CN107988092B

CN107988092B - 具有胁迫耐受性的简单节杆菌突变菌株及工程菌

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Publication number: CN107988092B
Application number: CN201711103922.5A
Authority: CN
Inventors: 骆健美; 王敏; 申雁冰; 宋昭玉; 薛海洁; 崔芳芳; 王艳霞; 夏梦雷
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2017-11-10
Filing date: 2017-11-10
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2037-11-10
Also published as: CN107988092A

Abstract

本发明属于遗传育种领域，具体涉及一株具有胁迫耐受性的简单节杆菌突变菌株及由其构建的基因工程菌。其中，突变菌株在16％乙醇和20％甲醇冲击条件下的存活率比出发菌株分别提高了3.74倍和2.10倍；过表达来自突变菌株的groEL、dnaK、recA、uvrD、katG、sod或treS基因的工程菌对高浓度有机溶剂的耐受能力均明显提高，并对盐压力和氧化压力也表现出更高的耐受能力，上述工程菌应用于甾体C1,2脱氢反应可将体系中乙醇浓度提高至8‑10％，底物CA浓度提高至6‑8g/L，产物产量提高0.41‑3.56倍，为后续的耐性机制研究和菌株分子改造与应用奠定了良好基础。

Description

具有胁迫耐受性的简单节杆菌突变菌株及工程菌

技术领域：

本发明属于遗传育种领域，具体涉及一株具有胁迫耐受性的简单节杆菌突变菌株及由其构建的基因工程菌。

背景技术：

甾体激素类药物是目前临床上用量仅次于抗生素的第二大类药物。甾体化合物C1,2位脱氢反应是工业上采用微生物转化法生产甾体药物的典型代表，也是生产氢化泼尼松及其同系物最有价值的一种反应。与化学合成方法相比，微生物转化反应具有高度的立体选择性和区域选择性，能够大幅度的减少合成步骤，缩短生产周期。但是，底物的难溶性(一般为10^-5-10^-6mol/L)和水相的催化环境使得底物与生物酶不能有效接触，进而直接影响了催化反应的速率和效率。研究者采用很多方法提高底物的溶解度，如底物微粒化、环糊精包合、浊点系统和离子液体等，这些方法有的操作繁琐，有的成本较高。目前为止，添加有机溶剂是工业上甾体生物合成工艺中普遍用来改善底物溶解性的方法。但有机溶剂的用量却因为其对微生物的不利影响受到严格控制，这大大限制了转化体系中底物的投料量，最终影响产率。为了突破这一瓶颈，迫切的需要解析转化反应菌株在有机溶剂胁迫条件下的适应机制，并在此基础上创建适用于工业化应用的高有机溶剂耐性的微生物菌株。

近年来，研究者在微生物有机溶剂适应行为和耐性机制方面开展了大量的工作，主要集中在革兰氏阴性菌，且多以模式菌株(如大肠杆菌)为研究对象。而且表现出明显的菌株特异性和溶剂特异性。更为重要的是，工业菌株与实验室广泛研究的模式微生物在遗传背景和生理特性上存在着一定差异，这种异质性也是全面解析调控机制的重要瓶颈。

简单节杆菌(Arthrobacter simplex)以专一性高、反应速率快等优点已成为工业生产中广泛使用的甾体C1,2脱氢反应菌株，同时反应体系中多采用添加有机溶剂的方法(一般是乙醇)促进疏水性底物的溶解。目前对于简单节杆菌在有机溶剂胁迫条件下的适应行为和耐受分子机制尚未展开系统研究。菌株有机溶剂耐受性的水平还存在较大的局限性，有待于通过诱变育种、分子生物学等技术进一步提高。

本发明通过紫外-亚硝酸钠复合诱变结合压力驯化的方法选育出一株具有较高乙醇耐受性能的简单节杆菌突变株TCCC11307-UV15X1-2。比较蛋白质组学的研究发现，热激蛋白GroEL，DnaK；DNA重组修复蛋白RecA，DNA解旋酶UvrD；过氧化氢酶KatG，超氧化物歧化酶SOD；海藻糖合成酶TreS是与简单节杆菌乙醇耐受性相关的重要蛋白。在此基础上，采用分子生物学技术分别构建系列过表达工程菌株。本发明为揭示简单节杆菌胁迫条件下的耐性分子机制奠定了良好的基础，为甾体C1,2位脱氢反应高效菌株的创建提供新思路。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供多株具有胁迫耐受性的简单节杆菌菌株，这些菌株在高浓度有机溶剂和底物的C1,2位脱氢反应体系中表现出更好的胁迫耐受性和生物转化能力。

本发明实现上述目的的技术方案之一，是提供一株具有胁迫耐受性的简单节杆菌突变株，所述突变株具体为简单节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC11307-UV15X1-2，保藏编号CGMCC No.14539，该菌株已于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

所述突变株TCCC11307-UV15X1-2，是在申请人实验室保藏的一株出发菌株简单节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC11037的基础上，经过紫外-亚硝酸钠复合诱变结合压力驯化所得。诱变驯化后，突变株的乙醇耐受性明显提高，16％乙醇和20％甲醇冲击条件下的存活率比出发菌株分别提高了3.74倍和2.10倍。

本发明提供的技术方案之二，是在技术方案一所述突变株的基础上构建基因工程菌，过表达SEQ ID No.8-14任一所示的抗逆蛋白；

进一步地，SEQ ID No.8对应的抗逆蛋白为GroEL，其编码基因groEL的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

进一步地，SEQ ID No.9对应的抗逆蛋白为DnaK，其编码基因dnaK的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

进一步地，SEQ ID No.10对应的抗逆蛋白为RecA，其编码基因recA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

进一步地，SEQ ID No.11对应的抗逆蛋白为UvrD，其编码基因uvrD的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

进一步地，SEQ ID No.12对应的抗逆蛋白为KatG，其编码基因katG的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

进一步地，SEQ ID No.13对应的抗逆蛋白为SOD，其编码基因sod的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

进一步地，SEQ ID No.14对应的抗逆蛋白为TreS，其编码基因treS的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

优选地，所述基因工程菌以pART2质粒为表达载体。

本发明提供的技术方案之三，是上述基因工程菌的构建方法，具体如下：

(1)以突变株TCCC11307-UV15X1-2基因组为模板，通过PCR扩增得到该菌株中的groEL，dnaK，recA，uvrD，katG，sod，treS基因；

(2)利用基因工程的手段将上述基因分别连接到大肠杆菌-节杆菌穿梭质粒pART2的启动子后，化转到大肠杆菌DH5α中进行复制；

(3)提取重组质粒分别电转化到简单节杆菌突变株TCCC11307-UV15X1-2中进行过表达。

上述基因工程菌应用于甾体转化中，可将体系中乙醇浓度提高至8-10％，底物醋酸可的松(CA)浓度提高至6-8g/L。

有益成果：

(1)本发明获得的简单节杆菌突变株TCCC11307-UV15X1-2对较高浓度的有机溶剂表现出良好的耐受能力，16％乙醇和20％甲醇冲击条件下的存活率比出发菌株分别提高了3.74倍和2.10倍，为后续的耐性机制研究和菌株分子改造奠定了良好基础；

(2)本发明获得的七株抗逆基因过表达工程菌株对高浓度有机溶剂(包括16％乙醇和20％甲醇)的耐受能力均明显提高，特别是groEL，dnaK和treS过表达工程菌株对其他胁迫条件(盐压力和氧化压力)也表现出更高的耐受能力，分别能耐受2.5M NaCl和0.1％H₂O₂。groEL，dnaK和treS过表达工程菌株分别在不同转化体系下进行甾体C1,2脱氢反应，在底物CA浓度为8g/L，10％乙醇助溶的转化体系中，这三株过表达工程菌株较对照菌株产物产量提高0.41-3.56倍，并且三株过表达菌株的生产能力由大到小依次为groEL>dnaK>treS。

