CN106434727B - 一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株构建方法及其应用 - Google Patents

一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建及其应用。本发明通过向简单节杆菌中导入基因片段，获得了高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株；实验证实，利用本发明所提供的构建方法获得的工程菌株对甲醇和乙醇的耐受性明显提高。利用本发明获得的高有机溶剂耐受性的工程菌株进行甾体C1,2脱氢反应，体系中有机溶剂的添加量提高了1倍，底物的投料浓度提高了3倍，产物的生成量也均有不同程度的提高；这种高有机溶剂耐受性转化工程菌株的构建及其应用，可以提高转化体系中有机溶剂的添加量，进而提高底物的投料浓度，提高产物的生成量，对于甾体类疏水性化合物高浓度底物转化效率的提高具有重要的应用价值。

Description

一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株构建方法及其 应用
技术领域
本发明属于基因工程和微生物转化领域，尤其是涉及一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建及该菌株在甾体化合物转化，如A环C1,2脱氢反应中的应用。
背景技术
甾体类药物具有重要的生理活性，是仅次于抗生素的第二大类药物。C1,2位脱氢反应是工业化生产氢化泼尼松及其同系物最有价值的一个反应，也是甾体药物工业上采用转化法生产的典型代表。甾体药物母核发生C1,2位引入双键后可成倍地增加其抗炎活性，醋酸可的松的C1,2位导入双键后生成醋酸泼尼松，抗炎能力能够提高3-4倍，并且减少由钠滞留带来的副作用。简单节杆菌(Arthrobacter simplex)催化的C1,2脱氢反应是工业生产醋酸泼尼松及其同系物最有价值的一种反应，也是采用发酵法工业生产甾体类药物的典型代谢。然而，甾体类化合物较差的水溶性(溶解度一般为10-5-10-6mol/L)限制了底物与胞内生物酶的有效接触，这一问题已成为限制催化反应效率的关键瓶颈。
研究者采用了很多方法提高底物的溶解度，如底物微粒化、环糊精包合、浊点系统和离子液体等，这些方法有的操作繁琐，有的成本较高。目前为止，添加有机溶剂是工业上甾体生物合成工艺中普遍用来改善底物溶解性的方法。但有机溶剂的添加，尤其是高剂量的有机溶剂会对微生物细胞产生毒害作用，进而影响全细胞的生物催化效率，有机溶剂的用量受到严格控制，这大大限制了转化体系中底物的投料量，最终影响产率。为了突破这一瓶颈，迫切的需要构建高有机溶剂耐性的微生物菌株。
IrrE是来源于耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)R1的一个调节蛋白，对细胞的代谢网络具有重要的调控作用。研究者发现将该基因导入大肠杆菌中能够显著提高其辐射抗性、氧化抗性和耐盐能力。
相容性溶质是微生物应对环境胁迫而产生的重要保护物质，它能够使植物和微生物耐受多种环境胁迫(如高盐、低温、干旱和有毒物质等)，其中海藻糖是生物界分布最广的相容性溶质之一。海藻糖是一种非常重要的天然代谢产物，非还原性糖，由两分子葡萄糖基(α-D-吡喃葡糖-1-1α-D-葡萄糖苷)组成。研究发现海藻糖不仅可以作为能源物质，还可作为细胞在压力环境下的保护剂。海藻糖通过维持细胞膜的稳定性，保护细胞内大分子蛋白和核酸的结构等途径使细胞免受外界环境压力(如热激，乙醇，高渗，干旱等)的破坏。
目前尚未发现利用irrE基因、海藻糖合成基因otsA和otsB表达构建高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株，以及利用该工程菌株进行C1,2脱氢反应的方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株构建方法及其应用。
本发明采用的技术方案是：一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法，通过转基因技术将基因片段转入到宿主菌中，获得高有机溶剂耐受性的工程菌株，所述宿主菌为简单节杆菌。
优选的，基因片段为全局转录因子或功能基因中的一种。
优选的，全局转录因子为irrE基因，核苷酸序列如SEQ ID：3所示。
优选的，功能基因为相容性溶质的合成基因，所述相容性溶质的合成基因为海藻糖合成基因，所述海藻糖合成基因为otsA基因或otsB基因中的一种，otsA基因核苷酸序列如SEQ ID：6所示，otsB基因核苷酸序列如SEQ ID：9所示。
一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法，构建方法步骤如下：
步骤一：根据基因序列信息设计上游引物和下游引物，利用所述上游引物与所述下游引物进行PCR扩增获得基因序列。
步骤二：通过双酶切法获得所用的基因片段和质粒pART2进行连接，连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态中，获得重组质粒。
步骤三：制备宿主菌感受态细胞，通过电转化的方法将所述重组质粒转入到宿主菌感受态细胞中，筛选后获得高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株。
其中，步骤三中所述宿主菌感受态细胞制备过程如下：
挑取简单节杆菌接种于LB液体培养基中，震荡培养菌体形成菌液，加入细胞壁处理剂处理，震荡后，将装有菌液的容器置于冰浴上冷却，离心后弃上清；加预冷的电击缓冲液洗涤菌体，离心后弃上清；洗涤后加入电击缓液重悬菌体，摇匀，形成简单节杆菌感受态细胞，保存待用；
优选的，挑取简单节杆菌接种于LB液体培养基中，30-36℃、150-250r/min震荡培养20-36h，至菌体OD600为1.5-3.0形成种子液，取1mL种子液接入装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，30-36℃、150-250r/min培养6-12h，至OD600为0.8-1.5，加入细胞壁处理剂振荡处理0.5-4h后，将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却10-20min，4℃下5000-7000r/min离心5-15min，弃上清；加25-50mL预冷至0℃的电击缓冲液洗涤菌体后，4℃下5000r/min离心10min，弃上清；重复洗涤两次后，加入0.5-1.5mL电击缓液重悬菌体，摇匀，获得简单节杆菌感受态细胞，于-80℃保存待用。
其中，电击缓冲液由10-15％甘油和0.5-1.0mol/L山梨醇组成。
所述电转化方法步骤如下：
取简单节杆菌感受态细胞，加入构建好的所述重组质粒，混合均匀后转移到预冷的电脉冲杯内冰浴；打开电脉冲仪电击转化；电激后立即向电脉冲杯内加入无菌复苏培养基，混匀后缓慢振荡培养，涂布到选择平板上，倒置培养，筛选获得含有重组质粒的基因工程菌株；
