CN103937735A

CN103937735A - 一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法和应用

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Publication number: CN103937735A
Application number: CN201410186040.XA
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 祁高富; 王冬; 李俊辉; 楼丽君
Original assignee: LIFECOME BIOCHEMISTRY CO Ltd
Current assignee: LIFECOME BIOCHEMISTRY CO Ltd
Priority date: 2014-05-05
Filing date: 2014-05-05
Publication date: 2014-07-23

Abstract

本发明提供一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2△xpf（简称：Bacillus licheniformisDW2△xpf），该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2013403，保藏日期为2013年9月10日。此菌株不仅可产生抗菌肽，并且，不会被PBSX所裂解，将此菌株在抗菌肽生产中应用可实现高产抗菌肽的目的。

Description

一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种敲除缺陷型原噬菌体(简称：PBSX)的正调控因子基因xpf的地衣芽孢杆菌菌株，并将其应用于抗菌肽生产中。

背景技术

杆菌肽为淡黄色或类白色粉末，无嗅，味苦，是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌。杆菌肽通过组氨酸的咪唑基和噻唑环，与多种金属离子如Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺和Mn²⁺等生成络合物，其中以锌盐形式存在的杆菌肽，抑菌活性得到一定程度的增强，且稳定性最好。杆菌肽具有在肠道内几乎不吸收，排泄迅速，体内不残留等优点，因此被广泛添加于饲料中。

目前，杆菌肽一般通过微生物发酵法生产，其中，杆菌肽的主要生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。但是，由于此两种生产菌株中均被发现存在缺陷型原噬菌体PBSX，在正常情况下，PBSX的编码基因整合在宿主细胞基因组上，并随着宿主细胞基因组一同复制；当宿主细胞受到SOS刺激诱导(例如丝裂霉素C的诱导时)，PBSX便会在宿主细胞中大量合成，并通过裂解宿主细胞而释放到胞外，导致宿主细胞数量的大幅减少(即发酵过程中菌株细胞量下降)，从而影响杆菌肽的产量。

发明内容

本发明旨在提供一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法，此菌株不仅可产生抗菌肽，并且，不会被PBSX所裂解，因此，将此菌株在抗菌肽生产中应用可实现高产抗菌肽的目的。

一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2△xpf(简称为：Bacillus licheniformis DW2△xpf)，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2013403，保藏日期为2013年9月10日。此菌株不仅可产生抗菌肽，并且，不会被PBSX所裂解。

一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：(1)采用限制性DNA内切酶XbaⅠ和SacⅠ对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到线性的T2(2)-ori质粒；(2)以原始地衣芽孢杆菌DW2(简称：Bacillus licheniformis DW2)的基因组DNA为模板，分别以上、下游同源臂引物进行PCR扩增，分别得到上、下游同源臂；(3)以上、下游同源臂共同作为模板进行soe-PCR，得到上、下游同源臂融合DNA片段；(4)采用DNA内切酶XbaⅠ和SacⅠ对上、下游同源臂融合DNA片段进行双酶切，并将酶切后的上、下游同源臂融合基因片段与线性的T2(2)-ori质粒连接，得到已敲除xpf基因的质粒T2(2)-ori-xpf；(5)将质粒T2(2)-ori-xpf转入原始地衣芽孢杆菌DW2，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到成功转化的地衣芽孢杆菌(T2(2)-ori-xpf)[简称：Bacillus licheniformis(T2(2)-ori-xpf)]；(6)将Bacillus licheniformis(T2(2)-ori-xpf)经过45℃和卡那霉素抗性筛选得到上游臂或下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的单交换菌株；(7)单交换菌株再通过卡那霉素抗性筛选得到敲除xpf基因的地衣芽孢杆菌DW2△xpf(简称：Bacillus licheniformis DW2△xpf)。在地衣芽孢杆菌DW2中通过在质粒T2(2)-ori上连接xpf基因的上下游敲除同源臂，构建了一种能对xpf基因进行无痕敲除的质粒，并通过高温和抗生素筛选成功实现了xpf基因的无痕敲除，从而成功获得了敲除xpf基因的地衣芽孢杆菌DW2△xpf。