附图说明：

图1简单节杆菌突变菌株与出发菌株对有机溶剂耐受性能比较；

图2乙醇对groEL，dnaK，recA，uvrD，katG，sod，treS基因转录水平的影响；

图3重组质粒构建流程图；

图4实施例4构建的七株基因工程菌的验证结果；

其中，(a)为重组pART2-groEL质粒PCR验证；(b)为重组pART2-groEL质粒酶切产物；泳道1：BamH I/XbaI双酶切；泳道2：XbaI单酶切；M:DL5000marker；

(c)为重组pART2-dnaK质粒PCR验证；(d)为重组pART2-dnaK质粒酶切产物；泳道1：BamHI/XbaI双酶切；泳道2：XbaI单酶切；M:DL5000marker；

(e)为重组pART2-recA质粒PCR验证；(f)为重组pART2-recA质粒酶切产物；泳道1：Kpn I/XbaI双酶切；泳道2：XbaI单酶切；M:DL5000marker；

(g)重组pART2-uvrD质粒PCR验证；(h)重组pART2-uvrD质粒酶切产物；泳道1：BamHI/XbaI双酶切；M:DL5000marker；

(i)重组pART2-katG质粒PCR验证；(j)重组pART2-katG质粒酶切产物；泳道1：BamHI/XbaI双酶切；泳道2：XbaI单酶切；M:DL5000marker；

(k)重组pART2-sod质粒PCR验证；(l)重组pART2-sod质粒酶切产物；泳道1：BamHI/XbaI双酶切；泳道2：XbaI单酶切；M:DL5000marker；

(m)重组pART2-treS质粒PCR验证；(n)重组pART2-treS质粒酶切产物；泳道1：BamHI/XbaI双酶切；M:DL5000marker；

图5实施例4所构建的七株基因工程菌株对有机溶剂耐受性能比较；

其中序号1-7分别代表七株基因工程菌株，按顺序依次为groEL，dnaK，recA，uvrD，katG，sod，treS基因过表达工程菌；

图6实施例4所构建的三株基因工程菌株对盐压力和氧化压力的耐受性能比较。

其中序号1，2，7分别代表groEL，dnaK，treS基因过表达工程菌；

图7实施例6转化体系I转化过程曲线；

图8实施例6转化体系II转化过程曲线；

图9实施例6转化体系III转化过程曲线。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

实施例1：简单节杆菌突变株TCCC11307-UV15X1-2的选育

1.1细胞壁弱化处理

将保存的出发菌菌体在斜面(葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.2)上进行活化。从已活化的斜面上挑取菌苔一满环，接种于灭菌后的装有30mL种子培养基(葡萄糖10g/L，玉米浆10g/L，蛋白胨5g/L，KH₂PO₄ 2.5g/L，pH＝7.2)的250mL种子瓶中，置回转式摇床于160r/min，32℃培养18h，OD₆₀₀＝3.0时加入细胞壁处理剂溶菌酶30μg/mL，继续震荡培养1h。收集培养液，4500r/min离心10min后弃去上清液，菌体用生理盐水洗涤2次后，重新悬浮于10mL生理盐水中。充分振动以分散细胞，制成浓度为10⁸个/mL的菌悬液。

1.2诱变处理

取10mL按1.1方法制备得到的菌悬液加至灭菌的培养皿中，开启紫外灯，预热20min，开启搅拌器，打开皿盖，在紫外灯照射下搅拌30s。向经过紫外照射后的菌液中加入灭菌的NaNO₂溶液中，使NaNO₂终浓度为200mmol/L，充分混匀后反应60min。取诱变处理后的菌液在含有种子培养基的摇瓶中32℃，160rpm富集培养18h。

1.3驯化培养

吸取富集培养后的菌液，以10％的接种量转接到含有4％乙醇的种子培养基中32℃，160rpm条件下进行驯化培养18h，此时菌液OD₆₀₀到达3.6。将此次驯化得到的菌液以10％的接种量转接到含有6％乙醇的种子培养基中32℃，160rpm条件下进行驯化培养18h，此时菌液OD₆₀₀到达3.2。将此次驯化得到的菌液以10％的接种量再转接到含有8％乙醇的种子培养基中32℃，160rpm条件下进行驯化培养18h，此时菌液OD₆₀₀到达2.6。将此次驯化得到的菌液以10％的接种量再转接到含有10％乙醇的种子培养基中32℃，160rpm条件下进行驯化培养18h，此时菌液OD₆₀₀到达2.0，此次驯化后的菌液用于后续菌株的分离纯化。

1.4分离纯化

蘸取驯化菌液在含有10％乙醇的平板培养基(葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.2)上进行三区划线，32℃培养48h，挑选生长速度较快、菌落直径较大的单菌落分别接种到含有10％乙醇的种子培养基中32℃，160rpm振荡培养，共筛选分离得到55个菌株。以生长速率和最大生物量为指标，筛选得到具有高乙醇耐性的突变株TCCC11307-UV15X1-2进行后续的实验。

1.5突变菌株的遗传稳定性实验

突变菌株TCCC11307-UV15X1-2经斜面培养连续传代20次，将第1，5，10，15，20代的菌株分别在含有10％(v/v)的乙醇的种子培养基中，32℃，160r/min培养48h。通过测定菌体生物量和比生长速率考察耐性突变株的遗传稳定性。结果发现，诱变菌株传代20次后，比生长速率和生物量分别在0.054～0.062h^-1和0.209～0.243(OD₆₀₀)范围内波动，表明该突变菌株具有良好的遗传稳定性，结果如下表所示。

突变菌株TCCC11307-UV15X1-2的遗传稳定性

实施例2：突变菌株TCCC11307-UV15X1-2有机溶剂耐受性能的评价

2.1突变菌株和出发菌株在高浓度有机溶剂冲击条件下的存活率比较

分别从斜面挑取实施例1获得的突变菌株TCCC11307-UV15X1-2，并以出发菌株作为对照菌株，将上述2株菌分别接种到含有50mL种子培养基的摇瓶中，32℃，160r/min下振荡培养24h，转接入新鲜的上述液体培养基中，并将初始OD₆₀₀值调为0.2，32℃，160r/min振荡培养到对数中后期。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体用新鲜的上述液体培养基悬浮并将菌液的OD₆₀₀值均调节至1.0，然后分别加入16％(v/v)乙醇和20％(v/v)的甲醇冲击1h。将冲击后的培养液采用10倍逐级稀释，涂平板，计数，计算存活率。其结果如图1所示。

由图1可知，突变菌株在添加16％乙醇条件下冲击1h后，突变菌株的存活率为23.653％，发菌株的存活率为4.985％，20％甲醇的条件下冲击1h后，突变菌株的存活率为32.042％，发菌株的存活率为10.325％，突变菌株的存活率明显高于出发菌株，分别提高了3.74倍和2.10倍。说明简单节杆菌突变菌株TCCC11307-UV15X1-2的有机溶剂(乙醇和甲醇)耐受性有明显提高。

2.2突变菌株和出发菌株在适量浓度乙醇添加条件下生长性能的比较

将分离纯化得到的突变菌株TCCC11307-UV15X1-2和出发菌株分别接种到种子培养基中，置回转式摇床于160r/min，32℃培养约48h后，以10％的接种量将菌液分别转接至装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养基中加入体积比为12％(v/v)的乙醇，32℃，160r/min培养，观察菌体的生长特性。

