JP4904298B2 - ステロイド5α−レダクターゼ活性の測定方法およびそれに用いるキット - Google Patents
ステロイド5α−レダクターゼ活性の測定方法およびそれに用いるキット Download PDFInfo
- Publication number
- JP4904298B2 JP4904298B2 JP2008052662A JP2008052662A JP4904298B2 JP 4904298 B2 JP4904298 B2 JP 4904298B2 JP 2008052662 A JP2008052662 A JP 2008052662A JP 2008052662 A JP2008052662 A JP 2008052662A JP 4904298 B2 JP4904298 B2 JP 4904298B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- steroid
- reductase
- diol
- dht
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010029908 3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase Proteins 0.000 title claims description 150
- 102000001779 3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase Human genes 0.000 title claims description 150
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 81
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 claims description 112
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 claims description 96
- 102100036504 Dehydrogenase/reductase SDR family member 9 Human genes 0.000 claims description 64
- 101000928746 Homo sapiens Dehydrogenase/reductase SDR family member 9 Proteins 0.000 claims description 52
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 claims description 48
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 47
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 43
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 43
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 34
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 33
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 33
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 32
- CXONXVMMINSQBV-NNYOXOHSSA-N (2r,3r,4s,5r)-5-[[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxymethyl]-2-(3-carbamothioylpyridin-1-ium-1-yl)-4-hydroxyoxolan-3-olate Chemical compound NC(=S)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)[O-])=C1 CXONXVMMINSQBV-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 24
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims description 22
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 22
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 20
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 15
- 101710172561 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 12
- 238000003329 reductase reaction Methods 0.000 claims description 11
- CBMYJHIOYJEBSB-KHOSGYARSA-N 5alpha-androstane-3alpha,17beta-diol Chemical compound C1[C@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 CBMYJHIOYJEBSB-KHOSGYARSA-N 0.000 claims description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 8
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 47
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 29
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 210000001853 liver microsome Anatomy 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- 108010066551 Cholestenone 5 alpha-Reductase Proteins 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N finasteride Chemical compound N([C@@H]1CC2)C(=O)C=C[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](C(=O)NC(C)(C)C)[C@@]2(C)CC1 DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N 0.000 description 11
- 229960004039 finasteride Drugs 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 8
