 10min；95℃ 45s；58℃ 45s；72℃ 30s；循环数30；72℃ 10min。

2、步骤（2）的具体操作步骤为：

步骤（2）由以下构建步骤组成：①采用普通PCR扩增获得p43启动子基因片段；②通过普通PCR扩增获得淀粉酶终止子（amyl）基因片段；③采用重叠延伸PCR（SOEPCR）在cysE基因片段上游连上p43启动子片段、在cysE基因下游连上淀粉酶终止子片段。

其中，在步骤（2）-①的普通PCR反应体系中，p43启动子的引物序列为：

p43-1（即上游引物）：GGGAATTCGCGGAATTTCCAATTTCATG、

p43-2（即下游引物）：GTGTACATTCCTCTCTTACC。

在步骤（2）-②的普通PCR反应体系中，淀粉酶终止子的引物序列为：

amyl-1（即上游引物）：CCAAGCTTGATCACCCGCGATACCGTCA 、

amyl-2（即下游引物）：AAGATAGAAGAGCAGA。

步骤（2）-③的SOEPCR反应体系中，引物序列为：

amyl-1：CCAAGCTTGATCACCCGCGATACCGTCA、

p43-1：GGGAATTCGCGGAATTTCCAATTTCATG、

cysE-SOE-1： AGGTAAGAGAGGAATGTACACGTGTTCTTTAAAATGCTGAAA、

cysE-SOE-2：CCTCTCTGCTCTTCTATCTTTCACAGCTCATCTTCCCTTTC;

在步骤（3）-③中，首先，采用p43-1与cysE-SOE-1作为引物、步骤（2）-①获得的p43启动子基因片段为模板，通过普通PCR扩增获得p43启动子进行SOE的片段；同时，采用cysE-SOE-1与cysE-SOE-2作为引物、步骤（1）获得的cysE基因片段作为模板，通过普通PCR扩增获得cysE进行SOE的片段；采用cysE-SOE-2与amyl-1作为引物、步骤（2）-②获得的淀粉酶终止子基因片段作为模板，通过普通PCR扩增获得淀粉酶终止子进行SOE的片段。然后，按照SOEPCR的具体操作步骤：配好不加入引物的体系（此体系的组成为：各片段1ul、fastPfu酶：0.5ul、fastPfu 酶buffer：5ul、ddH2O：14.5ul，即23ul的体系），进行以下PCR：95℃ 10min、95℃ 45s、58℃ 45s、72℃ 30s、循环数为7，然后保持72℃ 10 min，此时，加入上下游引物（p43-1和amyl-1各1ul）；再进行以下PCR： 95℃ 45s、58℃ 45s、72℃ 30s、循环数23-25，得到完整的表达元件，此表达元件为1284bp的基因片段。

步骤（3）中所涉及到的所有普通PCR的其他组成、反应条件均于步骤（1）中的普通PCR相同。

3、步骤（3）的具体操作步骤为：

采用普通PCR方式在步骤（2）所得到的完整表达元件的前、后加上酶切位点，具体为通过设计引物序列时，在前后加入酶切位点序列的方式来实现，制得目的基因片段，此目的基因片段为1302bp的基因片段。此处完整表达元件的引物设计的方式为本领域的常规技术，在此不做赘述。

4、步骤（4）的具体操作步骤为：

采用EcoR I、Hind III限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切，得到1284bp 的cysE片段，并，产物回收1284bp 的cysE片段。其中，酶切体系：水26ul、目的基因片段15ul、10×K buffer 5ul、EcoR I 2ul、Hind III 2ul；酶切条件：温度37℃，时间8小时。EcoR I、Hind III 为DNA限制性内切酶，10×K buffer为配套的限制性内切酶缓冲液。EcoR I、Hind III以及10×K buffer均购自宝生物工程（大连）有限公司。产物回收可采用上海赛百盛基因技术有限公司生产的PCR产物纯化及胶回收试剂盒（树脂型）进行回收。

同时，采用EcoR I、Hind III限制性内切酶对质粒pHY300PLK进行双酶切，得到4870 bp线性质粒片段，并，产物回收4870 bp的质粒片段。其中，酶切体系为水 26ul、pHY300PLK 15ul、10×K buffer 5ul、EcoR I 2ul、HindIII 2ul，酶切条件为温度30℃、时间8小时。