出发菌株和突变菌株TCCC11307-UV15X1-2在液体培养的比生长速率和最大生物量见下表。由下表可知，没有乙醇添加时，两个菌株的生长特性基本一致，乙醇添加12％时，二者的生长均受到抑制，但突变菌株要比出发菌株表现出更好的生长性能。

出发菌株和突变菌株TCCC11307-UV15X1-2比生长速率和生物量比较

实施例3：乙醇耐受相关蛋白的确定

分别收集简单节杆菌突变株TCCC11307-UV15X1-2在添加8％乙醇和未添加乙醇条件下培养3h的菌体细胞，提取胞内蛋白，通过蛋白质组学技术手段比较发现，与未添加乙醇相比，添加8％乙醇导致一系列蛋白表达显著上调，包括：热激蛋白GroEL，DnaK；DNA重组修复蛋白RecA，DNA解旋酶UvrD；过氧化氢酶KatG，超氧化物歧化酶SOD；海藻糖合成酶TreS，这些蛋白可能与菌体的胁迫耐受性能相关。利用qRT-PCR对上述七种抗逆相关蛋白编码基因groEL，dnaK，recA，uvrD，katG，sod，treS的转录水平进一步验证，结果显示，在添加8％乙醇的生长体系下groEL，dnaK，recA，uvrD，katG，sod，treS七个基因的转录水平均发生上调。其结果如图2所示。表明这七个蛋白是与简单节杆菌乙醇耐受性相关的重要蛋白。

实施例4：具有胁迫耐受性内源抗逆相关基因过表达简单节杆菌工程菌株的构建4.1重组质粒pART2-groEL，pART2-dnaK，pART2-recA，pART2-uvrD，pART2-katG，pART2-sod，pART2-treS的构建

使用G⁺细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，提取简单节杆菌乙醇耐受突变株TCCC11307-UV15X1-2的总DNA。分别以提取的总DNA为模板扩增groEL，dnaK，recA，uvrD，katG，sod，treS基因。其引物序列及序列表对应编码如下表所示：

PCR反应体系如下表所示(50μL)：

PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 30s，64℃ 30s，72℃ 2min，30个循环后72℃ 10min，PCR结束后，产物用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小是否符合。

将PCR产物用DNA纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)进行纯化，然后酶切反应体系如下表：

37℃温浴反应2h。

将制备好的目的片段分别与酶切纯化后的载体质粒pART2(GenBanK登录号为：DQ191047)按1:3(物质的量之比)的比例进行连接反应(16℃，12h)，将连接产物分别转化到大肠杆菌DH5α中，经筛选获得重组质粒pART2-groEL，pART2-dnaK，pART2-recA，pART2-uvrD，pART2-katG，pART2-sod，pART2-treS。其构建流程图如图3所示。

4.2重组工程菌株Asp/pART2-groEL，Asp/pART2-dnaK，Asp/pART2-recA，Asp/pART2-uvrD，Asp/pART2-katG，Asp/pART2-sod，Asp/pART2-treS的获得。(1)简单节杆菌感受态细胞的制备

挑取简单节杆菌乙醇耐受突变株TCCC11307-UV15X1-2接种于LB液体培养基中，34℃、220r/min震荡培养30h，至菌体OD₆₀₀为2.5形成种子液，取1mL种子液接入装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，34℃、220r/min培养10h，至OD₆₀₀为1.2，加入细胞壁处理剂青霉素G(浓度为10-200μg/mL)振荡处理0.5-2h后，将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却15min，4℃下6500r/min离心12min，弃上清；加40mL预冷至0℃的电击缓冲液(由14％甘油和0.9mol/L山梨醇组成)洗涤菌体后，4℃下5000r/min离心10min，弃上清；重复洗涤两次后，加入1.2mL电击缓液重悬菌体，摇匀，获得简单节杆菌感受态细胞，于-80℃保存待用。

其中，细胞壁处理剂青霉素G添加量与震荡处理时长安排如下表所示：

(2)重组质粒电激转化及验证

取120μL简单节杆菌感受态细胞于1.5mL离心管中，分别加入100ng构建好的重组质粒pART2-groEL，pART2-dnaK，pART2-recA，pART2-uvrD，pART2-katG，pART2-sod，pART2-treS混合均匀后转移到预冷的电脉冲杯内冰浴3min；打开电脉冲仪，1.2kV电击转化；电激后立即向电脉冲杯内加入1.2mL无菌复苏培养基(含有0.8moL/L山梨醇的LB液体培养基)，混匀后，34℃缓慢振荡培养11h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的选择平板上，34℃倒置培养80h，挑取转化子。提取质粒进行PCR和双酶切验证，验证结果如图4所示。对验证成功的简单节杆菌工程菌株均送往金唯智生物科技有限公司进一步测序验证，即得七株分别过表达抗逆基因groEL，dnaK，recA，uvrD，katG，sod，treS的基因工程菌，分别命名为Asp/pART2-groEL，Asp/pART2-dnaK，Asp/pART2-recA，Asp/pART2-uvrD，Asp/pART2-katG，Asp/pART2-sod，Asp/pART2-treS。

实施例5.抗逆基因过表达工程菌对不同胁迫条件耐受性能的比较

分别从斜面挑取实施例4构建的七株抗逆基因groEL，dnaK，recA，uvrD，katG，sod，treS过表达工程菌，并以含有空载体pART2质粒的突变株TCCC11307-UV15X1-2作为对照菌株，并将对照株命名为pART2，将上述8株菌分别接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，32℃，160r/min下振荡培养40h，转接入新鲜的上述液体培养基中，并将初始OD₆₀₀值调为0.2，32℃，160r/min振荡培养到各自的对数中后期。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体用新鲜的上述液体培养基悬浮并将菌液的OD₆₀₀值均调节至1.0，然后分别加入16％(v/v)乙醇和20％(v/v)的甲醇冲击1h。将冲击后的培养液采用10倍逐级稀释，涂平板，32℃培养箱中静置培养，待长出菌落后计活菌数，计算存活率。

由图5可知，在添加16％乙醇和20％甲醇的条件下冲击1h后，七株抗逆基因groEL，dnaK，recA，uvrD，katG，sod，treS过表达工程菌株的存活率均明显高于对照菌株pART2。说明过表达groEL，dnaK，recA，uvrD，katG，sod，treS基因提高了简单节杆菌对有机溶剂耐受性。其中，groEL，dnaK和treS过表达工程菌株在添加16％乙醇条件下冲击1h后，其耐受性能明显好于recA，uvrD，katG，sod过表达工程菌株。说明热激蛋白编码基因groEL，dnaK和海藻糖合成酶编码基因treS与其他抗逆相关基因相比，对提高简单节杆菌有机溶剂耐受性有更明显的效果。

同时，考察了上述实验中耐受性能最好的三株菌：groEL，dnaK和treS过表达工程菌株对盐压力(2.5M NaCl)和氧化压力(0.1％H₂O₂)的耐受性。其结果如图6所示。由图6可得，groEL，dnaK和treS过表达工程菌株在添加2.5M NaCl和0.1％H₂O₂的条件下冲击一定时间后，其在LB平板上的活菌数均明显高于对照菌株pART2。这表明热激蛋白编码基因groEL，dnaK和海藻糖合成酶编码基因treS过表达提高了简单节杆菌对多种环境胁迫因素的耐受性。