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 8
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 7
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000002677 5-alpha reductase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 4
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 4
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 4
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 0 CC(CC1)C2C(C)(C(*)CC3)C3C1[C@]2O Chemical compound CC(CC1)C2C(C)(C(*)CC3)C3C1[C@]2O 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 3
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 3
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 2
- 208000030172 endocrine system disease Diseases 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- QZLYKIGBANMMBK-UGCZWRCOSA-N 5α-Androstane Chemical compound C([C@@H]1CC2)CCC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CCC[C@@]2(C)CC1 QZLYKIGBANMMBK-UGCZWRCOSA-N 0.000 description 1
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- MUMGGOZAMZWBJJ-UHFFFAOYSA-N CC(CC1)(C(CC2)C(CC3)C1C(C)(CC1)C3=CC1=O)C2O Chemical compound CC(CC1)(C(CC2)C(CC3)C1C(C)(CC1)C3=CC1=O)C2O MUMGGOZAMZWBJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017701 Endocrine disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010020112 Hirsutism Diseases 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- 102100031951 Oxytocin-neurophysin 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000004403 Prostatic Hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 208000012322 Raynaud phenomenon Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001548 androgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000668 atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 239000000598 endocrine disruptor Substances 0.000 description 1
- 231100000049 endocrine disruptor Toxicity 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 208000017497 prostate disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004240 prostatic hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002901 radioactive waste Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000001625 seminal vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000032678 sex differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 150000003515 testosterones Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- -1 thio NADH Chemical compound 0.000 description 1
- 201000010653 vesiculitis Diseases 0.000 description 1
Images
Description
D.W.Frederiksen and J.D.Wilson. Partial characterization of the nuclear reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate: Δ4 -3-ketosteroid 5α-oxidoreductase of rat prostate. J.Biol.Chem., 246: 2584-2593 (1971). K.Normington and D.W.Russell. Tissue distribution and kinetic characteristics of rat steroid 5α-reductase isozymes. J.Biol.Chem., 267: 19548-19554 (1992) K.Pratis, L.O'Donnell, G.T.Ooi, R.I.McLachlan and D.M.Robertson, Enzyme assay for 5α-reductase type 2 activity in the presence of 5α-reductase type 1 activity in rat testis. J.Steroid biochem. Mol. Biol., 75: 75-82 (2000). J.