CN110628735B - 一种5α-还原酶突变体，基因工程菌及其在高效催化5α-AD生产中的应用 - Google Patents

一种5α-还原酶突变体，基因工程菌及其在高效催化5α-AD生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种5α‑还原酶突变体，通过定点突变改造的5α‑还原酶获得5α‑还原酶突变体，构建其基因工程菌并应用在高效催化5α‑AD生产中的应用，定点突变改造的5α‑还原酶是将第187位酪氨酸突变为苯丙氨酸，将5α‑还原酶突变体重组质粒电转至分枝杆菌中进行异源表达，再对其酶活性和生产效率进行测定，发现5α‑还原酶突变体的分枝杆菌基因工程菌酶活力提高了2.3倍，其催化效率提高了22.8％，对5α‑AD的生产由原来的1.45g/L提高到了1.78g/L；将5α‑还原酶突变体作为重要甾体药物中间体生产的关键酶，可以明显提高生物转化的效率和产品的得率。

Description

一种5α-还原酶突变体，基因工程菌及其在高效催化5α-AD生 产中的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，尤其是涉及一种5α-还原酶突变体及其在高效催化5α-AD生产中的应用。
背景技术
甾体5α-还原酶属于还原型辅酶II(NADPH)依赖型酶，其能够催化一系列类固醇底物在4,5位双键发生还原作用，并将C-5位上的氢加成在α位上成为相应的5α-还原产物。例如，睾酮(TS)在5α-还原酶的作用下被还原成一种活性更强的甾体激素：双氢睾酮(DHT)，其在雄激素的生理调节以及人的两性分化等方面，发挥着极其重要的作用；雄甾-4-烯-3,17二酮(AD)能够在类固醇5α-还原酶的催化作用被还原为重要的甾体药物中间体：5α-雄烯二酮(5α-AD)中间体。
一些化学法和生物法可用于合成重要甾体化合物5α-AD，但化学法往往伴随着反应步骤多、环境污染大、过程不好控制等问题。生物法因其条件温和、环境友好、专一性强等优势，已越来越受关注。但现已发现的5α-还原酶，其对底物表现的活性并不能满足工业化生产的要求，在一定程度上限制了其应用。随着人们对5α-还原酶的功能和作用机理的认识的不断深入，采用基因工程技术改造酶分子以获得具有优良酶学性质的5α-还原酶，成为今后生物催化领域的另一发展趋势。采用基因工程技术改造酶分子以获得具有优良酶学性质的5α-还原酶，成为今后生物催化领域的另一发展趋势。目前关于5α-还原酶的分子改造，主要是对底物睾酮的酶活力研究，而且其催化效率并不理想；5α-还原酶是催化AD生产5α-AD的关键酶，目前针对底物AD的5α-还原酶基因的改造还没有报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种5α-还原酶突变体，基因工程菌及其在高效催化5α-AD生产中的应用。
本发明采用的技术方案是：一种5α-还原酶突变体，将5α-还原酶中的一个酪氨酸突变为苯丙氨酸。
优选地，将序列如SEQ ID NO.2所示的的5α-还原酶中第187位酪氨酸突变为苯丙氨酸，5α-还原酶突变体序列如SEQ ID NO.4所示。
一种编码5α-还原酶突变体的基因序列，序列如SEQ ID NO.3所示。
一种包含5α-还原酶突变体的基因工程菌的制备方法，将5α-还原酶基因和表达载体连接构建携带5α-还原酶基因的重组质粒，通过重叠延伸PCR进行定点突变获得5α-还原酶突变体重组表达载体，转入到主产AD的分枝杆菌中获得5α-还原酶突变体的基因工程菌；
优选地，表达载体是大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261。
优选地，主产AD的分枝杆菌为MNR M3△ksdd。
具体制备方法如下：
步骤一将5α-还原酶基因片段与表达载体pMV261连接构建得到重组质粒pMV261-5α；
步骤二以重组质粒pMV261-5α为模板，设计引物进行重叠延伸PCR，得到第187位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸的5α-还原酶突变体重组表达载体pMV261-5αY187F；
步骤三将5α-还原酶突变体重组表达载体pMV261-5αY187F电转到主产AD的分枝杆菌MNR M3△ksdd，获得5α-还原酶突变体的分枝杆菌基因工程菌MNR M3△ksdd/pMV261-5αY187F；
优选地，步骤一中5α-还原酶基因片段序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，步骤二中引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
一种包含5α-还原酶突变体的重组表达载体；优选地，表达载体是大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261。
一种包含5α-还原酶突变体的基因工程菌；优选地，宿主菌为主产AD的分枝杆菌为MNR M3△ksdd。
5α-还原酶突变体的基因工程菌的制备方法制备所得的5α-还原酶突变体的基因工程菌在5α-AD生产中的应用。
优选地，利用5α-还原酶突变体基因工程菌发酵制备5α-AD，按8％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，28-32℃，130-250r/min，pH 6.5-7.8条件下，发酵4-8d。
优选地，发酵培养基组成为：K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇1-30g/L，其余为水，pH6.5-7.8。