实施例6.对照菌株pART2与groEL，dnaK，treS过表达工程菌株在不同浓度乙醇作为助溶剂的条件下甾体C1，2位脱氢反应能力的比较

分别从斜面挑取实施例4构建的groEL，dnaK和treS过表达工程菌株与对照菌株pART2接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养36h，以一定的接种量转接到装有50mL上述新鲜培养基的250mL三角瓶中，初始OD₆₀₀值调整为0.2，32℃，160r/min震荡培养至对数生长期，分别加入终浓度为0.1g/L的底物醋酸可的松(CA)诱导C1,2位脱氢酶产生，32℃，160r/min继续振荡培养18h至各个菌株的对数中后期。培养液经4℃，7000r/min离心10min，收集的菌体用预冷的pH 7.2的0.1M的KH₂PO₄-NaOH溶液(PBS缓冲溶)洗涤2次，将菌体悬浮于适量的PBS缓冲液中制备得到静息细胞。

利用上述静息细胞制备30mL的转化体系：

转化体系I-低底物浓度和助溶剂转化体系：菌体OD₆₀₀为2.0，底物CA浓度为2g/L，4％乙醇助溶；转化过程曲线如图7所示；

转化体系II-高底物浓度和助溶剂体系：菌体OD₆₀₀为2.0，底物CA浓度为6g/L，8％乙醇助溶；转化过程曲线如图8所示；

转化体系III-高底物浓度和助溶剂体系：菌体OD₆₀₀为2.0，底物CA浓度为8g/L，10％乙醇助溶；转化过程曲线如图9所示。

上述三个体系在34℃，180r/min振荡转化，定时取样测定产物醋酸泼尼松(PA)的浓度。每次取样0.4mL加入0.8mL乙酸乙酯终止反应，超声萃取10min以上，12000r/min离心10min，吸取100μL上清液于新的1.5ml离心管中，在通风橱中过夜挥发，再用1mL流动相复溶，通过HPLC法测定底物CA的转化率，产物PA的生成量。

HPLC检测条件为：

高效液相色谱仪：Agilent 1100Series LC(G1314Pump,G1322ADEGASSERG1314VWD检测器，20μL AN进样器，HP ChemStation)；

色谱柱：Kromasil 100-5SIL 250mm×4.6mm×5μm；

流动相：二氯甲烷:乙醚:甲醇(体积比86:12:2)，0.45μm微孔滤膜过滤；

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

检测器：UV Detector，波长：240nm。

进样量：20μL

在上述转化过程中的不同时间分别取样，其结果如下表所示。

由上表可得，4％乙醇助溶，底物CA浓度为2g/L的转化体系中，groEL，dnaK和treS过表达工程菌与对照菌株pART2相比，其转化CA生成PA的浓度均在12h时达到最大，且没有明显差别，但groEL和dnaK过表达工程菌表现出更高的初始转化速率。当体系中乙醇和底物浓度分别提高到8％和6g/L时，四个菌株均在转化24h时获得最大的PA生成量，其中，对照菌株的PA最大生成量为2.54g/L，groEL、dnaK和treS过表达工程菌的最大PA生成量均有明显提高，分别达到了4.86g/L、4.81g/L和3.58g/L，初始转化速率也表现出类似的趋势。当体系中乙醇浓度提高到10％，CA添加量为8g/L时，对照菌株pART2和treS过表达工程菌在12h时的PA生成量达到最大，分别为0.89g/L和2.59g/L，而groEL和danK过表达工程菌在转化35h时PA生成量达到最大，分别为4.06g/L和3.28g/L，比对照菌株pART2相比，分别提高了3.56倍和2.68倍。

此外，本发明获得的具有高环境胁迫耐受性的简单节杆菌groEL，dnaK和treS过表达工程菌株在不同转化体系中的活菌数明显高于对照菌株pART2，说明工程菌株对转化体系中的复杂压力(有机溶剂、底物和产物)表现出更高的耐受能力，这是其能够转化CA生成更多PA的重要原因。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 具有胁迫耐受性的简单节杆菌突变菌株及工程菌

<130> 1

<141> 2017-11-10

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1632

<212> DNA

<213> 简单节杆菌(Arthrobacter simplexTCCC11307-UV15X1-2， CGMCC No.14539)

<400> 1

atgtcgaagc tgattgcttt caacgaggag gcccgccgcg gtctcgagcg tggcatgaac 60

acgctcgcgg acgccgtcaa ggtcaccctg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggag 120

aagaagtggg gcgcccccac gatcaccaac gacggtgtct ccatcgccaa ggagatcgac 180

ctcgaggacc cctacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aggaggtcgc gaagaagacc 240

gacgacgtcg ccggtgacgg cacgacgacg gccaccgtgc tcgcccaggc gctcgtcaag 300

gagggcctcc gcaacgtggc cgccggcgcg aacccgatgg gtctcaagcg cggcatcgag 360

gccgccgtga cggctgtctc cgagcagctc ctcggcctgg ccaaggaggt cgagacccgc 420

gagcagatcg ccgcgaccgc gaccatctcc gccggtggcg acaccacggt cggcgacgcc 480

atcgccgagg cgatggacaa ggtcggcaag gagggcgtga tcacggtcga ggagtcgaac 540

acgttcggca tcgacctcga gctcaccgag ggaatgcggt tcgacaaggg ctacatctcg 600

gcctacttcg tcaccgaccc cgagcgcatg gagaccgtcc tcgaggacgc ctacgtgctg 660

atcgccaact ccaagatcag caacgtcaag gacctcctcc cgctgctcga gaaggtcatg 720

cagtcgggca agccgctcgt catcctggcc gaggacgtcg acggcgaggc gctgtcgacc 780

ctggtcgtca acaagatccg cggcaccttc aagtccgtcg ccgtcaaggc gccgggcttc 840

ggcgaccgcc gcaaggccat gctgcaggac atcgcgatcc tgaccggcgg ccaggtcatc 900

tccgaggagg tcggcctcaa gctcgagacc gccggtgtcg agctgctggg ccaggcccgc 960

aaggtcgtca tcaccaagga cgagaccacc atcgtcgagg gtgccggcga ccaggcccag 1020

atcgagggcc gggtcaacca gatccgcgcc gagatcgaga gctcggactc cgactacgac 1080

cgcgagaagc tccaggagcg cctcgccaag ctggccggcg gcgtggccgt catcaaggtc 1140

ggcgcggcca ccgaggtcga gctcaaggag cgcaagcacc gcatcgagga cgccgtccgc 1200

aacgccaagg cggccgtcga ggagggcatc ctccccggtg gcggtgtcgc gctggtccag 1260

gccggcgcct ccgcgttcga caagctcgag ctcgagggtg acgaggccac cggcgccaac 1320

atcgtcaagg tcgcgctctc cgctccgctc aagcagatcg ccgtcaacgc gggcctcgag 1380

ggtggcgtcg tctccgagaa ggtcgcgaac cttccggccg gccagggcct caacgccgcg 1440

accggcgagt acgtcgacct gctggccgcg ggcatcatcg acccggccaa ggtgacgcgc 1500

tccgcgctgc agaacgccgc gtcgatcgcc gcgctgttcc tcaccaccga ggccgtcgtg 1560

gccgacaagc cggagaaggc tgccgctggt ggcggcgacc cgaccggcgg catgggcggc 1620

atggacttct ga 1632

<210> 2

<211> 1869

<212> DNA

<213> 简单节杆菌(Arthrobacter simplexTCCC11307-UV15X1-2， CGMCC No.14539)