-P. Raynaud, H.Cousse and P.Martin, Inhibition of type 1 and type 2 5α-reductase activity by free fatty acids, active ingredients of Permixon. J.Steroid biochem. Mol. Biol., 82:233-239 (2002). S.J.Assinder, C.Johnson, K.King and H.D.Nicholson. Regulation of 5α-reductase isoforms by oxytocin in the rat ventral prostate. Endocrinol., 145:5767-5773(2004). K.Mitamura, C.Ogasawara, A.Shiozawa, E.Terayama and K.Shimada. Determination method for steroid 5α-reductase activity using liquid chromatography/atmospheric pressure chemical ionization-Mass spectrometry. Anal.Sci., 21: 1241-1244 (2005). S.Ueda and H.Misaki, A highly sensitive enzymatic cycling method for determination of total bile acid in human serum. Clin. Chem., 38: 1057(1992). G.Zhang, A.Cong, G.Xu, C.Li, R. Yang and T.Xia, An enzymatic cycling for the determination of serum total bile acids with recombinant 3α-hydroxysteroid dehydrogenase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 326:87-92(2005). S.Ueda、M.Oda, S.Imamura and M.Ohnishi. Kinetic study of the enzymatic cycling reaction conducted wit 3a-hydroxysteroid dehydrogenase in the presence of excessive thio-NAD+ and NADH. Anal.Biochem., 332: 84-89 (2004). D.W.Russell and J.D.Wilson, Steroid 5α-reductase: Two genes/two enzymes. Annu.Rev.Biochem., 63:25-61 (1994).
[1]
ステロイド5α-レダクターゼ活性の測定方法であって、
ステロイド5α-レダクターゼを含有する被検体にテストステロンを加えて、ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応を所定時間行って5α-ジヒドロテストステロン(5α-DHT)および5α-アンドロスタン-3α,17β-ジオール(A-diol)を生成させ、次いで3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α-HSD)を混合し、NADHおよびチオNADの存在下において、3α-HSDの酵素反応を所定時間行った後、生成したチオNADH量を計測し、チオNADH量の計測量から5α-DHTおよび/またはA-diolの生成量を求め、求めた5α-DHTおよび/またはA-diolの生成量から、ステロイド5α-レダクターゼの活性を求めることを含む、前記測定方法。
[2]
前記NADHおよびチオNADは、前記ステロイド5α-レダクターゼを含有する被検体に前記テストステロンとともに添加するか、または前記ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応後に、前記3α-HSDとともに添加する[1]に記載の測定方法。
[3]
ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応を行った後、3α-HSDの酵素反応を行う前に、ステロイド5α-レダクターゼを失活させる工程を含む、[1]または[2]に記載の測定方法。
[4]
ステロイド5α-レダクターゼに相互作用する物質のスクリーニング方法であって、
ステロイド5α-レダクターゼとテストステロンを含有する系に被検物質を共存させ、ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応を所定時間行って5α-ジヒドロテストステロン(5α-DHT)および5α-アンドロスタン-3α,17β-ジオール(A-diol)を生成させ、次いで3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α-HSD) を混合し、NADHおよびチオNADの存在下において、3α-HSDの酵素反応を所定時間行った後、生成したチオNADH量を計測し、チオNADH量の計測量から5α-DHTおよび/またはA-diolの生成量を求め、求めた5α-DHTおよび/またはA-diolの生成量から、ステロイド5α-レダクターゼの活性を求め、前記被検物質のステロイド5α-レダクターゼの活性への影響を求め、被検物質のステロイド5α-レダクターゼに対する相互作用を評価することを含む、前記スクリーニング方法。
[5]
前記NADHおよびチオNADは、前記ステロイド5α-レダクターゼを含有する被検体に前記テストステロンとともに添加するか、または前記ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応後に、前記3α-HSDとともに添加する[4]に記載のスクリーニング方法。
[6]
ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応を行った後、3α-HSDの酵素反応を行う前に、ステロイド5α-レダクターゼを失活させる工程を含む、[4]または[5]に記載の測定方法。
[7]
前記相互作用が、ステロイド5α-レダクターゼの活性を向上させるものである、[4]〜[6]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[8]
前記相互作用が、ステロイド5α-レダクターゼの活性を低減させるものである、[4]〜[6]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[9]
(i)テストステロン溶液、および(ii)NADPH溶液を含む、ステロイド5α-レダクターゼ反応用試薬セット(試薬セットA)、並びに
(i)NADH溶液、(ii)3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α-HSD)溶液、および(iii)チオNAD溶液を含む、5α-ジヒドロテストステロン(5α-DHT)および/または5α-アンドロスタン-3α,17β-ジオール(A-diol)測定用試薬セットからなる、5α-DHT および/またはA-diol測定用試薬セット(試薬セットB)を含む、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法に用いるためのステロイド5α-レダクターゼの活性測定用キット。
[10]
ステロイド5α-レダクターゼ反応用試薬セット(試薬セットA)が、(iii)緩衝液をさらに含む、[9]に記載の測定用キット。