质粒pHY300PLK质粒为购自宝生物工程（大连）有限公司的商业质粒。产物回收可采用上海赛百盛基因技术有限公司生产的PCR产物纯化及胶回收试剂盒（树脂型）进行回收。

5、步骤（5）的具体操作步骤为：

将1284bp 的cysE片段和4870 bp的线性质粒片段经DNA连接酶连接，得到表达载体pHY300-cysE DNA连接。其中，连接体系为

pHY300PLK双酶切回收产物（即4870 bp的线性质粒片段） 1 ul、 1284 bp cysE片段 3 ul、10×T4 DNA ligase buffer 1 ul、 T4 DNA ligase 0.5 ul、水4.5 ul；连接条件为温度16℃、时间12小时。

T4 DNA ligase为商用的DNA连接酶，10×T4 DNA ligase buffer为配套的连接酶缓冲液。T4 DNA ligase以及10×T4 DNA ligase buffer均购自宝生物工程（大连）有限公司。

6、步骤（6）的具体操作步骤为：

首先，制备大肠杆菌感受态细胞，具体步骤为：将大肠杆菌菌种从甘油管以体积比1%接种于5ml LB培养基，于37°C，250 r/min振荡培养过夜；1%接种于50 mL LB培养基，37°C振荡培养2-4 h；将菌液置冰上10 min，使菌液冷却，倒入50 mL离心管中，4°C 5000 r/min离心3 min，弃上清；用20 mL预冷的CaCl₂(0.1 mol/L)洗涤沉淀，4°C 5000 r/min离心3 min，弃上清；用1.5 mL预冷的CaCl₂(0.1 mol/L)重悬沉淀，分装于无菌1.5 mL离心管中，置-70°C保存备用。

其次，将表达载体pHY300-cysE转入大肠杆菌感受态细胞中，具体步骤为：取100-200 μL大肠杆菌感受态细胞与连接产物（即表达载体pHY300-cysE）混合，冰上吸附15 min；将离心管放到42°C循环水浴中热激90 s；快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却5 min；每管加800 μL LB培养基，37°C，150 r/min培养45 min；取200 μL涂平板，用无菌的涂布棒将菌液均匀涂满整个平板表面；平板37°C培养，正置30 min后倒置培养12-16 h，可出现菌落。

然后，对大肠杆菌中的pHY300-cysE进行提取，具体步骤为：5 mL菌液，离心收集，用STE洗涤一次，加入100 mL Solution Ⅰ溶液重悬菌体，置于冰上5 min；加入200 mL Solution Ⅱ，快速颠转混匀，置于冰上5 min；加入150 mL Solution Ⅲ混匀，置于冰上5 min；12000 r/min离心5 min，取上清；加入500 mL苯酚/氯仿震荡，12000 r/min离心5 min，取上清；加入2倍无水乙醇-20°C沉淀2 h，12000 r/min离心5 min，弃上清；沉淀用70%乙醇洗一遍，去上清，干燥后溶于20-40 mL RNase (20 μg/mL)中。

进一步，制备地衣芽孢杆菌感受态细胞：原始地衣芽孢杆菌菌株Bacillus licheniformis DW2于5mL的LB培养基中，37℃，200r/min过夜培养；菌液用生长培养基稀释20倍后，37℃，200rpm～250rpm，培养2～3h后OD₆₀₀达到0.5～1.0；将菌液放置于冰上，预冷10min，倒入50mL离心管中，置冰上放置15min后，4℃ 5000g离心5min，收集菌体；用预冷的电转化培养基（具体配方）重悬沉淀，洗涤菌体4次；用1/40体积的电转化培养基悬浮菌体，分装于1.5 mL无菌离心管（约60 μL/管），即为感受态细胞。

将pHY300-cysE质粒DNA转入原始地衣芽孢杆菌感受态细胞内，具体步骤为： 60uL感受态细胞加1ul pHY300-cysE质粒DNA（50 ng/uL）于预冷的2mm电转杯中放置1～1.5分钟；电击21 kV/cm,时间4.5～5ms；立即加入1mL恢复培养基；37℃培养3h后，涂布含四环素的LB平板，过夜培养。