本发明具有的优点和积极效果是：在5α-还原酶基础上，通过定点突变生物技术改造5α-还原酶分子结构，通过质粒pMV261，在主产AD的分枝杆菌中实现了5α-还原酶突变体的成功表达，得到一株5α-还原酶分枝杆菌工程菌株，提高了其在分枝杆菌中的5α-还原酶酶活力，突变酶酶活力提高了2.3倍，也提高了5α-AD的产量，其催化效率提高了22.8％，对5α-雄烯二酮的产量由原来的1.45g/L提高到了1.78g/L；本发明解决了5α-还原酶催化活性低的限制问题，为5α-还原酶的分子改造提供了一条新的思路。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的一个实施例做出说明。
一种5α-还原酶突变体，将5α-还原酶中的一个酪氨酸突变为苯丙氨酸，使其能够提高酶活力，在5α-AD生产中实现高效催化。具体为将序列如SEQ ID NO.2所示的的5α-还原酶中第187位酪氨酸突变为苯丙氨酸，从而形成5α-还原酶突变体，5α-还原酶突变体序列如SEQ ID NO.4所示。5α-还原酶基因序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，5α-还原酶突变体基因序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示.
SEQ ID NO.1
ATGGAGCGGCTCATCTTCATCTTCAACATCACCCAGATCGTCCTCTTCGGCGTCGGTCTGATCTGCTTTGTGGTGCTGTTCTTCGTCCCGGCGGGCTACGGCAAGATGATCAACAAGAAGTGGGGCTTCTCGTTCAACAACAAGATCGCTTGGTTTTTAATGGAGGTGCCGACTTTAATCACCATGATCGTTTTAATGTGCGTGTGGGCCAAGCCCGAGAACTTCGTGCGGATCATCATCGGTTTATTCTTCGTGCTGCATTACGCCCAGCGGGTGTTCATCTTCCCCTTTTTACTGAAGGGCAAGTCCAAGATGCCGATTTTAATCGTGCTGATGGGCATCACCTTCAACACCATCAACGCCTTTTTAATCGGTGCTTGGCTCTTTTATTTATCGCCCAAGACCATGTACCCGATCTCTTGGCTGTACGACCCGCGCTTCATCATCGGTGCCCTCGTGTTTTTACTGGGCATGGCCATCAACATCGACTCGGACAAGTACATCCGCTCGCTGCGCAAGCCGGGTGACACCGCCCACTACTTCCCCCACAAGCGGATGTACAAGTACGTCTCCTCGGCCAACTACTTCGGTGAGATTTTAGAGTGGTTCGGCTTCGCTTTACTGTCGTGGTCGTTCGTCGGTCTGCTGTTTGCCTTCTGGACTTGTGCCAATTTAGTCCCCCGGGCCTACACGATCAACAAGCGCTACCGCGAGGAGTTCCCGGAGGAGTTCGCCGCGCTGAAGCCGAAGCGCGTCTTCCCGTTCATTTTCTGA
SEQ ID NO.2
MERLIFIFNITQIVLFGVGLICFVVLFFVPAGYGKMINKKWGFSFNNKIAWFLMEVPTLITMIVLMCVWAKPENFVRIIIGLFFVLHYAQRVFIFPFLLKGKSKMPILIVLMGITFNTINAFLIGAWLFYLSPKTMYPISWLYDPRFIIGALVFLLGMAINIDSDKYIRSLRKPGDTAHYFPHKRMYKYVSSANYFGEILEWFGFALLSWSFVGLLFAFWTCANLVPRAYTINKRYREEFPEEFAALKPKRVFPFIF
SEQ ID NO.3
ATGGAGCGGCTCATCTTCATCTTCAACATCACCCAGATCGTCCTCTTCGGCGTCGGTCTGATCTGCTTTGTGGTGCTGTTCTTCGTCCCGGCGGGCTACGGCAAGATGATCAACAAGAAGTGGGGCTTCTCGTTCAACAACAAGATCGCTTGGTTTTTAATGGAGGTGCCGACTTTAATCACCATGATCGTTTTAATGTGCGTGTGGGCCAAGCCCGAGAACTTCGTGCGGATCATCATCGGTTTATTCTTCGTGCTGCATTACGCCCAGCGGGTGTTCATCTTCCCCTTTTTACTGAAGGGCAAGTCCAAGATGCCGATTTTAATCGTGCTGATGGGCATCACCTTCAACACCATCAACGCCTTTTTAATCGGTGCTTGGCTCTTTTATTTATCGCCCAAGACCATGTACCCGATCTCTTGGCTGTACGACCCGCGCTTCATCATCGGTGCCCTCGTGTTTTTACTGGGCATGGCCATCAACATCGACTCGGACAAGTACATCCGCTCGCTGCGCAAGCCGGGTGACACCGCCCACTACTTCCCCCACAAGCGGATGTTCAAGTACGTCTCCTCGGCCAACTACTTCGGTGAGATTTTAGAGTGGTTCGGCTTCGCTTTACTGTCGTGGTCGTTCGTCGGTCTGCTGTTTGCCTTCTGGACTTGTGCCAATTTAGTCCCCCGGGCCTACACGATCAACAAGCGCTACCGCGAGGAGTTCCCGGAGGAGTTCGCCGCGCTGAAGCCGAAGCGCGTCTTCCCGTTCATTTTCTGA