[11]
5α-DHTおよび/またはA-diol測定用試薬セット(試薬セットB)が、(iv)緩衝液をさらに含む、[9]または[10]に記載の測定用キット。
本発明の第2の態様は、本発明の第1の態様の5α-DHTおよび/またはA-diolの測定方法を利用した、ステロイド5α-レダクターゼ活性の測定方法である。
本発明の第3の態様は、本発明の第2の態様であるステロイド5α-レダクターゼ活性の測定方法を利用した、ステロイド5α-レダクターゼに相互作用する物質のスクリーニング方法である。
本発明の第4の態様は、上記本発明の第1の態様の5α-DHTおよび/またはA-diolの測定方法、本発明の第2の態様であるステロイド5α-レダクターゼ活性の測定方法、本発明の第3の態様であるステロイド5α-レダクターゼに相互作用する物質のスクリーニング方法に利用できる測定用キットである。
以下順次、本発明について説明する。
本発明の第1の態様は、5α-DHTおよび/またはA-diolの測定方法であり、この方法は、5α-DHTおよび/またはA-diolを含有する被検体とNADH、チオNADおよび3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α-HSD) を混合し、3α-HSDの酵素反応を所定時間行った後、生成したチオNADH量を計測し、チオNADH量の計測量から5α-DHTおよび/またはA-diolの含有量を求めることを含む。
本発明の第2の態様は、本発明の第1の態様の5α-DHTおよび/またはA-diolの測定方法を利用した、ステロイド5α-レダクターゼ活性の測定方法である。この測定方法は、ステロイド5α-レダクターゼを含有する被検体にテストステロンを加えて、ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応を所定時間行った後、生成した5α-ジヒドロテストステロン(5α-DHT)および5α-アンドロスタン-3α,17β-ジオール(A-diol)を、NADH、チオNADおよび3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α-HSD) を混合し、3α-HSDの酵素反応を所定時間行った後、生成したチオNADH量を計測し、チオNADH量の計測量から5α-DHTおよび/またはA-diolの生成量を求め、求めた5α-DHTおよび/またはA-diolの生成量から、ステロイド5α-レダクターゼの活性を求めることを含む。
(1)既知量の5α-DHTまたはA-diolを標準物質として同様の方法で3α-HSDの酵素反応を所定時間行い検量線を作成する。
(2)作成した検量線から5α-レダクターゼの反応により生成された5α-DHTとA-diolの総量を算出する。
(3)国際単位の定義から5α-レダクターゼを1分間反応させると1μmoleの5α-DHTおよび/またはA-diolが生成するので、5α-レダクターゼの反応時間から5α-レダクターゼ活性を求める。これを式にあらわすと以下の通りである。
本発明の第3の態様は、本発明の第2の態様であるステロイド5α-レダクターゼ活性の測定方法を利用した、ステロイド5α-レダクターゼに相互作用する物質のスクリーニング方法である。本発明の第2の態様であるステロイド5α-レダクターゼ活性の測定方法は、上記のように、本発明の第1の態様の5α-DHTおよび/またはA-diolの測定方法を利用する方法である。
(1)ステロイド5α-レダクターゼとテストステロンを含有する系に被検物質を共存させ、ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応を所定時間行った後、
(2)生成した5α-ジヒドロテストステロン(5α-DHT)および5α-アンドロスタン-3α,17β-ジオール(A-diol)を、NADH、チオNADおよび3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α-HSD) を混合し、3α-HSDの酵素反応を所定時間行った後、生成したチオNADH量を計測し、チオNADH量の計測量から5α-DHTおよび/またはA-diolの生成量を求め、求めた5α-DHTおよび/またはA-diolの生成量から、ステロイド5α-レダクターゼの活性を求め、
(3)前記被検物質のステロイド5α-レダクターゼの活性への影響を求め、被検物質のステロイド5α-レダクターゼに対する相互作用を評価することを含む。
本発明の第4の態様は、測定用キットであり、内容によって、
本発明の第1の態様の5α-DHTおよび/またはA-diolの測定方法、
本発明の第2の態様であるステロイド5α-レダクターゼ活性の測定方法、
本発明の第3の態様であるステロイド5α-レダクターゼに相互作用する物質のスクリーニング方法に利用できるものである。
5α-DHT および/またはA-diolの測定用キットは、(i) NADH溶液、(ii) 3α-HSD溶液、および(iii) チオNAD溶液を含む、5α-ジヒドロテストステロン(5α-DHT)および/または5α-アンドロスタン-3α,17β-ジオール(A-diol)測定用試薬セットからなる。この試薬セットは、(iv) 緩衝液をさらに含むことができる。
ステロイド5α-レダクターゼの活性測定用キットは、 (i)テストステロン溶液、および(ii) NADPH溶液を含む、ステロイド5α-レダクターゼ反応用試薬セット(試薬セットA)、並びに上記5α-DHT および/またはA-diol測定用試薬セット(試薬セットB)を含む。ステロイド5α-レダクターゼ反応用試薬セット(試薬セットA)は、(iii)緩衝液をさらに含むことができる。
<試薬>
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.8)
125 nM 5α-DHTまたは12.5 μMテストステロン
30 mM チオNAD
15 mM NADH
400 U/mL 3α-HSD
1mlのキュベットに0.1 Mトリス塩酸緩衝液(pH 9.8) 650 μlを採り、これに125 nM 5α-DHTまたは12.5 μM テストステロンを200 μl加え(ブランクは0.1 Mトリス塩酸緩衝液を200 μl)、さらに30 mM チオNAD 50 μlおよび15 mM NADH 50 μlを加えて37℃で5分間予備加温した。次いで、400 U/mLの 3α-HSD を50 μl添加して反応を開始させ、400 nmにおける吸光度を経時的に測定した。その結果を図1に示す。5α-DHT(反応液中の最終濃度:25 nM)を試料とした場合、チオNADHの吸光度はほぼ直線的に増加し、400 nmにおけるそのモル吸光係数(ε = 11,900)から計算したチオNADHの生成速度より、5α-DHTのサイクリング率は460サイクル/分と求められた。一方、5α-DHTと同濃度のテストステロンでの吸光度増加はブランク(緩衝液を使用)と差が認められなかったが、その100倍濃度(反応液中の最終濃度:2.5 μM)では図1のような吸光度増加がみられ、そのサイクリングは0.9サイクル/分と見積もられた。
<試薬>
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.8)
25〜400 nM 5α-DHT
100 μMテストステロン
16 mM NADPH
20 mM チオNAD