最后，采用加入四环素的培养基对地衣芽孢杆菌菌株进行筛选，随机挑取3株转化子，分别命名为PE1~PE3。并对此三株菌株进行鉴定。当然，也可采用在培养基中添加氨苄青霉素对菌株进行筛选。

上述鉴定3株转化子的步骤为：抽提菌株中的质粒，利用引物

cysE-R：5’ GCGGAATTTCCAATTTCATG 3’、

cysE-L：5’ GATCACCCGCGATACCGTCA 3’

进行PCR扩增验证；扩增 cysE的PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 45sec，55℃ 60sec，72℃ 90sec，30个循环； 72℃延伸10 min。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（如图2所示）。在图2中，图2中泳道1-3分别为转化子PE1~PE3的菌落PCR验证条带；泳道4为DNA ladder（即标准DNA混合物），泳道4从下至上条带所对应的相对分子量依次为：100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、5000bp；泳道5为phy300-cysE质粒为模板的阳性对照，泳道6为宿主菌菌落为模板的阴性对照。由图2可看出，转化子PE1~PE3（即泳道1~3）均能成功扩增出cysE基因条带，大小约为1.2 Kb（即大约为1200bp）, 与以pHY300-cysE质粒为模板（即阳性对照，泳道5）扩增的产物条带一致，说明转化子PE1~PE3成功转化pHY300-cysE质粒。从成功转化pHY300-cysE质粒的转化子中随机选取（如选取PE2菌株），命名为Bacillus licheniformis DW2(pHY300-cysE)。

本发明的一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株应用在杆菌肽发酵中的应用步骤包括：A菌种活化，B种子发酵，C生产发酵。

所述步骤A菌种活化的菌种活化培养基配方为（g/L）：酵母粉3~7、蛋白胨8~12、NaCl 9~13， pH 7.0-7.4。

所述步骤A菌种活化的培养条件为从低温保存的甘油管以体积百分比1%接种于装有5ml LB培养基的PA瓶中，180～300rpm，37℃培养10～14h。

所述步骤B种子发酵的种子发酵培养基配方为（g/L）：黄豆饼粉 8～15、玉米淀粉 2.5～7.5、CaCO₃ 0.5～2.5、(NH₄)₂SO₄0.1～1.0、花生饼粉0.5～2.5，pH 6.5～7.5。

所述步骤B种子发酵的培养条件为将经步骤A菌种活化后的菌液以体积百分比按1%接种量接种后于180～300 r/min，37℃培养10~12 h。

所述步骤C生产发酵的生产发酵培养基配方为（g/L）：黄豆饼粉 45～50、玉米淀粉 18～21、CaCO₃ 5～8、(NH₄)₂SO₄0.9～1、花生饼粉 4～6、玉米浆 10～12，pH 6.5～7.2。

所述步骤C发酵的培养条件为500 mL三角瓶装生产发酵培养基25～150 mL，将经步骤B种子发酵后的菌液以体积百分比2%接种量接种后，于180～300 r/min，37℃发酵培养48 h。

所述玉米浆可从浚县永康玉米加工有限公司、鲁洲生物科技（山东）有限公司或山东寿光聚能金玉米开发有限公司等企业购得，其中，此处的玉米浆采用的是干物质含量≥40%的玉米浆产品。

为了对抗菌肽的产量进行测定，本申请人对上述步骤（3）生产发酵后的菌液在50 L发酵罐中进行了扩大培养，即升罐发酵，并对升罐发酵过程中各时间点的生物量以及最终的发酵液效价进行了测定。

升罐发酵的具体操作为：采用生产发酵培养基，将经步骤C生产发酵后的菌液按体积比1%接种量接种后于180 r/min，37℃培养10~12 h；采用50 L发酵罐，装液量20L，2%的接种量，37℃，400 r/min，2 vvm，从开始发酵后4小时开始，每隔4小时取样一次，直到发酵至培养基pH8.0，时间共为48小时。

采用稀释涂平板法测定发酵过程中各时间点的生物量（参见图3），其中，图3纵坐标的cfu指的是菌落形成单位，从图3可看出，本发明采用的菌株具有明显的二次生长甚至有时存在三次生长的特点，具体为：菌株在经过了正常的指数生长进入第一次衰亡期之后，又会发生菌数快速上升的情况，这种情况被称为二次生长，而在二次生长后期还存在一个三次生长的趋势。