优选的，取70-150μL简单节杆菌感受态细胞于1.5mL离心管中，加入10-50μL构建好的重组质粒，混合均匀后转移到预冷的电脉冲杯内冰浴1-5min；打开电脉冲仪，0.8-1.5kV电击转化；电激后立即向电脉冲杯内加入0.8-1.5mL无菌复苏培养基，混匀后，30-36℃缓慢振荡培养8-12h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的选择平板上，30-36℃倒置培养48-96h，获得含有重组质粒的工程菌株。
其中，复苏培养基是含有0.5-1.0moL/L山梨醇的LB液体培养基。
优选的，所述细胞壁处理剂为青霉素G、溶菌酶、苏氨酸和甘氨酸中的一种。
其中，青霉素G浓度为10-200μg/mL。
其中，溶菌酶浓度为10-40ug/mL。
其中，苏氨酸浓度为0.5-4.0％。
其中，甘氨酸浓度为0.5-4.0％。
利用一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法构建得到的高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株。
优选的，高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株为irrE工程菌株、otsA工程菌株和otsB工程菌株中的一种。
高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株在甾体类化合物生物转化中的应用。
优选的，高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株在甾体类化合物生物转化中的反应为甾体A环的C1,2脱氢反应，反应环境中的有机溶剂为甲醇或乙醇中的一种，优选乙醇，所述甾体类化合物为醋酸可的松。
附图说明
图1为本发明所构建载体pART2-irrE验证结果，其中a：质粒PCR；b：酶切产物；M：DNA Marker；0：质粒pART2；1：重组质粒pART2-irrE；2：重组质粒pART2-irrE的BamH I/XbaI双酶切产物
图2为本发明构建的irrE工程菌株与对照菌株的蛋白SDS-PAGE电泳图，其中M：蛋白Marker；1：对照菌株的全蛋白；2；对照菌株经his纯化后的蛋白；3；irrE工程菌株的全蛋白；4；irrE工程菌株经his纯化后的蛋白
图3为本发明构建的irrE工程菌株与对照菌株的蛋白Western blot图；其中1：对照菌株；2：irrE工程菌株。
图4为本发明所构建的irrE工程菌株与对照菌株在不同浓度乙醇和甲醇压力下培养46h的相对OD600值；其中1：对照菌株；2：irrE工程菌株。
图5为本发明所构建的irrE工程菌株与对照菌株16％乙醇冲击1h后的存活率；其中，1：对照菌株；2：irrE工程菌株。
图6为本发明所构建载体pART2-otsA和pART2-otsB验证结果，其中a：pART2-otsA质粒PCR；b：pART2-otsA双酶切；c：pART2-otsB质粒PCR；d：pART2-otsB双酶切。M：DNAMarker；1：重组质粒pART2-otsA的PCR产物；2：重组质粒pART2-otsA的BamH I/Xba I双酶切产物；3：重组质粒pART2-otsB的PCR产物；4：重组质粒pART2-otsB的BamH I/Xba I双酶切产物。
图7为本发明构建的otsA工程菌株、otsB工程菌株与对照菌株在细胞生长不同时期的胞内海藻糖含量；其中1：对照菌株；2：otsA工程菌株；3：otsB工程菌株。
图8为本发明所构建的otsA工程菌株和otsB工程菌株与对照菌株在4％乙醇和6％甲醇压力下培养不同时间的相对OD600值；其中a：4％乙醇压力下的菌体相对OD600值；b：6％甲醇压力下的菌体相对OD600值；1：对照菌株；2：otsA工程菌株；3：otsB工程菌株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
以下实验所用主要材料来源：大肠杆菌DH5α菌株、核酸操作工具酶来自宝生物工程(大连)有限公司，引物合成、核苷酸序列人工合成以及基因测序委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成；PVDF膜用His探针抗体为His-probe Antibody(H-15)，Santa公司)，H-15；羊抗兔二抗(Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Secondary Antibody)来自Invitrogen公司，
本发明涉及一种高有机溶剂耐受性工程菌株的构建方法，通过转基因技术将基因片段转入到宿主菌中，获得高有机溶剂耐受性工程菌株，本发明涉及的外源基因为全局转录因子irrE，海藻糖合成基因，otsA基因或otsB基因，宿主菌为简单节杆菌(Arthrobactersimplex)，菌种编号为(ACCC 12070)。
实施例1 irrE工程菌株的构建及应用
1制备含有重组质粒pART2-irrE的基因工程菌
(1)重组质粒pART2-irrE的构建
以耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)(购自中国普通微生物菌种保藏中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。菌种编号:1.633)基因组为模板，利用引物irrE3-F(如SEQ ID：1所示)和irrE3-R(如SEQ ID：2所示)进行PCR，扩增获得耐辐射异常球菌全局转录因子irrE(如SEQ ID：3所示)基因序列，
SEQ ID：1 cgggatccca gtgccaacgt cagccc
SEQ ID：2 tgctctagac tgtgcagcgt cctgcg
PCR反应体系如下：
Figure BDA0001122232290000051
PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃30s，63℃30s，72℃90s，30个循环后72℃10min。
全局转录因子irrE序列和质粒pART2分别用限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ处理(37℃，4h)，利用PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)分别回收目的片段，将酶切后的质粒和全局转录因子irrE序列按1:3(物质的量之比)的比例进行连接反应(16℃，12h)；连接产物转入大肠杆DH5α，经筛选获得重组质粒pART2-irrE。
获得的重组质粒pART2-irrE用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后经琼脂糖凝胶电泳进行验证，验证结果如图1所示。
(2)irrE工程菌株的获得
①感受态细胞的制备：
挑取简单节杆菌接种于LB液体培养基中，34℃、220r/min震荡培养30h，至菌体OD600为2.5形成种子液，取1mL种子液接入装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，34℃、220r/min培养10h，至OD600为1.2，加入细胞壁处理剂青霉素G(浓度为10-200μg/mL)振荡处理0.5-2h后，将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却15min，4℃下6500r/min离心12min，弃上清；加40mL预冷至0℃的电击缓冲液洗涤菌体后，4℃下5000r/min离心10min，弃上清；重复洗涤两次后，加入1.2mL电击缓液重悬菌体，摇匀，获得简单节杆菌感受态细胞，于-80℃保存待用。