10 mM NADH
400 U/mL 3α-HSD
1 mlのキュベットに0.1 Mトリス塩酸緩衝液(pH 9.8)を785 μl、25〜400 nM 5α-DHTを50 μl(ブランクは0.1 Mトリス塩酸緩衝液を50 μl)、100 μMテストステロンを10 μl、16 mM NADPHを5 μl、20 mM チオNADを50 μlおよび10 mM NADH を50 μl入れて混合し、37℃で5分間予備加温した。次いで、400 U/mLの3α-HSD を50 μl添加して反応を開始させ、400 nmにおける吸光度を経時的に測定した。5α-DHTの反応液中最終濃度に対して、反応開始後1分から4分までの3分間の吸光度増加(ブランク補正したもの)をプロットした検量線を図2に示す。ステロイド5α-レダクターゼの反応に必要な酵素基質であるテストステロンおよび補酵素であるNADPHが反応液中にそれぞれ1.0 μMおよび80 μM共存しても検量線は良好な直線性を示し、過剰のテストステロン共存下でも数nMレベルの5α-DHTを定量できることが確認された。
<試薬>
0.3 M スクロース(SUC)および1 mMジチオスレイトール(DTT)含有40 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)
ラット肝ミクロソーム(10週齢のWistar ST雄ラットから常法により調製したもの)
100 μMテストステロン
16 mM NADPH
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.8)
20 mM チオNAD
10 mM NADH
400 U/mL 3α-HSD
75 μlの0.3 M SUC/1 mM DTT/40 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)に100 μMテストステロンを10 μl、16 mM NADPHを5 μlおよびラット肝ミクロソーム懸濁液(タンパク質濃度:5.6 μg/ml)を10 μl加え37℃で20分間インキュベートした後、80℃で5分間加熱し、酵素反応を停止した。次いで、この反応液に0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.8)を750 μl、10 mM NADHを50 μlおよび20 mM チオNADを50 μl加え、37℃に恒温化後、400 U/mL 3α-HSDを50 μl添加してチオNADサイクリングを開始させた。ブランクには80℃で5分間加熱して失活させたラット肝ミクロソームを用いた。図3はラット肝ミクロソームによる反応でテストステロンから生成した5α-ジヒドロテストステロンのチオNADサイクリングの結果を示している。ブランクと比較して明らかなチオNADHの吸光度増加が観察され、このチオNADHの生成量と上記の検量線(図2)から求められたラット肝ミクロソームのステロイド5α-レダクターゼ活性は3.9 nmol/min/mg proteinであった。
実施例3と同じ試薬を用い、ラット肝ミクロソームのタンパク質濃度を変化させた実験を実施例3と同様な操作で行った。ただし、チオNADサイクリングは10分間行った。図4は、5α-レダクターゼ反応液(100 μl)中のミクロソームタンパク質量(5.6〜224 ng)に対して、反応開始後1分から6分までの吸光度増加(ブランク補正)をプロットしたものである。ミクロソームタンパク質量の増加に伴ってチオNADHの生成量(すなわち5α-DHTの生成量)は増加し、タンパク質量が5.6〜56 ngの範囲では良好な直線性が成立した。このラット肝ミクロソームのステロイド5α-レダクターゼ活性は3.9 nmol/min/mg proteinであることから、本法ではラット肝ミクロソームのステロイド5α-レダクターゼ活性を約0.2 μU/ml(1 U = 1 μmol/min)まで測定できることになる。
<試薬>
0.3 M スクロース(SUC)および1 mMジチオスレイトール(DTT)含有40 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)
ラット肝ミクロソーム(5.6 μg protein/ml)
100 μMテストステロン
16 mM NADPH
400 nM Finasteride
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.8)
20 mM チオNAD
10 mM NADH
400 U/mL 3α-HSD
65 μlの0.3 M SUC/1 mM DTT/40 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)に100 μMテストステロンを10 μl、16 mM NADPHを5 μl、400 nM Finasterideを10 μl(酵素反応液中最終濃度は40 nM、対照にはFinasterideの替わりに緩衝液を10 μl添加)およびラット肝ミクロソーム懸濁液を10 μl加え37℃で20分間インキュベートした後、80℃で5分間加熱し、酵素反応を停止した。次いで、この反応液に0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.8)を750 μl、10 mM NADHを50 μlおよび20 mM チオNADを50 μl加え、37℃に恒温化後、400 U/mL 3α-HSDを50 μl添加してチオNADサイクリングを開始させた。ブランクには80℃で5分間加熱して失活させたラット肝ミクロソームを用いた。図5にはFinasteride添加の有無によるチオNADHの吸光度増加(ブランク補正)の相違を示している。Finasteride(酵素反応液中濃度:40 nM)の添加によってチオNADH生成量は減少し、その減少量から計算すると、40 nMのFinasterideの共存はラット肝ミクロソームのステロイド5α-レダクターゼ活性を41%に低下させた。
Claims (11)
- ステロイド5α-レダクターゼ活性の測定方法であって、
ステロイド5α-レダクターゼを含有する被検体にテストステロンを加えて、ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応を所定時間行って5α-ジヒドロテストステロン(5α-DHT)および5α-アンドロスタン-3α,17β-ジオール(A-diol)を生成させ、次いで3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α-HSD)を混合し、NADHおよびチオNADの存在下において、3α-HSDの酵素反応を所定時間行った後、生成したチオNADH量を計測し、チオNADH量の計測量から5α-DHTおよび/またはA-diolの生成量を求め、求めた5α-DHTおよび/またはA-diolの生成量から、ステロイド5α-レダクターゼの活性を求めることを含む、前記測定方法。 - 前記NADHおよびチオNADは、前記ステロイド5α-レダクターゼを含有する被検体に前記テストステロンとともに添加するか、または前記ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応後に、前記3α-HSDとともに添加する請求項1に記載の測定方法。
- ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応を行った後、3α-HSDの酵素反応を行う前に、ステロイド5α-レダクターゼを失活させる工程を含む、請求項1または2に記載の測定方法。
- ステロイド5α-レダクターゼに相互作用する物質のスクリーニング方法であって、
ステロイド5α-レダクターゼとテストステロンを含有する系に被検物質を共存させ、ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応を所定時間行って5α-ジヒドロテストステロン(5α-DHT)および5α-アンドロスタン-3α,17β-ジオール(A-diol)を生成させ、次いで3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α-HSD) を混合し、NADHおよびチオNADの存在下において、3α-HSDの酵素反応を所定時間行った後、生成したチオNADH量を計測し、チオNADH量の計測量から5α-DHTおよび/またはA-diolの生成量を求め、求めた5α-DHTおよび/またはA-diolの生成量から、ステロイド5α-レダクターゼの活性を求め、前記被検物質のステロイド5α-レダクターゼの活性への影響を求め、被検物質のステロイド5α-レダクターゼに対する相互作用を評価することを含む、前記スクリーニング方法。 - 前記NADHおよびチオNADは、前記ステロイド5α-レダクターゼを含有する被検体に前記テストステロンとともに添加するか、または前記ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応後に、前記3α-HSDとともに添加する請求項4に記載のスクリーニング方法。
- ステロイド5α-レダクターゼの酵素反応を行った後、3α-HSDの酵素反応を行う前に、ステロイド5α-レダクターゼを失活させる工程を含む、請求項4または5に記載の測定方法。
- 前記相互作用が、ステロイド5α-レダクターゼの活性を向上させるものである、請求項4〜6のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 前記相互作用が、ステロイド5α-レダクターゼの活性を低減させるものである、請求項4〜6のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- (i)テストステロン溶液、および(ii)NADPH溶液を含む、ステロイド5α-レダクターゼ反応用試薬セット(試薬セットA)、並びに
(i)NADH溶液、(ii)3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α-HSD)溶液、および(iii)チオNAD溶液を含む、5α-ジヒドロテストステロン(5α-DHT)および/または5α-アンドロスタン-3α,17β-ジオール(A-diol)測定用試薬セットからなる、5α-DHT および/またはA-diol測定用試薬セット(試薬セットB)を含む、請求項1〜8のいずれかに記載の方法に用いるためのステロイド5α-レダクターゼの活性測定用キット。 - ステロイド5α-レダクターゼ反応用試薬セット(試薬セットA)が、(iii)緩衝液をさらに含む、請求項9に記載の測定用キット。
- 5α-DHTおよび/またはA-diol測定用試薬セット(試薬セットB)が、(iv)緩衝液をさらに含む、請求項9または10に記載の測定用キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008052662A JP4904298B2 (ja) | 2008-03-03 | 2008-03-03 | ステロイド5α−レダクターゼ活性の測定方法およびそれに用いるキット |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008052662A JP4904298B2 (ja) | 2008-03-03 | 2008-03-03 | ステロイド5α−レダクターゼ活性の測定方法およびそれに用いるキット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009207396A JP2009207396A (ja) | 2009-09-17 |
JP4904298B2 true JP4904298B2 (ja) | 2012-03-28 |
Family
ID=41181171
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008052662A Active JP4904298B2 (ja) | 2008-03-03 | 2008-03-03 | ステロイド5α−レダクターゼ活性の測定方法およびそれに用いるキット |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4904298B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3296405B1 (en) * | 2011-03-23 | 2019-10-09 | Etsuro Ito | Method and kit for super-high-sensitivity measurement of protein and nucleic acid, and novel enzyme substrate |
CN110628735B (zh) * | 2019-04-23 | 2022-04-08 | 天津科技大学 | 一种5α-还原酶突变体,基因工程菌及其在高效催化5α-AD生产中的应用 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4694068B2 (ja) * | 2001-09-28 | 2011-06-01 | 日本メナード化粧品株式会社 | テストステロン−5α−レダクターゼ阻害剤 |
JP2005126366A (ja) * | 2003-10-23 | 2005-05-19 | Nippon Menaade Keshohin Kk | テストステロン−5α−レダクターゼ阻害剤 |
JP2005145902A (ja) * | 2003-11-17 | 2005-06-09 | Nippon Menaade Keshohin Kk | テストステロン−5α−レダクターゼ阻害剤 |
JP4628840B2 (ja) * | 2005-03-29 | 2011-02-09 | 日本メナード化粧品株式会社 | テストステロン−5α−レダクターゼ阻害剤 |
JP5085018B2 (ja) * | 2005-07-01 | 2012-11-28 | 日本メナード化粧品株式会社 | 育毛剤 |
-
2008
- 2008-03-03 JP JP2008052662A patent/JP4904298B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2009207396A (ja) | 2009-09-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Acker et al. | Considerations for the design and reporting of enzyme assays in high-throughput screening applications | |