SEQ ID NO.4
MERLIFIFNITQIVLFGVGLICFVVLFFVPAGYGKMINKKWGFSFNNKIAWFLMEVPTLITMIVLMCVWAKPENFVRIIIGLFFVLHYAQRVFIFPFLLKGKSKMPILIVLMGITFNTINAFLIGAWLFYLSPKTMYPISWLYDPRFIIGALVFLLGMAINIDSDKYIRSLRKPGDTAHYFPHKRMFKYVSSANYFGEILEWFGFALLSWSFVGLLFAFWTCANLVPRAYTINKRYREEFPEEFAALKPKRVFPFIF
包含5α-还原酶突变体的基因工程菌的制备方法，将5α-还原酶基因和表达载体连接构建携带5α-还原酶基因的重组质粒，携带5α-还原酶基因的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过重叠延伸PCR进行定点突变，把突变质粒连接到表达载体上，得到携带编码突变体基因的重组表达载体，将5α-还原酶突变体重组表达载体电转至主产AD的分枝杆菌中即得到重组分枝杆菌基因工程菌，其中构建表达载体可采用大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261，基因工程菌的宿主菌选用主产AD的分枝杆菌，具体为MNR M3△ksdd。具体制备方法如下：
步骤一将序列如SEQ ID NO.4所示的5α-还原酶基因片段与表达载体pMV261连接构建得到重组质粒pMV261-5α；
步骤二以重组质粒pMV261-5α为模板，设计引物进行重叠延伸PCR，F1primer序列如SEQ ID NO.5所示，R1 primer序列如SEQ ID NO.6所示，得到第187位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸的5α-还原酶突变体重组表达载体pMV261-5αY187F；
步骤三将5α-还原酶突变体重组表达载体pMV261-5αY187F电转到主产AD的分枝杆菌MNR M3△ksdd，获得5α-还原酶突变体的分枝杆菌基因工程菌MNR M3△ksdd/pMV261-5αY187F。
SEQ ID NO.5：CACAAGCGGATGTTCAAGTA
SEQ ID NO.6：TACTTGAACATCCGCTTGTG
为了测定5α-还原酶突变体的分枝杆菌基因工程菌MNR M3△ksdd/pMV261-5αY187F酶活性，可提取其粗酶液，对其酶活进行测定。5α-还原酶酶活测定方法：总反应体系包括：50mM Tris-HCL缓冲液(pH 7.2)，0.6mM溶于甲醇中的AD，适量的粗酶液，加入0.2mM NADPH去启动反应。设定254nm为测定波长，反应温度为30℃，利用紫外分光光度法测定底物AD每分钟的还原量，酶活(U)定义为：每分钟还原1μmol AD所需的酶量为1个酶活单位。
5α-还原酶突变体的基因工程菌的制备方法制备所得的5α-还原酶突变体的基因工程菌在5α-AD生产中的应用。利用5α-还原酶突变体基因工程菌发酵制备5α-AD，按8％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，28-32℃，130-250r/min，pH 6.5-7.8条件下，发酵4-8d。其中，发酵培养基组成为：K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇1-30g/L，其余为水，pH6.5-7.8。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅仅在于更好地理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
实施例1：突变酶基因及重组表达载体的构建
以合成好的带有耻垢密螺旋体5α-还原酶基因的重组质粒pUC57-5α为模板，扩增得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的5α-还原酶基因，将扩增产物与大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261连接，转化至E.coli DH5α中，经抗性筛选、质粒PCR、双酶切验证和DNA测序。选取测序正确并能够稳定遗传的重组质粒命名为pMV261-5α。
以pMV261-5α重组质粒为模板，以F1 primer(序列如SEQ ID NO.5所示)、R1primer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，通过重叠延伸PCR进行定点突变，得到携带编码5α-还原酶突变体基因的重组质粒，命名为pMV261-5αY187F。
PCR反应体系：5×Trans pfu Buffer 10μL，2.5mMdNTPS 4μL，模板DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，Trans FastpfuDNAploy 1μL，ddH2O补齐至总体积50μL。
PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，63℃30s，72℃1min，循环30次，72℃10min，10℃保持。
实施例2：5α-还原酶突变体分枝杆菌工程菌的构建
将实施例1得到的重组质粒pMV261-5αY187F电转至MNR M3△ksdd感受态细胞，筛选能够稳定遗传的菌株即为5α-还原酶突变体分枝杆菌工程菌；具体方法如下：