<400> 2

atggcacgag ctgtcggcat cgacctcggt acgacgaaca gcgtcgtcgc ggtcctcgag 60

ggcggcgagc ccacggtcat cgccaacgcg gagggtgccc ggaccacgcc gtccgtcgtc 120

gccttcgcga agagcggtga ggtgctcgtc ggcgaggtcg cgaagcgcca ggccgtcacc 180

aacgtcgacc gcaccatccg gtcggtcaag cgccacatgg gcaccgactg gacccagcac 240

atcggcgacc cggtcgacaa ggacttcacg ccgcagcaga tctcggcgtt catcctgcag 300

aagctgaagc gcgacgcgga ggcctacctc ggcgagaccg tcaccaacgc ggtcatcacc 360

gtcccggcgt acttctccga cgcccagcgc caggccacca aggaggccgg cgagatcgcg 420

ggcctcaagg tcgaccgcat cgtcaacgag cccaccgccg cggccctcgc gtacggcctc 480

gacaagggcg acgaccagac gatcctcgtc tacgacctcg gtggcggcac gttcgacgtg 540

tccctgctcg agatcggtga gggcgtcgtc gaggtcaagg cgaccagcgg cgacaaccac 600

ctcggtggcg acgactggga caacgcgatc gtcgagtgga tggtcaagaa gttcaaggac 660

gccaacggcg tcgacctggc cgcggacaag atcgccgcgc agcgcctcca ggaggccgcc 720

gagaaggcca agatcgagct gtcgtcgtcc agcgacacga cgatccacct gccctacatc 780

acccacggcg agaacggccc gctgcacttc gaggagcggc tcacccgctc cgagttccag 840

cggctcaccg cgagcctgct cgagcgcacc aaggcgccct tccagaacgt cctcaaggac 900

ggcggcgtgg cgctctccgc gatcgaccac gtggtcctcg tcggcggctc cacccggatg 960

cccgccgtga ccgagctggt caaggagatg ctcggcggca aggagcccaa caagggcgtc 1020

aacccggacg aggtcgtcgc cgtcggcgcc gccctccagg ccggcgtcct ggccggtgag 1080

gtcaaggacg tgctgctcct cgacgtcacc ccgctctcgc tcggcatcga gaccaagggc 1140

ggtgtcttca ccaccctgat cgagcgcaac accacgatcc cgaccaagcg ctccgagatc 1200

ttcacgaccg ccgacgacaa ccagccgtcg gtcgagatca aggtcgccca gggcgagcgg 1260

gccatctggt cgcagaacca gggcctcggc aacttcgagc tgaccggcct cccgccggcc 1320

ccgcgcggcg tgccgaagat cgaggtcacc ttcgacatcg acgccaacgg catcgtccac 1380

gtctccgcca aggaccaggc gtccggccgc gagcagtcga tgacgatctc cggcggcagc 1440

gcgctgtcca aggacgacat cgaccgcatg gtcaaggagg ccgagcagta cgccgaggag 1500

gacgccaagc gtcgcgaggc cgtcgaggtc cgcaaccagg gcgaccagct cgtctacacg 1560

accgagaagt tcctggccga caacggcgac aagatcccgg acgacgtcaa gaccgaggtc 1620

agcgccgacc tcgaggcgct caagaccgtc ctcgccgacg cggaggccga cgccgacgcg 1680

ctgagcgcgg cgatcaccaa gctcggtgag tccagccaga agatgggcgc ggccatgtac 1740

gccgcggccg aggccgacac cgccgcggcg ggcggcacca ccggtgccac cggcgaggcc 1800

gacgacgacg tcgtcgaggc cgagatcgtc gacgaggacg tcgagggcac cgagggcgag 1860

tccaagtga 1869

<210> 3

<211> 1053

<212> DNA

<213> 简单节杆菌(Arthrobacter simplexTCCC11307-UV15X1-2， CGMCC No.14539)

<400> 3

atggctggag acgaccgcca gaaggccctc gacgctgcgc ttctcaacat cgagaagtcg 60

tacggcaagg gctccgtgat gcgactcggt gacgactcgc gcgcccccct cgacgtgatc 120

ccgaccggat ccatctccct cgacgtcgct ctcggcatcg gtggtctccc gcgcggacgg 180

gtcgtggaga tctacggccc cgagtcgagc ggtaagacca ccgtcgcgct ccactcggtg 240

gccagcgccc aggccgccgg cggcatcgtc gccttcatcg acgccgagca cgccctcgac 300

cccgactacg ccaaggccct cggcgtcgac accgacgccc tcctggtctc ccagcccgac 360

tccggtgagc aggccctcga gatcgccgac atgctcatcc gctccggcgc cctcgacctc 420

atcgtgatcg actccgtcgc ggccctcgtg ccccgcgccg agatcgaggg cgagatgggc 480

gacagccacg tcggcctcca ggcccgcctg atgagccagg ccctccgcaa gatgaccggt 540

gccctcaacc agtccaagac caccgccatc ttcatcaacc agctgcgcga gaagatcggc 600

gtcatgttcg gctcgcccga gaccaccacc ggtggccgcg cgctgaagtt ctactcctcc 660

gtccgcctcg acgtccgccg catcgagacc ctcaaggacg gcaccgacat ggtcggcaac 720

cggacccggg tcaaggtcgt caagaacaag gtcgccccgc ccttcaagca ggccgagttc 780

gacatcatgt acggcaaggg catctcccgc gagggtggcc tcatcgacgt cggcgtcgag 840

gcaggcctca tccgcaaggc cggcgcctgg tacacctacg agggcgacca gctcggccag 900

ggcaaggaga acgcccgcac cttcctcaag gacaacccgg acctggccaa cgagctggag 960

aagaagatcc tcgagaagct cggcgtcacc cccaccgtcg agggcgactt caccgacctc 1020

tccgacgagc cgatcggcgt cgactcgttc tga 1053

<210> 4

<211> 3234

<212> DNA

<213> 简单节杆菌(Arthrobacter simplexTCCC11307-UV15X1-2， CGMCC No.14539)