其中，电击缓冲液由14％甘油和0.9mol/L山梨醇组成。
其中，细胞壁处理剂青霉素G添加量与震荡处理时长安排如下表所示：
Figure BDA0001122232290000052
②重组质粒pART2-irrE的电激转化
取120μL简单节杆菌感受态细胞于1.5mL离心管中，加入40μL构建好的重组质粒pART2-irrE，混合均匀后转移到预冷的电脉冲杯内冰浴3min；打开电脉冲仪，1.2kV电击转化；电激后立即向电脉冲杯内加入1.2mL无菌复苏培养基，混匀后，34℃缓慢振荡培养11h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的选择平板上，34℃倒置培养80h，获得含有重组质粒pART2-irrE的工程菌株，即irrE工程菌株。
其中，复苏培养基是含有0.8moL/L山梨醇的LB液体培养基。
2 全局转录因子IrrE的表达
(1)菌体培养
分别从斜面挑取irrE工程菌株(含有重组质粒pART2-irrE)和对照菌株(含有空质粒)接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养40h。以4％(v/v)的接种量转接入新鲜的LB液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养至菌液OD600约为4.0。实验中含质粒菌株培养基中还需添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素。
其中，LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
(2)蛋白纯化
将上述培养液置于冰上至少10min，然后7000g，4℃离心15min，收集菌体。用冷却的PBS缓冲溶液洗涤两次，加入10mL菌体破碎液涡旋振荡重悬菌体。将重悬后的菌体在冰浴条件下超声破碎，破碎程序为：破碎功率450W，时间3:3(s/s)超声约60min，直至菌液透亮，7000r/min，4℃离心10min，收集上清中的可溶性蛋白，将菌体裂解液稀释后负载到His纯化柱上，流速为1.0mL/min收集流穿液。用Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。使用Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰即为蛋白峰。将收集到的蛋白峰，按比例加入5倍蛋白上样缓冲液，混匀后沸水浴5min，以蛋白凝胶每孔30uL蛋白样品的量上样；在浓缩胶和分离胶中分别用8V/cm和12V/cm进行电泳，当溴酚蓝条带接近分离胶末端时停止；将蛋白胶转入染色槽中，加入考马斯亮蓝染色液，缓慢震荡染色2h以上，以达到充分染色。染色结束后，冲洗掉多余的染色液，加入脱色液，缓慢震荡脱色约2h，直至条带清晰。irrE工程菌株与对照菌株全蛋白经过HIS纯化后蛋白的SDS-PAGE电泳图见图2。
其中，菌体破碎液组成：5mL PBS缓冲液，100μL的PMSF，500μL甘油，2mL 0.5mol/L的NaCl，50μL 20mg/mL溶菌酶。
(3)Western Blot实验
蛋白凝胶电泳后，将蛋白凝胶从电泳槽上取下，去除浓缩胶和多余部分，用转膜仪将蛋白转移到硝酸纤维素膜(PVDF)上，将转印的PVDF膜放置到ddH2O中漂洗1-2min，洗去膜上的转膜液，用5％脱脂奶粉(用TBST配制)封闭，置于水平摇床上缓慢摇动，室温封闭2h。弃除封闭液，PVDF膜用His探针抗体4℃过夜孵育。再根据一抗选择相应的羊抗兔二抗，在室温下二抗孵育2h，孵育完成后用TBST清洗干净。用扫膜仪将洗干净的PVDF膜置于暗室中用扫膜以进行扫描。Western Blot结果如图3所示。
由图2和图3可知，与对照菌株相比，irrE工程菌株在35KDa处出现了一条明显的差异条带，其大小与irrE的理论大小相符，这说明全局转录因子irrE已在简单节杆菌中成功表达。
3 irrE工程菌株有机溶剂耐受性的分析
(1)irrE工程菌株在不同浓度甲醇及乙醇压力下的生长情况
分别从斜面挑取irrE工程菌株和对照菌株接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min下振荡培养40h，以一定的接种量转接入含有不同浓度甲醇(4％、6％、8％)和乙醇(2％、4％、6％)的新鲜LB液体培养基中，并将初始OD600值调为相同(均为0.2)，32℃，160r/min震荡培养46h后取样测定OD600值，并计算相对OD 600值(相对OD600＝有机溶剂压力下的菌液OD600/无压力下的菌液OD600)。实验中含质粒菌株培养基中还需添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素。由图4可知，与对照菌株相比，irrE工程菌株在2％、4％和6％乙醇压力下培养46h后的相对OD600值分别提高14.9％、73.9％和90.0％；4％和6％甲醇压力下培养46h后的相对OD600值分别提高21.1％和13.9％，这说明重组表达的irrE工程菌株对甲醇和乙醇的耐受性均明显提高。
(2)irrE工程菌株在高浓度乙醇冲击下的存活情况
分别从斜面挑取irrE工程菌株和对照菌株接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min下振荡培养40h，以一定的接种量转接入新鲜的LB液体培养基中，并将初始OD600值调为相同(均为0.2)，32℃，160r/min振荡培养到各自的对数中后期。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体用新鲜的LB液体培养基悬浮并将菌液的OD600值均调节至1.0，然后加入16％乙醇冲击1h。将冲击后的培养液采用10倍逐级稀释法在LB平板上涂布，32℃培养一定时间后观察平板上的菌落数并计算存活率。实验中含质粒菌株培养基中还需添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素。
存活率计算方法如下：
存活率(％)＝菌株压力条件下的菌落数/菌株无压力条件下的菌落数×100％
由图5可知，经过16％乙醇冲击1h后，irrE工程菌株的存活率为69％，比对照菌株提高了2倍。
4 irrE工程菌株转化醋酸可的松能力的测定
(1)静息细胞的制备
分别从斜面挑取irrE工程菌株和对照菌株接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养40h，以一定的接种量转接到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，初始OD600值调整为0.2，32℃，160r/min振荡培养至对数生长期，分别加入终浓度为0.5g/L的底物醋酸可的松(CA)诱导C1,2位脱氢酶产生，32℃，160r/min继续振荡培养18h至各个菌株的对数中后期。培养液经4℃，7000r/min离心10min，收集的菌体用预冷的pH 7.2的0.1M的KH2PO4-NaOH溶液(PBS缓冲溶)洗涤2次，将菌体悬浮于适量的PBS缓冲液中制备得到静息细胞。实验中含质粒菌株培养基中还需添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素。