1)取前期测序正确的质粒10μL加入到融化了的MNR M3Δksdd感受态细胞中，用枪轻轻吹吸混匀，冰浴处理15min左右；
2)将预冷的质粒与感受态细胞混合溶液完全转入1mm的电转杯中(用无水乙醇清洗电转杯后置于无菌操作台，吹干后放于冰上预冷5min)；
3)将装有质粒和感受态细胞混合液的电转杯放置于高压脉冲电转仪上，在1.5-2.5kV电压下，电转4-6ms，电转2次后，冰上放置5min；
4)迅速将电转并预冷后的细胞悬浮液转移至装有800μL LB复苏培养基的无菌离心管中，于30℃，200rpm条件下振荡培养4-6h。
5)将培养好的菌悬液在室温条件下，适当离心后并弃部分上清，剩余菌液吹吸混匀后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，30℃恒温倒置培养至长出单菌落。
6)挑取单菌落至液体种子培养基培养3d左右，进行菌液PCR以及质粒双酶切验证，验证正确的阳性转化子即为5α-还原酶突变体工程菌MNR M3△ksdd/261-5αY187F。
实施例3：5α-还原酶突变体工程菌MNR M3△ksdd/261-5αY187F转化PS生产5α-AD
1)菌种活化培养:
将5α-还原酶突变体工程菌MNR M3△ksdd/261-5αY187F转接于新鲜斜面培养基上，30℃培养3d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种，混合均匀得洗脱液，吸取1mL洗脱液加入到30mL种子培养基中，在30℃，200r/min条件下摇床培养36h得种子培养液；
斜面培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.2；
种子培养基组成：K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，其余为水，pH7.2。
2)植物甾醇微生物转化：
将步骤1中活化的种子培养液按8％(V/V)的接种量转接于装有发酵培养基的250mL挡板瓶中，在30℃，140r/min条件下摇床培养5-8d；
发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇3g/L，其余为水，pH 7.2。
反应结束后，甾体转化物可用同体积的乙酸乙酯等有机溶剂萃取。以薄层层析(TLC)或高效液相色谱(HPLC)分析确定产物的生成情况。
实施例4：5α-还原酶突变体工程菌与原始菌株性能比较
将菌株分为两组，分别进行以下菌株性能的测定。分组如下：
实验组：本发明实施例2所用宿主菌MNR M3△ksdd/261-5αY187F；
对照组：本发明原始基因工程菌：MNR M3△ksdd/261-5α；
5α-还原酶突变体工程菌与原始菌株酶活比较
将两株菌分别转接于新鲜斜面培养基上，30℃培养3d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种，混合均匀得洗脱液，吸取1mL洗脱液加入到30mL种子培养基中，在30℃，200r/min条件下摇床培养36h得种子培养液，当菌株生长到对数生长期时，按8％的接种量转接至装有50mL不含3g/L植物甾醇的发酵培养基中。收集发酵液菌体细胞进行超声破碎，4℃，12000r/min离心30min，取上清液即为粗酶液。
斜面培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.2；
种子培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，其余为水，pH7.2。
发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇3g/L，其余为水，pH 7.2。
5α-还原酶酶活测定：
酶促反应体系：50mMTris-HCL缓冲液(pH 7.2)，0.6Mm AD溶于甲醇中，适量的粗酶液，加入0.2mM NADPH去启动反应。
酶活单位定义：在37℃，PH7.2条件下，一分钟转化1μmol AD生成5α-AD所需的酶量。
结果如表1所示，5α-还原酶突变体工程菌MNRM3△ksdd/261-5αY187F与原始菌MNRM3△ksdd/261-5α相比，其5α-还原酶活力提高了约2.3倍，说明该位点的突变对5α-还原酶活性有明显的促进作用。
表1 5α-还原酶酶活测定
Figure BDA0002220228740000091
实施例5 5α-还原酶突变体工程菌与原始菌株转化PS生产5α-AD比较
将菌株分为两组，分别进行以下菌株性能的测定。分组如下：
实验组：本发明实施例2所用宿主菌MNR M3△ksdd/261-5αY187F；
对照组：本发明原始基因工程菌：MNR M3△ksdd/261-5α；
1)基因工程菌转化植物甾醇实验方法如下：
按照实施例3中菌种活化培养方法，分别将两组菌株经相同的方法活化后，将活化的种子培养液以8％的接种量转接于含有发酵培养基的250mL挡板瓶中，在30℃，140r/min条件下摇床培养5-8d；
发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇3g/L，其余为水，pH 7.2。
2、5α-AD摩尔生成率的检测：
用乙酸乙酯超声萃取发酵液，离心，取乙酸乙酯相0.2mL于1.5mL管中,自然风干后加1mL的流动相，超声溶解，离心后进行HPLC分析。色谱条件：C18柱,流动相为甲醇：水(3：1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为290nm。