所述原始地衣芽孢杆菌(简称：Bacillus licheniformis DW2)，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2011344，保藏日期为2011年10月12日。

本发明的敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株的应用，其应用于抗菌肽生产，应用步骤为：

A菌种活化，菌种活化培养基配方为(g/L)：酵母粉3～7、蛋白胨8～12、NaCl9～13，pH7.0-7.4，培养条件为将上述的地衣芽孢杆菌DW2△xpf以体积百分比1％接种于装有5～8ml菌种活化培养基的PA瓶中，180～300rpm，33～37℃，10～14h，得到含有地衣芽孢杆菌DW2△xpf的菌液；

B摇瓶发酵，摇瓶发酵培养基配方为(g/L)：豆粕8～12％、玉米淀粉4～5％、CaCO₃0.5～0.8％、(NH₄)₂SO₄0.08～0.13％；向三角瓶中加入20～40mL的摇瓶发酵培养基，将步骤A的含有地衣芽孢杆菌DW2△xpf的菌液以体积百分比2～5％接种于三角瓶内的摇瓶发酵培养基中，150～200r/min，33～37℃培养46～48h，得到发酵液。

本发明的Bacillus licheniformis DW-2△xpf的发酵液中杆菌肽产量较原始菌株B.Licheniformis DW2提高了7.7％。

本发明首次提出了对能够产生杆菌肽的菌株进行基因敲除来构建工程菌，从而达到提高抗菌肽产量的目的，突破了本领域技术人员在抗菌肽增产方面的常规思维；并且，本申请人也是对地衣芽孢杆菌DW2这一工程菌进行基因敲除的第一人，突破了本领域技术人员对用于基因敲除的工程菌选择方面的常规思维；另外，现有技术中报道的关于提高抗菌肽产量的方法主要从对发酵过程优化、培养过程改进以及基因手段进行，而基因手段仅限于通过提高菌株在低氧环境下的成活率来提高杆菌肽的产量，而，本申请人突破本领域的技术偏见，采用敲除可产生抗菌肽的菌株(DW2菌株)的xpf基因构建重组菌株的增产方式来提高抗菌肽产量，使得发酵液中抗菌肽的产量提高了7.7％。

附图说明

图1为本发明的T2(2)-ori-xpf质粒的结构示意图；

图2为本发明的T2(2)-ori-xpf质粒单交换验证琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明的xpf敲除转化子的验证琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：1)采用限制性DNA内切酶XbaⅠ和SacⅠ对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到线性的T2(2)-ori质粒；2)以原始地衣芽孢杆菌DW2(简称：Bacillus licheniformis DW2)的基因组DNA为模板，分别以上、下游同源臂引物进行PCR，扩增，分别得到上、下游同源臂；3)以上、下游同源臂共同作为模板进行soe-PCR，得到上、下游同源臂融合DNA片段；4)采用DNA内切酶XbaⅠ和SacⅠ对上下游同源臂融合DNA片段进行限制性双酶切，并将酶切后的上、下游同源臂融合基因片段与线性的T2(2)-ori质粒连接，得到已敲除xpf基因的质粒T2(2)-ori-xpf；5)将质粒T2(2)-ori-xpf转入原始地衣芽孢杆菌DW2，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到成功转化的地衣芽孢杆菌(T2(2)-ori-xpf)[简称：Bacillus licheniformis(T2(2)-ori-xpf)]；6)将Bacillus licheniformis(T2(2)-ori-xpf)经过45℃和卡那霉素抗性筛选得到上游臂或下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的单交换菌株；7)单交换菌株再通过卡那霉素抗性筛选得到敲除xpf基因的地衣芽孢杆菌DW2△xpf(简称：Bacillus licheniformis DW2△xpf)。

一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法的具体实施方式，如下：

1、步骤1)的具体操作步骤为：

采用限制性DNA内切酶XbaⅠ和SacⅠ对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到线性的T2(2)-ori质粒，并回收线性的T2(2)-ori质粒。