(2)不同转化体系下全细胞转化效率
利用上述静息细胞制备30mL的转化体系。
转化体系I-低底物浓度和助溶剂转化体系：菌体OD600为2.0，底物CA浓度为2g/L，4％乙醇助溶；
转化体系II-高底物浓度和助溶剂体系：菌体OD600为2.0，底物CA浓度为8g/L，8％乙醇助溶。
上述两个体系在34℃，180r/min振荡转化10h后，取样测定产物醋酸泼尼松(PA)的浓度。每次取样0.4mL加入0.8mL乙酸乙酯终止反应，超声萃取10min以上，12000r/min离心10min，吸取100μL上清液于新的1.5ml离心管中，在通风橱中过夜挥发，再用1ml流动相复溶，通过HPLC法测定产物的生成量。
HPLC检测条件为：
高效液相色谱仪：Agilent 1100Series LC(G1314Pump,G1322ADEGASSERG1314VWD检测器，20μL AN进样器，HP ChemStation)；
色谱柱：Kromasil 100-5SIL 250mm×4.6mm×5μm；
流动相：二氯甲烷:乙醚:甲醇(体积比86:12:2)，0.45μm微孔滤膜过滤；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测器：UV Detector，波长：240nm。
进样量：20μL
表1 irrE工程菌株与对照菌株转化醋酸可的松生成醋酸泼尼松的转化结果比较
Figure BDA0001122232290000081
由表1可知，利用本发明获得的高有机溶剂耐受性的irrE工程菌株进行甾体C1,2脱氢反应，体系中乙醇浓度由4％增加到8％时，底物CA的投加量提高了3倍，转化10h后产物PA的生成量由原来的1.61g/L增加到6.39g/L，提高了约3倍，而对照菌株此时的PA生成量为工程菌株的53.3％，仅为3.41g/L。
实施例2：otsA工程菌株的构建及应用
1制备含有重组质粒pART2-otsA的基因工程菌
(1)重组质粒pART2-otsA的构建
以简单节杆菌(Arthrobacter simplex)ACCC 12070基因组为模板，利用引物otsA-F(如SEQ ID：4所示)和otsA-R(如SEQ ID：5所示)进行PCR，扩增获得简单节杆菌海藻糖合成基因otsA基因序列(如SEQ ID：6所示)，
SEQ ID：4 cgggatccag tgggccatga cctcgtgatc
SEQ ID：5 tgctctagat caggagcgtg ttgctggtcg
PCR反应体系如下：
Figure BDA0001122232290000091
PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃30s，63℃30s，72℃90s，30个循环后72℃10min。
海藻糖合成基因otsA序列和质粒pART2分别用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ处理(37℃，4h)，利用PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)分别回收目的片段，将酶切后的质粒和海藻糖合成基因otsA序列按1:3(物质的量之比)的比例进行连接反应(16℃，12h)；连接产物转入大肠杆DH5α，经筛选获得重组质粒pART2-otsA。
获得的重组质粒pART2-otsA用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后经琼脂糖凝胶电泳进行验证，验证结果如图6所示。
(2)otsA工程菌株的获得
①感受态细胞的制备：
挑取简单节杆菌接种于LB液体培养基中，30℃、150r/min振荡培养20h，至菌液OD600为1.5形成种子液，取1mL种子液接入装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，30℃、150r/min培养6h，至OD600为0.8，加入细胞壁处理剂溶菌酶(浓度为10-40ug/mL)震荡处理0.5-1.5h后，将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却10min，4℃下5000r/min离心5min，弃上清；加25mL预冷至0℃的电击缓冲液洗涤菌体后，4℃下5000r/min离心10min，弃上清；重复洗涤两次后，加入0.5mL电击缓液重悬菌体，摇匀，获得简单节杆菌感受态细胞，于-80℃保存待用。
其中，电击缓冲液由10％甘油和0.5mol/L山梨醇组成。
其中，细胞壁处理剂溶菌酶添加量与震荡处理时长安排如下表所示：
Figure BDA0001122232290000101
②质粒pART2-otsA的电激转化
取70μL简单节杆菌感受态细胞于1.5mL离心管中，加入10μL构建好的重组质粒pART2-otsA，混合均匀后转移到预冷的电脉冲杯内冰浴1min；打开电脉冲仪，0.8kV电击转化；电激后立即向电脉冲杯内加入0.8mL无菌复苏培养基，混匀后，30℃缓慢振荡培养8h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的选择平板上，30℃倒置培养48h，获得含有重组质粒pART2–otsA的基因工程菌株，即过表达otsA简单节杆菌工程菌株。
其中，复苏培养基是含有0.5moL/L山梨醇的LB液体培养基。
2海藻糖合成基因otsA的表达
(1)菌体制备
分别从斜面挑取otsA工程菌株(含有重组质粒pART2-otsA)和对照菌株(含有空质粒)接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min，震荡培养至菌体的生长达到对数前期(32h)、对数中期(38h)和对数末期(48h)，5000r/min，4℃离心10min收集菌体，并用PBS洗涤一遍，将菌体放置-80℃冷冻24h后，真空冷冻干燥24h。
其中，LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
(2)海藻糖的提取
取0.05g冻干的菌体在室温下用研钵研碎，，加入500μL 0.5M预冷的三氯乙酸，置于冰上提取30min，其间每隔5分钟震荡5次，5000r/min室温离心10min，收集上清。
(3)海藻糖含量的测定
通过HPLC方法检测菌体内的海藻糖含量。HPLC检测条件为：
高效液相色谱仪：Agilent 1200型高效液相色谱仪，示差检测器；
色谱柱：Prevail Carbohydrate 250mm×4.6mm×5μm；
流动相：乙腈:H2O(体积比为85∶15)，0.45μm微孔滤膜过滤；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测器：RID Detector，检测器温度：35℃。
进样量：10μL
工程菌株和对照菌株在不同生长阶段时胞内海藻糖含量如图7所示，工程菌株otsA在对数生长不同时期胞内海藻糖均明显高于对照菌株，这说明海藻糖合成基因otsA已在简单节杆菌中成功过表达。