3、结果比较：
如表2所示，生物转化4d时，5α-还原酶突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5αY187F的5α-AD生成量为0.68g/L，与原始工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高30.8％；5d时，5α-还原酶突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5αY187F的5α-AD的生成量为0.94g/L，与原始工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高28.8％；6d时，5α-还原酶突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5αY187F的5α-AD生成量为1.39g/L，与原始工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高44.8％；7d后，5α-还原酶突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5αY187F的5α-AD生成量为1.78g/L，与原始工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高22.8％；表明，在植物甾醇转化过程中，5α-还原酶突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5αY187F的转化效率及转化率明显优于原始工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α。
表2重组分枝杆菌转化过程中5α-AD产量(g/L)
Figure BDA0002220228740000101
由上述实施例数据可以看出，通过定点突变生物技术改造5α-还原酶构建的分枝杆菌工程菌株与未经突变的工程菌柱比较，不经在酶活性上提高了2.3倍，在植物甾醇转化过程中的转化效率也得到了提高，解决了5α-还原酶催化活性低的限制问题，为实现高效的工业生产提供实验基础，为5α-还原酶的分子改造提供了一条新的思路。本发明通过文献调研和序列分析相结合的半理性设计，通过定点突变的方法对5α-还原酶特定位点的的氨基酸进行突变，得到酶活力明显提高的突变体，对于提高5α-还原酶的工业化应用具有重要意义。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种5α-还原酶突变体，基因工程菌及其在高效催化5α-AD生产中的应用
<130> 2019
<150> 2019103266387
<151> 2019-04-23
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggagcggc tcatcttcat cttcaacatc acccagatcg tcctcttcgg cgtcggtctg 60
atctgctttg tggtgctgtt cttcgtcccg gcgggctacg gcaagatgat caacaagaag 120
tggggcttct cgttcaacaa caagatcgct tggtttttaa tggaggtgcc gactttaatc 180
accatgatcg ttttaatgtg cgtgtgggcc aagcccgaga acttcgtgcg gatcatcatc 240
ggtttattct tcgtgctgca ttacgcccag cgggtgttca tcttcccctt tttactgaag 300
ggcaagtcca agatgccgat tttaatcgtg ctgatgggca tcaccttcaa caccatcaac 360
gcctttttaa tcggtgcttg gctcttttat ttatcgccca agaccatgta cccgatctct 420
tggctgtacg acccgcgctt catcatcggt gccctcgtgt ttttactggg catggccatc 480
aacatcgact cggacaagta catccgctcg ctgcgcaagc cgggtgacac cgcccactac 540
ttcccccaca agcggatgta caagtacgtc tcctcggcca actacttcgg tgagatttta 600
gagtggttcg gcttcgcttt actgtcgtgg tcgttcgtcg gtctgctgtt tgccttctgg 660
acttgtgcca atttagtccc ccgggcctac acgatcaaca agcgctaccg cgaggagttc 720
ccggaggagt tcgccgcgct gaagccgaag cgcgtcttcc cgttcatttt ctga 774
<210> 2
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Arg Leu Ile Phe Ile Phe Asn Ile Thr Gln Ile Val Leu Phe
1 5 10 15
Gly Val Gly Leu Ile Cys Phe Val Val Leu Phe Phe Val Pro Ala Gly
20 25 30
Tyr Gly Lys Met Ile Asn Lys Lys Trp Gly Phe Ser Phe Asn Asn Lys