其中，质粒T2(2)-ori的构建方法为：将来自pE194质粒的194-ori、来自于pDG780质粒的卡那霉素抗性基因、来自质粒pBluescript II SK(+)-X52328的pUC-ori通过PCR反应扩增，并回收、酶切。按照194-ori，卡那霉素抗性基因，pUC-ori的顺序连接。此构建方法参考文献下述文献：郭兴华,熊占等(1991)枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.生物工程学报7(3):224-229和彭清忠,张惟材等(2002)短短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建.生物工程学报18(4):438-441。

双酶切体系的组成成分为：XbaⅠ3ul、SacⅠ3ul、10×M buffer6ul、质粒T2(2)-ori20ul，补水至总体积60ul。双酶切体系的反应条件为：37℃8小时。

2、步骤2)的具体操作步骤为：

以原始地衣芽孢杆菌DW2(简称：Bacillus licheniformis DW2)的基因组DNA为模板，以上游同源臂引物进行PCR扩增，得到上游同源臂，并回收上游同源臂。其中，在此PCR扩增体系中，采用的上游同源臂引物为，

上游同源臂引物1：

xpf上-F：CTAGTCTAGAGGTTTCCTTATTCCAGCGG、

上游同源臂引物2：

xpfsoe-R：GCCCGTTTCACATTGGTTTCAGCCGCACAGTAAGATG。

采用的PCR扩增体系的组成成分为：Buffer5ul、dNTP2.5ul、Fastpfu0.5ul、上游同源臂引物11ul、上游同源臂引物21ul、Bacillus licheniformis DW2基因组DNA1ul、水14ul。采用的PCR扩增体系的反应条件为：95℃5min；95℃30sec；55℃30sec；72℃30sec；循环30次；72℃5min；10℃5min。

同时，以原始地衣芽孢杆菌DW2(简称：Bacillus licheniformis DW2)的基因组DNA为模板，以下游同源臂引物进行PCR扩增，得到下游同源臂，并回收下游同源臂。其中，在此PCR扩增体系中，采用的下游同源臂引物为，

下游同源臂引物1：

xpfsoe-F：CATCTTACTGTGCGGCTGAAACCAATGTGAAACGGGC、

下游同源臂引物2：

xpf下-R：CGAGCTCTTTATCGCTGCTTGGGTA。

采用的PCR扩增体系的组成成分和反应条件与上游同源臂的PCR扩增体系相同。

3、步骤3)的具体操作步骤为：

以上、下游同源臂为模板进行重叠延伸PCR(简称：soe-PCR)，得到上、下游同源臂融合DNA片段，并回收上、下游同源臂融合DNA片段。其中，soe-PCR体系所采用的引物为,

上游同源臂引物1：

xpf上-F：CTAGTCTAGAGGTTTCCTTATTCCAGCGG、

下游同源臂引物2：

xpf下-R：CGAGCTCTTTATCGCTGCTTGGGTA。

soe-PCR体系的反应条件为：95℃5min；95℃30sec；50℃30sec；72℃30sec；循环8次；72℃5min；95℃30sec；55℃30sec；72℃1min；循环30次；72℃5min；10℃5min。

4、步骤4)的具体操作步骤为：

采用DNA内切酶XbaⅠ和SacⅠ对上、下游同源臂融合DNA片段进行限制性双酶切，双酶切体系的组成成分为：上、下游同源臂融合DNA片段40ul，其他的双酶切体系的组成成分以及反应条件均与步骤1)的双酶切相同，回收酶切产物，并将酶切产物与线性的T2(2)-ori质粒连接，连接体系的组成成分为T2(2)-ori双酶切回收产物1ul、上下游同源臂融合片段双酶切回收产物3ul、10×T4DNA ligase buffer1ul、T4DNA ligase0.5ul、水4.5ul。连接条件为：温度16℃，时间12小时。最终得到已敲除xpf基因的质粒T2(2)-ori-xpf，并回收质粒T2(2)-ori-xpf。其中，质粒T2(2)-ori-xpf质粒结构示意图如图1所示。