3 otsA工程菌株有机溶剂耐受性的分析
分别从斜面挑取otsA工程菌株和对照菌株接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养36h，以一定的接种量分别转接到含有4％乙醇和6％甲醇的新鲜LB液体培养基中，并将初始OD600值调为相同(均为0.13)，32℃，160r/min振荡培养，培养24h、48h和72h后分别取样测定OD600值，并计算相对OD 600值(相对OD600＝有机溶剂压力下的菌液OD600/无压力下的菌液OD600)。实验中含质粒菌株培养基中还需添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素。由图8可知，工程菌株otsA在4％乙醇压力下培养72h后的相对OD600值分别比对照菌株提高了16.7％；在6％甲醇压力下培养72h后的相对OD600值分别比对照菌株提高了82.9％。这说明otsA工程菌株对甲醇和乙醇的耐受性明显提高。
4 otsA工程菌株转化醋酸可的松能力的测定
分别从斜面挑取otsA工程菌株和对照菌株接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养36h，以一定的接种量转接到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，初始OD600值调整为0.13，32℃，160r/min震荡培养至对数生长期，分别加入终浓度为0.5g/L的底物醋酸可的松(CA)诱导C1,2位脱氢酶产生，32℃，160r/min继续振荡培养18h至各个菌株的对数中后期。培养液经4℃，7000r/min离心10min，收集的菌体用预冷的pH 7.2的0.1M的KH2PO4-NaOH溶液(PBS缓冲溶)洗涤2次，将菌体悬浮于适量的PBS缓冲液中制备得到静息细胞。实验中含质粒菌株培养基中还需添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素。
利用上述静息细胞制备30mL的转化体系。
转化体系I-低底物浓度和助溶剂转化体系：菌体OD600为2.0，底物CA浓度为2g/L，4％乙醇助溶；
转化体系II-高底物浓度和助溶剂体系：菌体OD600为2.0，底物CA浓度为8g/L，8％乙醇助溶。
上述两个体系在34℃，180r/min振荡转化12h后，取样测定产物醋酸泼尼松(PA)的浓度。每次取样0.4mL加入0.8mL乙酸乙酯终止反应，超声萃取10min以上，12000r/min离心10min，吸取100μL上清液于新的1.5ml离心管中，在通风橱中过夜挥发，再用1ml流动相复溶，通过HPLC法测定产物的生成量。
HPLC检测条件为：
高效液相色谱仪：Agilent 1100Series LC(G1314Pump,G1322ADEGASSERG1314VWD检测器，20μL AN进样器，HP ChemStation)；
色谱柱：Kromasil 100-5SIL 250mm×4.6mm×5μm；
流动相：二氯甲烷:乙醚:甲醇(体积比86:12:2)，0.45μm微孔滤膜过滤；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测器：UV Detector，波长：240nm。
进样量：20μL
表2 otsA工程菌株与对照菌株转化醋酸可的松生成醋酸泼尼松的转化结果比较
Figure BDA0001122232290000121
由表2可知，利用本发明获得的高有机溶剂耐受性的otsA工程菌株进行甾体C1,2脱氢反应，体系中乙醇浓度由4％增加到8％时，底物CA的投加量提高了3倍，工程菌株otsA转化12h后产物PA的生成量分别由原来的1.85g/L增加到2.78g/L，而对照菌株此时的PA生成量仅为2.35g/L，是工程菌株otsA的84.5％。
实施例3：otsB工程菌株的构建及应用
1制备含有重组质粒pART2-otsB的基因工程菌
(1)重组质粒pART2-otsB的构建
以简单节杆菌(Arthrobacter simplex)ACCC 12070基因组为模板，利用引物otsB-F(如SEQ ID：7所示)和otsB-R(如SEQ ID：8所示)进行PCR，扩增获得简单节杆菌海藻糖合成基因otsB基因序列(如SEQ ID：9所示)，
SEQ ID：7 cgggatccag tgaggttccc gacgcgcg
SEQ ID：8 tgctctagac tagccgagcc ggcggacc
PCR反应体系如下：
Figure BDA0001122232290000122
PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃30s，63℃30s，72℃90s，30个循环后72℃10min。
海藻糖合成基因otsB序列和质粒pART2分别用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ处理(37℃，4h)，利用PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)分别回收目的片段，将酶切后的质粒和海藻糖合成基因otsB序列按1:3(物质的量之比)的比例进行连接反应(16℃，12h)；连接产物转入大肠杆DH5α，经筛选获得重组质粒pART2-otsB。
获得的重组质粒pART2-otsB用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后经琼脂糖凝胶电泳进行验证，验证结果如图6所示。
(2)过表达otsB基因简单节杆菌工程菌株的获得
①感受态细胞的制备：
挑取简单节杆菌接种于LB液体培养基中，36℃、250r/min振荡培养36h，至菌液OD600为3.0形成种子液，取1mL种子液接入装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，36℃、250r/min培养12h，至OD600为1.5，加入细胞壁处理剂苏氨酸(浓度为0.5-4.0％)处理振荡2-4h后，将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却20min，4℃下7000r/min离心15min，弃上清；加50mL预冷至0℃的电击缓冲液洗涤菌体后，4℃下5000r/min离心10min，弃上清；重复洗涤两次后，加入1.5mL电击缓液重悬菌体，摇匀，获得简单节杆菌感受态细胞，于-80℃保存待用。
其中，电击缓冲液由15％甘油和1.0mol/L山梨醇组成。
其中，细胞壁处理剂苏氨酸添加量与震荡处理时长安排如下表所示：
Figure BDA0001122232290000131
②质粒pART2-otsB的电激转化
取150μL简单节杆菌感受态细胞于1.5mL离心管中，加入50μL构建好的重组质粒pART2-otsB，混合均匀后转移到预冷的电脉冲杯内冰浴5min；打开电脉冲仪，1.5kV电击转化；电激后立即向电脉冲杯内加入1.5mL无菌复苏培养基，混匀后，36℃缓慢振荡培养12h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的选择平板上，36℃倒置培养96h，获得含有重组质粒pART2–otsB的基因工程菌株，即过表达otsB基因简单节杆菌工程菌株。