采用高效液相色谱法测定发酵液杆菌肽效价。高效液相色谱测定中的样品制备步骤为：取发酵液2.0 mL于10 mL的离心管中，加入等体积无水乙醇，充分混合，10000 r/min离心10min，取上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤后用于测定杆菌肽的色谱效价。高效液相色谱测定中的标准品制备的步骤为：取4 g EDTA用蒸馏水定容到100 mL，用NaOH调至pH 7.0；取0.1 g杆菌肽锌标准品溶于10 mL EDTA溶液，用EDTA溶液做稀释，制备不同浓度的标准品溶液。高效液相色谱测定中的流动相配置为：溶液A：称取3.48 g K₂HPO₄，溶于100 mL蒸馏水；称取13.6 g KH₂PO₄，溶于500 mL蒸馏水；将2加入1中，调节至pH 6.0；取100 mL3溶液，加入300 mL蒸馏水；溶液B：650 mL甲醇（色谱纯）+ 50 mL乙腈（色谱纯）；将溶液A和B按350：650的体积混合制备成流动相，并真空抽滤除菌；色谱条件为色谱柱：大连伊利特BDS C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)、柱温：35℃、流速：1.0 mL/min、检测波长：254 nm、进样量：20 μL。

发酵液杆菌肽效价的具体计算方式为：首先，测定单位体积效价数，即单位体积效价（U/ml）=杆菌肽标准品的效价（U /mg）*称取的杆菌肽标准品质量（mg）/杆菌肽标准品溶液的体积（ml）；然后，根据公式：发酵液的效价=发酵液液相测量的峰面积*单位体积效价*稀释倍数/杆菌肽标准品峰面积，计算出发酵液的效价。

为了体现原始菌株的选择和携带基因的选择对本申请的抗菌肽产量的影响，本申请人还列出了3组进行了对比实施例（对比1~3）。另外，本发明人还以未含携带基因的原始地衣芽孢杆菌DW2所对应的发酵液杆菌肽效价为对照组。现将本发明的实施例以及对比1~3的工艺参数以及试验结果列举如下表1。

表1 本发明的实施例以及对比1~3的工艺参数以及试验结果

从表1可看出，原始菌株的选择和携带基因的选择对本发明的携带基因的原始地衣芽孢杆菌DW2的发酵液杆菌肽效价的提高非常关键。本发明的实施例所对应的发酵液杆菌肽效价（878.2 U/ml）与对照组相比，提高了7%。

Claims

1.一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2(pHY300-cysE) [英文名称为：Bacillus licheniformis DW2(pHY300-cysE) ]，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO ：M 2013402，保藏日期为2013年9 月10日。

2.一种权利要求1所述的一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：（1）从原始地衣芽孢杆菌DW2的总DNA中扩增出丝氨酸乙酰转移酶基因cysE基因片段；（2）在cysE基因片段上游连接启动子、下游连接终止子，构成完整的表达元件；（3）在表达元件的前、后分别加上EcoR I、Hind III酶切位点，构成目的基因片段；（4）采用EcoR I和Hind III限制性内切酶分别对目的基因片段和质粒pHY300PLK进行酶切，得到1284bp 的cysE片段和4870 bp的线性质粒片段；（5）将此1284bp 的cysE片段和4870 bp的线性质粒片段经DNA连接酶连接，得到表达载体pHY300-cysE；（6）将表达载体pHY300-cysE转入B.licheniformis DW2，以四环素抗性或氨苄青霉素抗性为筛选标记，筛选得到携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌。

3.根据权利要求2所述的一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，其特征在于：步骤（2）中所述的启动子采用p43启动子。

4.根据权利要求2所述的一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，其特征在于：步骤（2）中所述的终止子采用淀粉酶终止子。

5.根据权利要求2所述的一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，其特征在于：步骤（2）中在cysE基因片段上游连接启动子、下游连接终止子均采用重叠延伸PCR进行。

6.根据权利要求1所述的一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株，其特征在于：其在杆菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A菌种活化，B种子发酵，C生产发酵。