35 40 45
Ile Ala Trp Phe Leu Met Glu Val Pro Thr Leu Ile Thr Met Ile Val
50 55 60
Leu Met Cys Val Trp Ala Lys Pro Glu Asn Phe Val Arg Ile Ile Ile
65 70 75 80
Gly Leu Phe Phe Val Leu His Tyr Ala Gln Arg Val Phe Ile Phe Pro
85 90 95
Phe Leu Leu Lys Gly Lys Ser Lys Met Pro Ile Leu Ile Val Leu Met
100 105 110
Gly Ile Thr Phe Asn Thr Ile Asn Ala Phe Leu Ile Gly Ala Trp Leu
115 120 125
Phe Tyr Leu Ser Pro Lys Thr Met Tyr Pro Ile Ser Trp Leu Tyr Asp
130 135 140
Pro Arg Phe Ile Ile Gly Ala Leu Val Phe Leu Leu Gly Met Ala Ile
145 150 155 160
Asn Ile Asp Ser Asp Lys Tyr Ile Arg Ser Leu Arg Lys Pro Gly Asp
165 170 175
Thr Ala His Tyr Phe Pro His Lys Arg Met Tyr Lys Tyr Val Ser Ser
180 185 190
Ala Asn Tyr Phe Gly Glu Ile Leu Glu Trp Phe Gly Phe Ala Leu Leu
195 200 205
Ser Trp Ser Phe Val Gly Leu Leu Phe Ala Phe Trp Thr Cys Ala Asn
210 215 220
Leu Val Pro Arg Ala Tyr Thr Ile Asn Lys Arg Tyr Arg Glu Glu Phe
225 230 235 240
Pro Glu Glu Phe Ala Ala Leu Lys Pro Lys Arg Val Phe Pro Phe Ile
245 250 255
Phe
<210> 3
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggagcggc tcatcttcat cttcaacatc acccagatcg tcctcttcgg cgtcggtctg 60
atctgctttg tggtgctgtt cttcgtcccg gcgggctacg gcaagatgat caacaagaag 120
tggggcttct cgttcaacaa caagatcgct tggtttttaa tggaggtgcc gactttaatc 180
accatgatcg ttttaatgtg cgtgtgggcc aagcccgaga acttcgtgcg gatcatcatc 240
ggtttattct tcgtgctgca ttacgcccag cgggtgttca tcttcccctt tttactgaag 300
ggcaagtcca agatgccgat tttaatcgtg ctgatgggca tcaccttcaa caccatcaac 360
gcctttttaa tcggtgcttg gctcttttat ttatcgccca agaccatgta cccgatctct 420
tggctgtacg acccgcgctt catcatcggt gccctcgtgt ttttactggg catggccatc 480
aacatcgact cggacaagta catccgctcg ctgcgcaagc cgggtgacac cgcccactac 540
ttcccccaca agcggatgtt caagtacgtc tcctcggcca actacttcgg tgagatttta 600
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<210> 4
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Glu Arg Leu Ile Phe Ile Phe Asn Ile Thr Gln Ile Val Leu Phe
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Gly Val Gly Leu Ile Cys Phe Val Val Leu Phe Phe Val Pro Ala Gly
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Tyr Gly Lys Met Ile Asn Lys Lys Trp Gly Phe Ser Phe Asn Asn Lys
35 40 45
Ile Ala Trp Phe Leu Met Glu Val Pro Thr Leu Ile Thr Met Ile Val
50 55 60
Leu Met Cys Val Trp Ala Lys Pro Glu Asn Phe Val Arg Ile Ile Ile
65 70 75 80
Gly Leu Phe Phe Val Leu His Tyr Ala Gln Arg Val Phe Ile Phe Pro
85 90 95