<400> 4

atgacgatcg cgacgcccgc cgacctgcag cgggcgatgc aggcgccgtt cccgcccagc 60

gacgagcagt gggccgcgat cagcgccccg ctgcgcccgg ccgtggtcat cgccggcgcc 120

gggtccggca agacgacgct gatggcggcg cgcgtggtct acctggtgct gaccgggcag 180

gtccggcccg aagaggtgct cggcctgacc ttcaccacca aggccgcggc cgagctgcgc 240

cagcgcatcc gcaccgcact gcgggacgcc ggggcgctcg acctcagcgg gccggcgtcc 300

ggtcccgacg aggccgacga ggtgctcgag ccgacggtcg ccacctacaa cgcctacgcg 360

tccgggctgc tcaccgacca cggcctgcgg atcggtcacg agcccgacac ccgggtgatc 420

accgacgccg cgcgctacca gctcggcgcg cgggcggtcg accggttcac cggcgagatc 480

gcgctgctca ccgaccatcc cgagaccgcc atccagaacc tcctcgcgct cgactccgcg 540

atgagcgagc acctggtcgg ccccgacgac gtcctggccc acgacgcggc ggcccggcgc 600

ggcttcgagc gcgcccgcga cgaggagctg gccggcaagg gccgcaagac ctacgtcgac 660

gcggtcgaga aggcgatctc cgcgatcgac cgccggggcg agctgctgca gctcgtggcg 720

tcgtaccggg ggctgaagcg cgacctgggg ctgatggact tctccgacca gatcgagctc 780

ggcgcccggc tggcggccga gcggcccgag gtcggcgaga tcgagcgggg ccggttcaag 840

gtggtgctgc tcgacgagta ccaggacacc tcggtggccc aggcgatcat gctctcgcgg 900

ctgttctccg cacccgagcc cgggcagggg ctggggcacg cggtgaccgc ggtgggcgac 960

cccaaccagg cgatctacgg gtggcgcggt gcctcggtgg ccaacatcct caacttcgcc 1020

cagaccttcc cggcggccga cggcacgccg accacctacg cgctgaccgt caaccgccgc 1080

tccgaccggc gcatcctcga cgtcgcgagc cacctggccg agccgctcta cgacgcgctc 1140

gagacccggg gcgcgggggt cgcgcggctg cgggcgcccg agggcgcggt cgacggcacg 1200

gtcgaggcgc gcaccttcga gacccagcgc gacgagctgg cctggctggc ggccgaggtc 1260

cgtgcggccc acggcggcga cccgggcgac tgggcccaca tcggcgtgct gacccgcgac 1320

aacgcccacg ccgagctggt cttcgacgcg ctgaccacgg cgggcgtccc ggtcgagatc 1380

gtgggtctgt ccgggctgct ccggctgccc gagatcgccg agatcgtggc ggtcctgcgg 1440

ctgctgcacg acgtcaccga caacgccgcg ctgctgacgc tgctggccgg cccgcgctgg 1500

gccatcggtc cgcgcgacct gcggctgctc ggccagcgcg ccggcgagct ggccggccgg 1560

cggggacgct ccgccgacgt cgtcaccgtc tccgagcagc tggtggcgat cgccgacggc 1620

atcgacccgg ccgaggtccc ctgcctcgac gacgcgctgg ccgatcccgg cgagggcgac 1680

ttctccgccg aggcgcgcga gcggttcggg ctgctgcgcg acgagctgcg gctgctgcgg 1740

gcggcggtcg gcgagccgct gctcgacctg gtccggcgga tcatcgacgt caccggcgtc 1800

gacgtcgagc tcgcctcggc ggtcagcccg gccgcggcgg cgcggcgcga caacctcgac 1860

ctcttcgtca aggccgtggc cgacttccag gccgtcgacg gcgacgtctc gctgccggcg 1920

ctgctggcct acctcaccgc cgaggacgac cagggcaacg gcctcgacat cgccacgccc 1980

accgaggccg actcggtcaa gctgctcacc gtccaccgct ccaagggcct cgagtgggcg 2040

accgtgttct gcgtcggcgt ctgcgagtcg cggttcccgt cagcccaggg acgcacgctg 2100

tgggtgtcct cgcccgccgt gctcccggcg gcgctgcgcg gcgacgcggc cgacctgccc 2160

cagctcgagg gctacgacaa ggcggcgctc gacgactacc ggcggcggtc caaggcccat 2220

gaggccgacg aggagctccg gctcggctac gtcgccttca cccgcgccgc ccaccggctg 2280

gcggtcagct ccttccagtg ggggccgcgc aagacgccct acggaccgtc ggcctaccaa 2340

gaggcggtgc gcgagatgct caccgcctgg gacctcgccc cggagccgtg gctgacccgc 2400

cccgacaagg gcgccgccaa cccctacgac gccgaggacc cggcccggcc ctggccggcc 2460

gacggtgtcg gcgacgaggc gcggctgcgg ctggccgctg cggcgctggt gggtgccgcc 2520

gatcccgacg gccccgaccc cgagctcgac atcgtcaccg cggcgcgggt cgccgagtgg 2580

gacgccgaga tcgagcagct cctcgccgag gcacggctcg cgtccggtgc gggcggcgag 2640

gtcgtcgtgc cgatgccggc gtcgttgtcc gcgaccgcgc tcagccggct ccgggacgac 2700

ccccaggcgt tcgcccgcga gctcgtccgc ccgatgccgc ggcccccggc gccggccgcc 2760

cggttcggca cccgcttcca cgcctgggtc gaggcccgct tcggccagca gggactgttc 2820

gaccccgacg agctgtccgg ccgggccgac gccggcatcg acgacgaggc cgacctcaag 2880

gagctcgtcg ccgccttcga ggagggcccc ttcggcagcc gggtgcccta cgcggtcgag 2940

gcgccgttcg cgctcgtgct cgacgcggcc gacgggcggc gccaggtgat ccgcggccgg 3000

atcgacgcgg tctacgccga gcccgacggc tcgttcctgg tcgtcgactg gaagaccagc 3060

gcccgccagg aggccgaccc cctccagctc gcggtctacc ggctggcctg ggccgagctc 3120

cgggggcttc cgccggagcg ggtgcgggcc ggcttctact acgtgcgccg cggcgagctc 3180

gtcgtgcacg acgagctcgc cggccgagag gaggtgctgt ccctcctggg gtga 3234

<210> 5

<211> 2211

<212> DNA

<213> 简单节杆菌(Arthrobacter simplexTCCC11307-UV15X1-2， CGMCC No.14539)