其中，复苏培养基是含有1.0moL/L山梨醇的LB液体培养基。
2海藻糖合成基因otsB的表达
(1)菌体制备
分别从斜面挑取otsB工程菌株(含有重组质粒pART2-otsB)和对照菌株(含有空质粒)接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min震荡培养至菌体的生长达到对数前期(32h)、对数中期(38h)和对数末期(48h)，5000r/min，4℃离心10min收集菌体，并用PBS洗涤一遍，将菌体放置-80℃冷冻24h后，真空冷冻干燥24h。
(2)海藻糖的提取
取0.05g冻干的菌体在室温下用研钵研碎，加入500μL 0.5M预冷的三氯乙酸，置于冰上提取30min，其间每隔5分钟震荡5次，5000r/min室温离心10min，收集上清。
(3)海藻糖含量的测定
通过HPLC方法检测菌体内的海藻糖含量。HPLC检测条件为：
高效液相色谱仪：Agilent 1200型高效液相色谱仪，示差检测器；
色谱柱：Prevail Carbohydrate 250mm×4.6mm×5μm；
流动相：乙腈:H2O(体积比为85∶15)，0.45μm微孔滤膜过滤；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测器：RID Detector，检测器温度：35℃。
进样量：10μL
otsB工程菌株和对照菌株在不同生长阶段的胞内海藻糖含量如图7所示，工程菌株otsB在对数生长不同时期胞内海藻糖均明显高于对照菌株，这说明海藻糖合成基因otsB已在简单节杆菌中成功过表达。
3 过表达otsB基因简单节杆菌工程菌株有机溶剂耐受性的分析
分别从斜面挑取otsB工程菌株和对照菌株接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养36h，以一定的接种量分别转接到含有4％乙醇和6％甲醇的新鲜LB液体培养基中，并将初始OD600值调为相同(均为0.13)，32℃，160r/min振荡培养，培养24h、48h和72h后分别取样测定OD600值，并计算相对OD 600值(相对OD600＝有机溶剂压力下的菌液OD600/无压力下的菌液OD600)。实验中含质粒菌株培养基中还需添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素。由图8可知，工程菌株otsB在4％乙醇压力下培养72h后的相对OD600值分别比对照菌株提高了25.0％；在6％甲醇压力下培养72h后的相对OD600值分别比对照菌株提高了68.3％。这说明otsB工程菌株对甲醇和乙醇的耐受性明显提高。
4 过表达otsB基因简单节杆菌工程菌株转化醋酸可的松能力的测定
分别从斜面挑取otsB工程菌株和对照菌株接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养36h，以一定的接种量转接到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，初始OD600值调整为0.13，32℃，160r/min震荡培养至对数生长期，分别加入终浓度为0.5g/L的底物醋酸可的松(CA)诱导C1,2位脱氢酶产生，32℃，160r/min继续振荡培养18h至各个菌株的对数中后期。培养液经4℃，7000r/min离心10min，收集的菌体用预冷的pH 7.2的0.1M的KH2PO4-NaOH溶液(PBS缓冲溶)洗涤2次，将菌体悬浮于适量的PBS缓冲液中制备得到静息细胞。实验中含质粒菌株培养基中还需添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素。
利用上述静息细胞制备30mL的转化体系。
转化体系I-低底物浓度和助溶剂转化体系：菌体OD600为2.0，底物CA浓度为2g/L，4％乙醇助溶；
转化体系II-高底物浓度和助溶剂体系：菌体OD600为2.0，底物CA浓度为8g/L，8％乙醇助溶。
上述两个体系在34℃，180r/min振荡转化12h后，取样测定产物醋酸泼尼松(PA)的浓度。每次取样0.4mL加入0.8mL乙酸乙酯终止反应，超声萃取10min以上，12000r/min离心10min，吸取100μL上清液于新的1.5ml离心管中，在通风橱中过夜挥发，再用1ml流动相复溶，通过HPLC法测定产物的生成量。
HPLC检测条件为：
高效液相色谱仪：Agilent 1100Series LC(G1314Pump,G1322ADEGASSERG1314VWD检测器，20μL AN进样器，HP ChemStation)；
色谱柱：Kromasil 100-5SIL 250mm×4.6mm×5μm；
流动相：二氯甲烷:乙醚:甲醇(体积比86:12:2)，0.45μm微孔滤膜过滤；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测器：UV Detector，波长：240nm。
进样量：20μL
表3 otsB工程菌株与对照菌株转化醋酸可的松生成醋酸泼尼松的转化结果比较
Figure BDA0001122232290000151
由表3可知，利用本发明获得的高有机溶剂耐受性的otsB工程菌株进行甾体C1,2脱氢反应，体系中乙醇浓度由4％增加到8％时，底物CA的投加量提高了3倍，工程菌株otsB转化12h后产物PA的生成量分别由原来的1.87g/L增加到3.43g/L，而对照菌株此时的PA生成量仅为2.35g/L，是工程菌株otsB的68.5％。
实施例4 irrE工程菌株的构建及应用
1 制备含有重组质粒pART2-irrE的基因工程菌
(1)重组质粒pART2-irrE的构建
以耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)(购自中国普通微生物菌种保藏中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。菌种编号：1.633)基因组为模板，利用引物irrE3-F(如SEQ ID：1所示)和irrE3-R(如SEQ ID：2所示)进行PCR，扩增获得耐辐射异常球菌全局转录因子irrE基因序列(如SEQ ID：3所示)，PCR反应体系如下：
Figure BDA0001122232290000161
PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃30s，63℃30s，72℃90s，30个循环后72℃10min。
全局转录因子irrE序列和质粒pART2分别用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ处理(37℃，4h)，利用PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)分别回收目的片段，将酶切后的质粒和全局转录因子irrE序列按1:3(物质的量之比)的比例进行连接反应(16℃，12h)；连接产物转入大肠杆DH5α，经筛选获得重组质粒pART2-irrE。
获得的重组质粒pART2-irrE用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后经琼脂糖凝胶电泳进行验证，验证结果如图1所示。