在图1中，pUC-ori为质粒在大肠杆菌中的复制子；kan为卡那霉素抗性基因；194-ori为质粒在芽孢杆菌中的复制子；SacⅠ为DNA限制性内切酶名称，表示此处有此酶的酶切位点；XbaⅠ为DNA限制性内切酶名称，表示此处有此酶的酶切位点；xpf-R为用于xpf基因敲除的下游同源臂；xpf-F为用于xpf基因敲除的上游同源臂。

T4DNA ligase为商用的DNA连接酶，10×T4DNA ligase buffer为配套的连接酶缓冲液。T4DNA ligase以及10×T4DNA ligase buffer均购自宝生物工程(大连)有限公司。

5、步骤5)的具体操作步骤为：

首先，制备大肠杆菌感受态细胞，具体步骤为：将大肠杆菌菌种从甘油管以体积比1％接种于5ml LB培养基，于37℃，250r/min振荡培养过夜；1％接种于50mL LB培养基，37℃振荡培养2-4h；将菌液置冰上10min，使菌液冷却，倒入50mL离心管中，4℃5000r/min离心3min，弃上清；用20mL预冷的CaCl₂(0.1mol/L)洗涤沉淀，4℃5000r/min离心3min，弃上清；用1.5mL预冷的CaCl₂(0.1mol/L)重悬沉淀，分装于无菌1.5mL离心管中，置-70℃保存备用。

其次，将质粒T2(2)-ori-xpf转入大肠杆菌感受态细胞中，具体步骤为：取100-200μL大肠杆菌感受态细胞与连接产物(即质粒T2(2)-ori-xpf)混合，冰上吸附15min；将离心管放到42℃循环水浴中热激90s；快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却5min；每管加800μL LB培养基，37℃，150r/min培养45min；取200μL涂平板，用无菌的涂布棒将菌液均匀涂满整个平板表面；平板37℃培养，正置30min后倒置培养12-16h，可出现菌落。

然后，对大肠杆菌中的质粒T2(2)-ori-xpf进行提取，具体步骤为：5mL菌液，离心收集，用STE洗涤一次，加入100mL SolutionⅠ溶液重悬菌体，置于冰上5min；加入200mL SolutionⅡ，快速颠转混匀，置于冰上5min；加入150mL SolutionⅢ混匀，置于冰上5min；12000r/min离心5min，取上清；加入500mL苯酚/氯仿震荡，12000r/min离心5min，取上清；加入2倍无水乙醇-20℃沉淀2h，12000r/min离心5min，弃上清；沉淀用70％乙醇洗一遍，去上清，干燥后溶于20-40mL RNase(20μg/mL)中。

进一步，制备地衣芽孢杆菌感受态细胞：原始地衣芽孢杆菌菌株Bacilluslicheniformis DW2于5mL的LB培养基中，37℃，200r/min过夜培养；菌液用生长培养基稀释20倍后，37℃，200rpm～250rpm，培养2～3h后OD₆₀₀达到0.5～1.0；将菌液放置于冰上，预冷10min，倒入50mL离心管中，置冰上放置15min后，4℃5000g离心5min，收集菌体；用预冷的电转化培养基(具体配方)重悬沉淀，洗涤菌体4次；用1/40体积的电转化培养基悬浮菌体，分装于1.5mL无菌离心管(约60μL/管)，即为感受态细胞。

最后，将质粒T2(2)-ori-xpf转入原始地衣芽孢杆菌感受态细胞内，具体步骤为：60uL感受态细胞加1ul质粒T2(2)-ori-xpf(50ng/uL)于预冷的2mm电转杯中放置1～1.5分钟；电击21kV/cm,时间4.5～5ms；立即加入1mL恢复培养基；37℃培养3h后，涂布含卡那霉素的LB平板，过夜培养。