<400> 5

atgcccgaga gcaccgaaca caccgaaccc ctcgtgaccg aggagccgca ggatgcgcag 60

cagtccgcgg gcaagtgccc ggtcatgcac ggtggcctga cccaccccac caccggctcg 120

ccgaaccagc agtggcggcc caacaagctc aacctcaaga tcctcgccaa gaacccggcc 180

gtggccgacc cgttcggtgg cgacttcgac tacaaggccg ccttcctcgc gctcgacctc 240

gaggccgtca aggccgacgt caaggccgtg ctgaccgact cgaaggactt ctggccggcc 300

gacttcggcc actacggccc gccgttcgtc cggatggcgt ggcacgcggc cggcacctac 360

cgggccaccg acggccgcgg cggtgccggg cacggccagc agcgcttcgc gccgaccaac 420

tcctggcccg acaacggcaa cctcgacaag gcccgccggc tgctctggcc ggtcaagaag 480

aagtacggca agtccctctc gtggggcgac ctgctcatcc tcgccggcaa cgtcgcgcag 540

gaggacatgg gcttcccgat cttcggcttc ggcggcggcc gccccgacgt ctgggaggcc 600

gacgacgacg tctactgggg tcccgagacc gtgtggctcg aggacgagcg ctacagcggt 660

gagcgcgacc tcgacgaccc gctcgccgcg gtccagatgg gcctgatcta cgtcaacccc 720

gagggcccca acggcaaccc cgacccgctg gcgtcggccg tcgacatcaa ggagaccttc 780

ggccgcatgg gcatgacggt cgaggagacc gtggcgctca tcgccggtgg gcacaccttc 840

ggcaagaccc acggcaacgg cccggccgag gccgtcggtc ccgagccgga ggccgccccg 900

atcgaggagc agggcctggg ctggaagtcc tcgcacgcct cgggcaaggg catcgacgcc 960

atcacgtcgg gcctcgaggt cacctggacc taccacccga cccgctggga caacgagttc 1020

ttccacatcc tcttcgccta cgactgggag ctcttcgagt ccccggccgg cgcgaagcag 1080

tggcgcccga agaacaacgg cggtgccgac ctggtgcccg agtcgttcgg cgagggcaag 1140

cgcgagccgc gcatgctgac ctccgacctc gccctgcgcg aggaccccga gatgcgcgag 1200

atctcgctgc ggttcaagga ggaccaggac gccttcaccg acgcctacgc ccgcgcgtgg 1260

ttcaagctga cccaccgcga catgggcccg aagtcgcgct acctcggcgc cgacgtcccg 1320

gccgaggact tcgtctggca ggacccggtc cccgccggcc gcgagctgag cgacgaccag 1380

gtcgccggtc tcaagaaggc gatcgccgcc gcgggcctct cggtctcgca gctcgtctcg 1440

acggcgtggg cctccgcgtc gacgtaccgc agctccgaca agcgcggtgg cgccaacggt 1500

gcccggatcg cgctcgagcc gcagaagtcg tgggcgatca accgtcccgc cgagctcgca 1560

ccggtcctcg ccaagctcca ggagatcgcg accgcccagg gcgcctcgct ggccgacacg 1620

atcgtcatcg ccggctccgt gggcgtcgag caggccgccg ccgcggccgg cgtcgacctc 1680

accgtcacga ccaccaccgg tcgcggcgac gccacccagg agcagaccga cgtcgagtcg 1740

ttcggctacc tcgagcccaa ggccgacggc ttccgcaact acctgccgaa gtcgagcaag 1800

tacccgagcg agttcgccct cgtcgaccgc gccaacctgc tcggcgtcag cgcgccggag 1860

ctcaccgtcc tcatcggcgg cctccgcgtg ctcggcacca actgggacgg ctcggacctc 1920

ggcgtgctca ccgaccgccc gggcgtgctg acgaacgact tcttcgtcaa cctgctcgag 1980

ctcggcacca cgtggaccgc gacggacgag tccgaggagg tcttctcggg caccaccgag 2040

gacggccgca cctggaccgg cagccgcaac gacctcgtgt tcggctcgaa ctccgagctg 2100

cgcgccctcg ccgaggtcta cgccagcgac gacgcgaacg agaagttcgt ccgcgacttc 2160

gccgccgcct ggaccaaggt catggacgcc gaccgctggg acctgcgctg a 2211

<210> 6

<211> 621

<212> DNA

<213> 简单节杆菌(Arthrobacter simplexTCCC11307-UV15X1-2， CGMCC No.14539)

<400> 6

atgtccgcct acgccctccc cgacctcccc tacgactact ccgcgctcga gccgtacctc 60

tccggcgaga tcatggagct gcaccacagc aagcaccaca acgcctacgt cacgggcatc 120

aacaccgccg tcgagcagct cgccgaggcc cgcgagcagg agtccttcgg cagcctctcg 180

acgctggaga agaacctcgc gttccacctc ggcggccacg tcaaccactc ggtcttctgg 240

ccgaacatgt cccccgacgg cggtgacaag ccgaccggtg agctcgcgca ggcgatcgac 300

gagtacttcg gcggcttcga caagttccgt gcgcacttcc aggccaacgc gctcggcgtc 360

cagggctccg ggtggtcggt gctgacgtgg gacgtcctgg ggcagcggcc gtacatcatc 420

cagcacttcg accaccaggg gaacgtcccg gtctgcatgg tcccgctgct catgctcgac 480

atgtgggagc acacgtacta cctgcagtac aagaacgaca aggccacctt cgtgcagcag 540

tggtggaata tcgtcaactg ggccgacgtc cagcgccggt tcgacgccgc gctctcgcag 600

accccgggcc tgatcgcatg a 621

<210> 7

<211> 1704

<212> DNA

<213> 简单节杆菌(Arthrobacter simplexTCCC11307-UV15X1-2， CGMCC No.14539)

<400> 7

gtgacgttga ccgacgccgt ggtcgtgaac gaggagcccg agtggttccg gacggccgtc 60

ttctacgagg tcctggtccg gtcgttccgc gacgccgacg ccgacggcac cggcgacttc 120

caggggctga ccgagaagct cgactacctg cagtggctgg gcgtcgactg cctgtgggtg 180

ccgccgttct tctcgtcccc cctgcgcgac ggcgggtacg acgtcgcgga ctacaccaac 240

atcctccccg agatcggcac ggtcgaggac ttccaccgct tcctcgacgc cgcgcacgag 300

cgcggcatcc gggtgatcat cgacttcgtc atgaaccaca cgagcgacgc gcacccgtgg 360

ttccaggcct cgcgcagcga tcccgagggc ccctatggcg acttctacgt gtggtccgac 420

accgacgagc tctaccagga cgcacggatc atcttcgtcg acaccgagcc gtcgaactgg 480

acgtgggacc cggtgcgcgg ccagtacttc tggcaccgct tcttccatca ccagcccgac 540

ctcaacttcg acaaccccaa ggtccacgac gcgatgctcg aggcgatggc gttctggctc 600

gacatgggcc tcgacgggtt ccggctcgac gcggtgccct atctctacga gcggcccggc 660

accaacggcg agaacctgcc cgagacgcac gagatgctca agaaggtgcg ccggttcgtc 720

gacgacaact atcccggccg ggtcctgctg tgcgaggcga accagtggcc gaccgacgtc 780

gtggagtact tcggcgaccc cgccgtcggt ggcgacgagt gccacatggc cttccacttc 840

ccggtgatgc cgcgcatctt catggcggta cggcgcgagt cgcggttccc gatctcggag 900

atcatggcgc agacgccgga catccccgac ggctgccagt ggggcatctt cctgcgcaac 960

cacgacgagc tgacgctcga gatggtcgcc gacgaggacc gcgactacat gtggggcgag 1020

tacgccaagg acccccgcat gaaggccaac atcggcatcc gccgccggct cgcaccgctg 1080

ctcgacaacg acaccaacca gatcgagctg ttcaccgcgc tgctgctgtc gctgcccggc 1140

tcgcccgtcc tgtactacgg cgacgagatc ggcatgggcg acaacatctg gctgggcgac 1200

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Gly Leu Gly Trp Lys Ser Ser His Ala Ser Gly Lys Gly Ile Asp Ala

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Ile Thr Ser Gly Leu Glu Val Thr Trp Thr Tyr His Pro Thr Arg Trp

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Asp Asn Glu Phe Phe His Ile Leu Phe Ala Tyr Asp Trp Glu Leu Phe

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Met Leu Thr Ser Asp Leu Ala Leu Arg Glu Asp Pro Glu Met Arg Glu

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Ile Ser Leu Arg Phe Lys Glu Asp Gln Asp Ala Phe Thr Asp Ala Tyr

405 410 415

Ala Arg Ala Trp Phe Lys Leu Thr His Arg Asp Met Gly Pro Lys Ser

420 425 430

Arg Tyr Leu Gly Ala Asp Val Pro Ala Glu Asp Phe Val Trp Gln Asp

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Pro Val Pro Ala Gly Arg Glu Leu Ser Asp Asp Gln Val Ala Gly Leu

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Lys Lys Ala Ile Ala Ala Ala Gly Leu Ser Val Ser Gln Leu Val Ser

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485 490 495

Gly Ala Asn Gly Ala Arg Ile Ala Leu Glu Pro Gln Lys Ser Trp Ala

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515 520 525

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530 535 540

Gly Ser Val Gly Val Glu Gln Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Asp Leu

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Thr Val Thr Thr Thr Thr Gly Arg Gly Asp Ala Thr Gln Glu Gln Thr

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Asp Val Glu Ser Phe Gly Tyr Leu Glu Pro Lys Ala Asp Gly Phe Arg

580 585 590

Asn Tyr Leu Pro Lys Ser Ser Lys Tyr Pro Ser Glu Phe Ala Leu Val

595 600 605

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Asn Leu Leu Glu Leu Gly Thr Thr Trp Thr Ala Thr Asp Glu Ser Glu

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<213> 简单节杆菌(Arthrobacter simplexTCCC11307-UV15X1-2， CGMCC No.14539)

<400> 13

Met Ser Ala Tyr Ala Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Asp Tyr Ser Ala Leu

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<213> 简单节杆菌(Arthrobacter simplexTCCC11307-UV15X1-2， CGMCC No.14539)

<400> 14

Val Thr Leu Thr Asp Ala Val Val Val Asn Glu Glu Pro Glu Trp Phe

1 5 10 15

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Asp Ala Asp Gly Thr Gly Asp Phe Gln Gly Leu Thr Glu Lys Leu Asp