(2)irrE工程菌株的获得
①感受态细胞的制备：
挑取简单节杆菌接种于LB液体培养基中，32℃、200r/min震荡培养25h，至菌体OD600为2.0形成种子液，取1mL种子液接入装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，32℃、200r/min培养8h，至OD600为1.0，加入细胞壁处理剂甘氨酸(浓度为0.5-4.0％)处理，震荡处理2-4h后，将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却12min，4℃下6000r/min离心10min，弃上清；加30mL预冷至0℃的电击缓冲液洗涤菌体后，4℃下5000r/min离心10min，弃上清；重复洗涤两次后，加入1mL电击缓液重悬菌体，摇匀，获得简单节杆菌感受态细胞，于-80℃保存待用。
其中，电击缓冲液由12％甘油和0.7mol/L山梨醇组成。
其中，细胞壁处理剂甘氨酸添加量与震荡处理时长安排如下表所示：
Figure BDA0001122232290000171
②重组质粒pART2-irrE的电激转化
取100μL简单节杆菌感受态细胞于1.5mL离心管中，加入20μL构建好的重组质粒pART2-irrE，混合均匀后转移到预冷的电脉冲杯内冰浴2min；打开电脉冲仪，1kV电击转化；电激后立即向电脉冲杯内加入1mL无菌复苏培养基，混匀后，32℃缓慢振荡培养10h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的选择平板上，32℃倒置培养72h，获得含有重组质粒pART2-irrE的工程菌株，即irrE工程菌株。
其中，复苏培养基是含有0.6moL/L山梨醇的LB液体培养基。
2 全局转录因子IrrE的表达
(1)菌体培养
分别从斜面挑取irrE工程菌株(含有重组质粒pART2-irrE)和对照菌株(含有空质粒)接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养40h。以4％(v/v)的接种量转接入新鲜的LB液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养至菌液OD600约为4.0。实验中含质粒菌株培养基中还需添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素。
其中，LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
(2)蛋白纯化
将上述培养液置于冰上至少10min，然后7000g，4℃离心15min，收集菌体。用冷却的PBS缓冲溶液洗涤两次，加入10mL菌体破碎液涡旋振荡重悬菌体。将重悬后的菌体在冰浴条件下超声破碎，破碎程序为：破碎功率450W，时间3:3(s/s)超声约60min，直至菌液透亮，7000r/min，4℃离心10min，收集上清中的可溶性蛋白，将菌体裂解液稀释后负载到His纯化柱上，流速为1.0mL/min收集流穿液。用Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。使用Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰即为蛋白峰。将收集到的蛋白峰，按比例加入5倍蛋白上样缓冲液，混匀后沸水浴5min，以蛋白凝胶每孔30uL蛋白样品的量上样；在浓缩胶和分离胶中分别用8V/cm和12V/cm进行电泳，当溴酚蓝条带接近分离胶末端时停止；将蛋白胶转入染色槽中，加入考马斯亮蓝染色液，缓慢震荡染色2h以上，以达到充分染色。染色结束后，冲洗掉多余的染色液，加入脱色液，缓慢震荡脱色约2h，直至条带清晰。irrE工程菌株与对照菌株全蛋白经过HIS纯化后蛋白的SDS-PAGE电泳图见图2。
其中，菌体破碎液组成：5mL PBS缓冲液，100μL的PMSF，500μL甘油，2mL 0.5mol/L的NaCl，50μL 20mg/mL溶菌酶。
(3)Western Blot实验
蛋白凝胶电泳后，将蛋白凝胶从电泳槽上取下，去除浓缩胶和多余部分，用转膜仪将蛋白转移到硝酸纤维素膜(PVDF)上，将转印的PVDF膜放置到ddH2O中漂洗1-2min，洗去膜上的转膜液，用5％脱脂奶粉(用TBST配制)封闭，置于水平摇床上缓慢摇动，室温封闭2h。弃除封闭液，PVDF膜用His探针抗体4℃过夜孵育。再根据一抗选择相应的羊抗兔二抗，在室温下二抗孵育2h，孵育完成后用TBST清洗干净。用扫膜仪将洗干净的PVDF膜置于暗室中用扫膜以进行扫描。Western Blot结果如图3所示。
由图2和图3可知，与对照菌株相比，irrE工程菌株在35KDa处出现了一条明显的差异条带，其大小与irrE的理论大小相符，这说明全局转录因子irrE已在简单节杆菌中成功表达。
3 irrE工程菌株有机溶剂耐受性的分析
(1)irrE工程菌株在不同浓度甲醇及乙醇压力下的生长情况
分别从斜面挑取irrE工程菌株和对照菌株接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min下振荡培养40h，以一定的接种量转接入含有不同浓度甲醇(4％、6％、8％)和乙醇(2％、4％、6％)的新鲜LB液体培养基中，并将初始OD600值调为相同(均为0.2)，32℃，160r/min震荡培养46h后取样测定OD600值，并计算相对OD600值(相对OD600＝有机溶剂压力下的菌液OD600/无压力下的菌液OD600)。实验中含质粒菌株培养基中还需添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素。由图4可知，与对照菌株相比，irrE工程菌株在2％、4％和6％乙醇压力下培养46h后的相对OD600值分别提高14.9％、73.9％和90.0％；4％和6％甲醇压力下培养46h后的相对OD600值分别提高21.1％和13.9％，这说明重组表达的irrE工程菌株对甲醇和乙醇的耐受性均明显提高。
(2)irrE工程菌株在高浓度乙醇冲击下的存活情况
分别从斜面挑取irrE工程菌株和对照菌株接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min下振荡培养40h，以一定的接种量转接入新鲜的LB液体培养基中，并将初始OD600值调为相同(均为0.2)，32℃，160r/min振荡培养到各自的对数中后期。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体用新鲜的LB液体培养基悬浮并将菌液的OD600值均调节至1.0，然后加入16％乙醇冲击1h。将冲击后的培养液采用10倍逐级稀释法在LB平板上涂布，32℃培养一定时间后观察平板上的菌落数并计算存活率。实验中含质粒菌株培养基中还需添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素。
存活率计算方法如下：
存活率(％)＝菌株压力条件下的菌落数/菌株无压力条件下的菌落数×100％
由图5可知，经过16％乙醇冲击1h后，irrE工程菌株的存活率为69％，比对照菌株提高了2倍。
4 irrE工程菌株转化醋酸可的松能力的测定
(1)静息细胞的制备