对转化子进行PCR(聚合酶链式反应)鉴定，具体步骤为：在筛选到具有卡那霉素抗性的地衣芽孢杆菌菌株中，挑取转化子1、2，抽提质粒DNA，利用引物：

T2bamH1-L：ATGTGATAACTCGGCGTA

T2xba1-R：GCAAGCAGCAGATTACGC

进行PCR扩增验证。PCR反应条件：95℃，5min；95℃30sec；55℃50sec；72℃1min；30个循环；72℃，10min。对转化子质粒DNA的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，将其扩增产物可在1.3kb处出现条带的的转化子菌株命名为地衣芽孢杆菌DW2(T2(2)-ori-xpf)[简称Bacillus licheniformisDW2(T2(2)-ori-xpf)]。

6、步骤6)的具体操作步骤为：

将地衣芽孢杆菌DW2(T2(2)-ori-xpf)接种于5ml LB液体培养基中，加入5ul20ug/ml的卡那霉素，在45℃培养摇床振荡培养12h，并将上述培养的菌液在卡那霉素抗性的LB固体平板上划单菌落，于45℃培养挑取上述划出的单菌落分别在5ml液体LB中进行培养，并以培养出的菌液为模板进行PCR，引物为：

T2bamH1-L：ATGTGATAACTCGGCGTA、

xpf验-R：ACATCCATCGCCTCAACG；

PCR反应条件为95℃10min；95℃30sec；55℃50sec；72℃1min；30个循环；72℃，10min。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(如图2所示)。在图2中，图2中泳道1-8分别为转化子1～3的菌落PCR验证条带；泳道M为DNA ladder(即标准DNA混合物)，泳道M从下至上条带所对应的相对分子量依次为：100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、5000bp；泳道1～2以及4～8(对应转化子1～2以及4～8)均出现了1.8kb左右的电泳条带，与上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换后的DNA序列长度一致，即转化子1～2以及4～8为上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的单交换菌株；泳道3出现了1.3kb左右的电泳条带，与下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换后的DNA序列长度一致，即转化子3为下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的单交换菌株。

最后，选取上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的2号转化子菌株和下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的3号转化子菌株进行双交换筛选。

7、步骤7)的具体操作步骤为：

将上述两株单交换菌株(2号菌株和3号菌株)混合接种于5ml液体LB培养基中，37℃振荡培养12h,再转接与5ml液体LB培养基中，37℃振荡培养12h；取上述菌液进行稀释，然后涂布与固体LB平板上，37℃培养16h，使其长出单菌落；将上述单菌落用无菌牙签挑起，分别点种到卡纳霉素抗性平板和LB平板上的对应位置，37℃培养16h；挑取在LB平板上生长，而在卡纳霉素抗性平板上不生长的菌落，然后以引物：

xpf验-F：CGTCAGAACAAATAGCGACC、

xpf验-R：ACATCCATCGCCTCAACG；进行PCR验证，PCR反应条件为：

95℃10min；

95℃30sec，55℃50sec，72℃1min，

30个循环；

72℃10min；

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(如图3所示)。在图3中，图3中泳道1～2分别为转化子1～2的菌落PCR验证条带；泳道M为DNA ladder(即标准DNA混合物)，此处的DNA ladder与步骤6)中的DNA ladder相同，从图3可看出，泳道1和2均出现了1.2kb左右的电泳条带，与xpf基因成功敲除的菌株的DNA序列长度一致，因此，转化子1和2为xpf基因成功敲除的菌株，因此，命名为地衣芽孢杆菌DW2△xpf(简称Bacillus licheniformis DW2△xpf)。