35 40 45

Tyr Leu Gln Trp Leu Gly Val Asp Cys Leu Trp Val Pro Pro Phe Phe

50 55 60

Ser Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Asp Val Ala Asp Tyr Thr Asn

65 70 75 80

Ile Leu Pro Glu Ile Gly Thr Val Glu Asp Phe His Arg Phe Leu Asp

85 90 95

Ala Ala His Glu Arg Gly Ile Arg Val Ile Ile Asp Phe Val Met Asn

100 105 110

His Thr Ser Asp Ala His Pro Trp Phe Gln Ala Ser Arg Ser Asp Pro

115 120 125

Glu Gly Pro Tyr Gly Asp Phe Tyr Val Trp Ser Asp Thr Asp Glu Leu

130 135 140

Tyr Gln Asp Ala Arg Ile Ile Phe Val Asp Thr Glu Pro Ser Asn Trp

145 150 155 160

Thr Trp Asp Pro Val Arg Gly Gln Tyr Phe Trp His Arg Phe Phe His

165 170 175

His Gln Pro Asp Leu Asn Phe Asp Asn Pro Lys Val His Asp Ala Met

180 185 190

Leu Glu Ala Met Ala Phe Trp Leu Asp Met Gly Leu Asp Gly Phe Arg

195 200 205

Leu Asp Ala Val Pro Tyr Leu Tyr Glu Arg Pro Gly Thr Asn Gly Glu

210 215 220

Asn Leu Pro Glu Thr His Glu Met Leu Lys Lys Val Arg Arg Phe Val

225 230 235 240

Asp Asp Asn Tyr Pro Gly Arg Val Leu Leu Cys Glu Ala Asn Gln Trp

245 250 255

Pro Thr Asp Val Val Glu Tyr Phe Gly Asp Pro Ala Val Gly Gly Asp

260 265 270

Glu Cys His Met Ala Phe His Phe Pro Val Met Pro Arg Ile Phe Met

275 280 285

Ala Val Arg Arg Glu Ser Arg Phe Pro Ile Ser Glu Ile Met Ala Gln

290 295 300

Thr Pro Asp Ile Pro Asp Gly Cys Gln Trp Gly Ile Phe Leu Arg Asn

305 310 315 320

His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met Val Ala Asp Glu Asp Arg Asp Tyr

325 330 335

Met Trp Gly Glu Tyr Ala Lys Asp Pro Arg Met Lys Ala Asn Ile Gly

340 345 350

Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro Leu Leu Asp Asn Asp Thr Asn Gln Ile

355 360 365

Glu Leu Phe Thr Ala Leu Leu Leu Ser Leu Pro Gly Ser Pro Val Leu

370 375 380

Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asn Ile Trp Leu Gly Asp

385 390 395 400

Arg Asp Gly Val Arg Thr Pro Met Gln Trp Thr Pro Asp Arg Asn Ala

405 410 415

Gly Phe Ser Ala Ala Thr Pro Gly Lys Leu His Leu Pro Val Ile Gln

420 425 430

Asp Pro Val Tyr Gly Tyr Gln Ser Val Asn Val Glu Ala Gln Leu Glu

435 440 445

Asn Pro Ser Ser Leu Leu His Trp Thr Arg Arg Met Ile His Ile Arg

450 455 460

Arg Gln His Asp Ser Phe Gly Leu Gly Thr Phe Thr Asp Leu Gly Gly

465 470 475 480

Ser Asn Pro Thr Val Leu Ser Tyr Val Arg Glu Leu Pro Gly Ser Gln

485 490 495

Asp Asp Met Ile Leu Cys Val Asn Asn Leu Ser Arg Phe Pro Gln Pro

500 505 510

Val Glu Leu Asp Leu Arg Arg Phe Glu Gly Arg Val Pro Val Glu Leu

515 520 525

Leu Gly Gly Val Pro Phe Pro Arg Ile Gly Glu Leu Pro Tyr Leu Leu

530 535 540

Thr Leu Ser Gly His Gly Phe Tyr Trp Phe Arg Leu Thr Asp Pro Glu

545 550 555 560

Thr Thr Gly Arg Pro Val

565

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

cgggatccaa tgtcgaagct gattgctttc aac 33

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

tgctctagag aagtccatgc cgcccatg 28

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

cgggatccaa tggcacgagc tgtcggcatc 30

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

tgctctagac ttggactcgc cctcggtg 28

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

ggggtaccaa tggctggaga cgaccgc 27

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

tgctctagag aacgagtcga cgccgatc 28

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

cgggatccag tgagcacgac gatcccgatg 30

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

tgctctagac cccaggaggg acagcacc 28

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

cgggatccaa tgcccgagag caccgaacac ac 32

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

tgctctagag cgcaggtccc agcggtcg 28

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

cgggatccaa tgtccgccta cgccctcccc g 31

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

tgctctagat gcgatcaggc ccggggtct 29

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

ggggtaccag tgacgttgac cgacgccgtg g 31

<210> 28

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

tgctctagac agcaccggcc tccctgtcgt ct 32

Claims

1.一株具有胁迫耐受性的简单节杆菌突变菌株，其特征在于，所述突变株具体为简单节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC11307-UV15X1-2，保藏编号CGMCC No.14539。

2.一株具有胁迫耐受性的简单节杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以简单节杆菌CGMCC No.14539为宿主细胞，过表达序列表SEQ ID No.8-14任一所示的抗逆蛋白所得。

3.如权利要求2所述的一株具有胁迫耐受性的简单节杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以pART2质粒为表达载体，pART2质粒的GenBanK登录号为：DQ191047。

4.如权利要求2所述的一株具有胁迫耐受性的简单节杆菌基因工程菌，其特征在于，SEQ ID No.8对应的抗逆蛋白为GroEL，其编码基因groEL的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；SEQ ID No.9对应的抗逆蛋白为DnaK，其编码基因dnaK的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；SEQ ID No.10对应的抗逆蛋白为RecA，其编码基因recA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；SEQ ID No.11对应的抗逆蛋白为UvrD，其编码基因uvrD的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；SEQ ID No.12对应的抗逆蛋白为KatG，其编码基因katG的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；SEQ ID No.13对应的抗逆蛋白为SOD，其编码基因sod的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；SEQ ID No.14对应的抗逆蛋白为TreS，其编码基因treS的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

5.权利要求2所述的一株具有胁迫耐受性的简单节杆菌基因工程菌的构建方法，具体如下：

(1)以突变株TCCC11307-UV15X1-2基因组为模板，PCR扩增得到该菌株中的groEL，dnaK，recA，uvrD，katG，sod，treS基因；

(2)利用基因工程的手段将上述基因分别连接到大肠杆菌-节杆菌穿梭质粒pART2的启动子后，转化到大肠杆菌DH5α中进行复制；

(3)提取重组质粒，分别电转化到简单节杆菌突变株TCCC11307-UV15X1-2中进行过表达。

6.权利要求1所述简单节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC11307-UV15X1-2在催化醋酸可的松发生C1，2位脱氢反应中的应用。

7.权利要求2所述具有胁迫耐受性的简单节杆菌基因工程菌在催化醋酸可的松发生C1，2位脱氢反应中的应用。

8.如权利要求7所述的具有胁迫耐受性的简单节杆菌基因工程菌的应用，其特征在于，转化体系中的乙醇浓度为8-10％。

9.如权利要求7所述的具有胁迫耐受性的简单节杆菌基因工程菌的应用，其特征在于，转化体系中底物醋酸可的松的浓度为6-8g/L。