分别从斜面挑取irrE工程菌株和对照菌株接种于LB液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养40h，以一定的接种量转接到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，初始OD600值调整为0.2，32℃，160r/min振荡培养至对数生长期，分别加入终浓度为0.5g/L的底物醋酸可的松(CA)诱导C1,2位脱氢酶产生，32℃，160r/min继续振荡培养18h至各个菌株的对数中后期。培养液经4℃，7000r/min离心10min，收集的菌体用预冷的pH 7.2的0.1M的KH2PO4-NaOH溶液(PBS缓冲溶)洗涤2次，将菌体悬浮于适量的PBS缓冲液中制备得到静息细胞。实验中含质粒菌株培养基中还需添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素。
(2)不同转化体系下全细胞转化效率
利用上述静息细胞制备30mL的转化体系。
转化体系I-低底物浓度和助溶剂转化体系：菌体OD600为2.0，底物CA浓度为2g/L，4％乙醇助溶；
转化体系II-高底物浓度和助溶剂体系：菌体OD600为2.0，底物CA浓度为8g/L，8％乙醇助溶。
上述两个体系在34℃，180r/min振荡转化10h后，取样测定产物醋酸泼尼松(PA)的浓度。每次取样0.4mL加入0.8mL乙酸乙酯终止反应，超声萃取10min以上，12000r/min离心10min，吸取100μL上清液于新的1.5ml离心管中，在通风橱中过夜挥发，再用1ml流动相复溶，通过HPLC法测定产物的生成量。
HPLC检测条件为：
高效液相色谱仪：Agilent 1100Series LC(G1314Pump,G1322ADEGASSERG1314VWD检测器，20μL AN进样器，HP ChemStation)；
色谱柱：Kromasil 100-5SIL 250mm×4.6mm×5μm；
流动相：二氯甲烷:乙醚:甲醇(体积比86:12:2)，0.45μm微孔滤膜过滤；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测器：UV Detector，波长：240nm。
进样量：20μL
表4 irrE工程菌株与对照菌株转化醋酸可的松生成醋酸泼尼松的转化结果比较
Figure BDA0001122232290000191
Figure BDA0001122232290000201
由表4可知，利用本发明获得的高有机溶剂耐受性的irrE工程菌株进行甾体C1,2脱氢反应，体系中乙醇浓度由4％增加到8％时，底物CA的投加量提高了3倍，转化10h后产物PA的生成量由原来的1.61g/L增加到6.39g/L，提高了约3倍，而对照菌株此时的PA生成量为工程菌株的53.3％，仅为3.41g/L。
以上对本发明的几个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Figure IDA0001135725640000011
Figure IDA0001135725640000021
Figure IDA0001135725640000031
Figure IDA0001135725640000041
Figure IDA0001135725640000051
Figure IDA0001135725640000061

Claims (9)

1.一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于：通过转基因技术将基因片段转入到宿主菌中，获得高有机溶剂耐受性的工程菌株，所述宿主菌为简单节杆菌；
所述基因片段为全局转录因子irrE基因或相容性溶质的合成基因中的一种，所述相容性溶质的合成基因为海藻糖合成基因，海藻糖合成基因为otsA基因或otsB基因。
2.根据权利要求1所述的一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于：所述全局转录因子irrE基因核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求1所述的一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于：otsA基因核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，otsB基因核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于：构建方法步骤如下：
步骤一：根据基因序列信息设计上游引物和下游引物，利用所述上游引物与所述下游引物进行PCR扩增获得基因序列；
步骤二：通过双酶切法获得所用的基因片段和质粒pART2进行连接，连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态中，获得重组质粒；
步骤三：制备宿主菌感受态细胞，通过电转化的方法将所述重组质粒转入到宿主菌感受态细胞中，筛选后获得高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株。
5.根据权利要求4所述的一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤三中所述宿主菌感受态细胞制备过程如下：
挑取简单节杆菌接种于LB液体培养基中，震荡培养菌体形成菌液，加入细胞壁处理剂震荡处理一段时间后，将装有菌液的容器置于冰浴上冷却，离心后弃上清；加预冷的电击缓冲液洗涤菌体，离心后弃上清；洗涤后加入电击缓液重悬菌体，摇匀，形成简单节杆菌感受态细胞，保存待用；
所述电转化方法步骤如下：
取简单节杆菌感受态细胞，加入构建好的所述重组质粒，混合均匀后转移到预冷的电脉冲杯内冰浴；打开电脉冲仪电击转化；电激后立即向电脉冲杯内加入无菌复苏培养基，混匀后缓慢振荡培养，涂布到选择平板上，倒置培养，筛选获得含有重组质粒的基因工程菌株。
6.根据权利要求5所述的一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于：所述细胞壁处理剂为青霉素G、溶菌酶、苏氨酸和甘氨酸中的一种。
7.利用权利要求1-6中任一所述的一种高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法构建得到的高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株。
8.权利要求7所述的高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株在甾体类化合物生物转化中的应用，其特征在于：所述高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株在甾体类化合物生物转化中的反应为甾体A环的C1,2脱氢反应，反应环境中的有机溶剂为甲醇或乙醇中的一种，所述甾体类化合物为醋酸可的松。
9.根据权利要求8所述的高有机溶剂耐受性的简单节杆菌工程菌株在甾体类化合物生物转化中的应用，其特征在于：反应环境中的有机溶剂为乙醇。
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