一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株的应用，其应用于抗菌肽生产，应用步骤为：

采用高效液相色谱法测定发酵液中杆菌肽效价。高效液相色谱测定中的样品制备步骤为：取发酵液2.0mL于10mL的离心管中，加入等体积无水乙醇，充分混合，10000r/min离心10min，取上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤后用于测定杆菌肽的色谱效价。高效液相色谱测定中的标准品制备的步骤为：取4gEDTA用蒸馏水定容到100mL，用NaOH调至pH7.0；取0.1g杆菌肽锌标准品溶于10mL EDTA溶液，用EDTA溶液做稀释，制备不同浓度的标准品溶液。高效液相色谱测定中的流动相配置为：溶液A：称取3.48g K₂HPO₄，溶于100mL蒸馏水；称取13.6g KH₂PO₄，溶于500mL蒸馏水；将2加入1中，调节至pH6.0；取100mL3溶液，加入300mL蒸馏水；溶液B：650mL甲醇(色谱纯)+50mL乙腈(色谱纯)；将溶液A和B按350：650的体积混合制备成流动相，并真空抽滤除菌；色谱条件为色谱柱：大连伊利特BDS C18柱(4.6mm×250mm，5μm)、柱温：35℃、流速：1.0mL/min、检测波长：254nm、进样量：20μL。

发酵液杆菌肽效价的具体计算方式为：首先，测定单位体积效价数，即单位体积效价(U/ml)＝杆菌肽标准品的效价(U/mg)*称取的杆菌肽标准品质量(mg)/杆菌肽标准品溶液的体积(ml)；然后，根据公式：发酵液的效价＝发酵液液相测量的峰面积*单位体积效价*稀释倍数/杆菌肽标准品峰面积，计算出发酵液的效价。其中，采用本发明所构建的地衣芽孢杆菌DW2△xpf进行发酵产生的发酵液的抗菌肽效价为938.5±43.03(U/mL)，比采用原始地衣芽孢杆菌DW2进行发酵产生的发酵液的抗菌肽效价871.2±34.2(U/mL)提高了7.7％。

Claims

1.一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2△ xpf （简称：Bacillus licheniformis DW2△xpf），该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO ：M 2013403，保藏日期为2013年9 月10日。

2.一种权利要求1所述的敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：（1）采用限制性DNA内切酶XbaⅠ和SacⅠ对质粒T2（2）-ori进行双酶切，得到线性的T2（2）-ori质粒；（2）以原始地衣芽孢杆菌DW2（简称：Bacillus licheniformis DW2）的基因组DNA为模板，分别以上、下游同源臂引物进行PCR扩增，分别得到上、下游同源臂；（3）以上、下游同源臂共同作为模板进行soe-PCR，得到上、下游同源臂融合DNA片段；（4）采用DNA内切酶XbaⅠ和SacⅠ对上、下游同源臂融合DNA片段进行双酶切，并将酶切后的上、下游同源臂融合基因片段与线性的T2（2）-ori质粒连接，得到已敲除xpf基因的质粒T2（2）-ori-xpf；（5）将质粒T2（2）-ori-xpf转入原始地衣芽孢杆菌DW2，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到成功转化的地衣芽孢杆菌 (T2（2）-ori-xpf) [简称：Bacillus licheniformis (T2（2）-ori-xpf)]；（6）将Bacillus licheniformis (T2（2）-ori-xpf)经过45℃和卡那霉素抗性筛选得到上游臂或下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的单交换菌株；（7）单交换菌株再通过卡那霉素抗性筛选得到敲除xpf基因的地衣芽孢杆菌DW2△xpf （简称：Bacillus licheniformis DW2△xpf）。

3.一种权利要求1所述的敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株的应用，其应用于抗菌肽生产，应用步骤为：

A菌种活化，菌种活化培养基配方为（g/L）：酵母粉3~7、蛋白胨8~12、NaCl 9~13，pH 7.0-7.4，培养条件为将权利要求1所述的地衣芽孢杆菌DW2△ xpf以体积百分比1%接种于装有5~8ml 菌种活化培养基的PA瓶中，180～300rpm，33~37℃，10～14h，得到含有地衣芽孢杆菌DW2△xpf的菌液；

B摇瓶发酵，摇瓶发酵培养基配方为（g/L）：豆粕 8~12%、玉米淀粉 4~5%、CaCO₃ 0.5~0.8%、(NH₄)₂SO₄0.08~0.13%；向三角瓶中加入20~40 mL的摇瓶发酵培养基，将步骤A的含有地衣芽孢杆菌DW2△xpf的菌液以体积百分比2~5% 接种于三角瓶内的摇瓶发酵培养基中，150~200r/min，33~37℃培养46~48 h，得到发酵液。