Phe Leu Leu Lys Gly Lys Ser Lys Met Pro Ile Leu Ile Val Leu Met
100 105 110
Gly Ile Thr Phe Asn Thr Ile Asn Ala Phe Leu Ile Gly Ala Trp Leu
115 120 125
Phe Tyr Leu Ser Pro Lys Thr Met Tyr Pro Ile Ser Trp Leu Tyr Asp
130 135 140
Pro Arg Phe Ile Ile Gly Ala Leu Val Phe Leu Leu Gly Met Ala Ile
145 150 155 160
Asn Ile Asp Ser Asp Lys Tyr Ile Arg Ser Leu Arg Lys Pro Gly Asp
165 170 175
Thr Ala His Tyr Phe Pro His Lys Arg Met Phe Lys Tyr Val Ser Ser
180 185 190
Ala Asn Tyr Phe Gly Glu Ile Leu Glu Trp Phe Gly Phe Ala Leu Leu
195 200 205
Ser Trp Ser Phe Val Gly Leu Leu Phe Ala Phe Trp Thr Cys Ala Asn
210 215 220
Leu Val Pro Arg Ala Tyr Thr Ile Asn Lys Arg Tyr Arg Glu Glu Phe
225 230 235 240
Pro Glu Glu Phe Ala Ala Leu Lys Pro Lys Arg Val Phe Pro Phe Ile
245 250 255
Phe
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tacttgaaca tccgcttgtg 20

Claims (11)

1.一种5α-还原酶突变体，其特征在于：将序列如SEQ ID NO.2所示的5α-还原酶中第187位酪氨酸突变为苯丙氨酸，5α-还原酶突变体序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种编码权利要求1所述的5α-还原酶突变体的基因序列，其特征在于：序列如SEQID NO.3所示。
3.一种包含权利要求1所述的5α-还原酶突变体的基因工程菌的制备方法，其特征在于：将5α-还原酶基因和表达载体连接构建携带5α-还原酶基因的重组质粒，通过重叠延伸PCR进行定点突变获得5α-还原酶突变体重组表达载体，转入到主产AD的分枝杆菌中获得5α-还原酶突变体的基因工程菌；
所述表达载体是大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261；
所述主产AD的分枝杆菌为MNR M3△ksdd。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：具体制备方法如下：
步骤一将5α-还原酶基因片段与表达载体pMV261连接构建得到重组质粒pMV261-5α；
步骤二以重组质粒pMV261-5α为模板，设计引物进行重叠延伸PCR，得到第187位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸的5α-还原酶突变体重组表达载体pMV261-5αY187F；
步骤三将5α-还原酶突变体重组表达载体pMV261-5αY187F电转到主产AD的分枝杆菌MNRM3△ksdd，获得5α-还原酶突变体的分枝杆菌基因工程菌MNR M3△ksdd/pMV261-5αY187F；
步骤一中5α-还原酶基因片段序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤二中引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
5.一种包含权利要求2所述的5α-还原酶突变体基因序列的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：表达载体是大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261。
7.一种包含权利要求1所述的5α-还原酶突变体的基因工程菌。
8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于：宿主菌为主产AD的分枝杆菌为MNRM3△ksdd。
9.权利要求3或4所述的制备方法制备所得的5α-还原酶突变体的基因工程菌在5α-AD生产中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：利用所述5α-还原酶突变体基因工程菌发酵制备5α-AD，按8%体积比的接种量转接至发酵培养基中，28-32℃，130-250 r/min，pH6.5-7.8条件下，发酵4-8 d。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基组成为：K2HPO4 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，柠檬酸铁铵 0.05 g/L，柠檬酸 2 g/L，磷酸氢二铵 3.5 g/L，葡萄糖10 g/L，植物甾醇1-30 g/L，其余为水，pH为6.5-7.8。
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