Testino Jr et al. | High-throughput inhibition screening of major human cytochrome P450 enzymes using an in vitro cocktail and liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
Lu et al. | Mechanism-based inhibition of human liver microsomal cytochrome P450 1A2 by zileuton, a 5-lipoxygenase inhibitor | |
Shen et al. | A mass spectrometry plate reader: Monitoring enzyme activity and inhibition with a desorption/ionization on silicon (DIOS) platform | |
EP1135521B1 (en) | Method for measuring enzyme activity by using a side reaction of said enzyme | |
Iwai et al. | Spectrophotometric method for the assay of steroid 5α-reductase activity of rat liver and prostate microsomes | |
Spaggiari et al. | Phenotyping of CYP450 in human liver microsomes using the cocktail approach | |
Zhang et al. | Rapid and quantitative determination of metabolites from multiple cytochrome P450 probe substrates by gradient liquid chromatography–electrospray ionization-ion trap mass spectrometry | |
Zambon et al. | Evaluation of cytochrome P450 inhibition assays using human liver microsomes by a cassette analysis/LC-MS/MS | |
Stevenson et al. | Pseudomonas aeruginosa arylsulfatase: a purified enzyme for the mild hydrolysis of steroid sulfates | |
Steckelbroeck et al. | Characterization of 17β‐hydroxysteroid dehydrogenase activity in brain tissue: testosterone formation in the human temporal lobe | |
Kulathunga et al. | Desorption electrospray ionization mass spectrometry assay for label‐free characterization of SULT2B1b enzyme kinetics | |
Lutz et al. | Quantification of cortisol and 6 beta-hydroxycortisol in human urine by LC-MS/MS, and gender-specific evaluation of the metabolic ratio as biomarker of CYP3A activity | |
JP4904298B2 (ja) | ステロイド5α−レダクターゼ活性の測定方法およびそれに用いるキット | |
Amaral et al. | Development of a new gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS) methodology for the evaluation of 5α-reductase activity | |
WO2019098179A1 (ja) | 安定同位体標識化合物 | |
Long et al. | Comparison of two methods for assaying complex I activity in mitochondria isolated from rat liver, brain and heart | |
Adomat et al. | Validation of a sequential extraction and liquid chromatography–tandem mass spectrometric method for determination of dihydrotestosterone, androstanediol and androstanediol–glucuronide in prostate tissues | |
Detlefsen et al. | Characterization of the major single nucleotide polymorphic variants of aldo-keto reductase 1C3 (type 5 17β-hydroxysteroid dehydrogenase) | |
US20120142038A1 (en) | Kits for assaying enzyme-mediated oxidative demethylation | |
Coirini et al. | Characterization and regulation of the 3β‐hydroxysteroid dehydrogenase isomerase enzyme in the rat sciatic nerve | |
Hajas et al. | Biochemical identification of a hydroperoxide derivative of the free 8-oxo-7, 8-dihydroguanine base | |
Kuzikov et al. | Assessment of electrocatalytic hydroxylase activity of cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) by means of derivatization of 6β-hydroxycortisol by sulfuric acid for fluorimetric assay | |
Catucci et al. | Identification of human flavin-containing monooxygenase 3 substrates by a colorimetric screening assay | |
WO2007011778A2 (en) | Use of raman spectroscopy in enzyme activity assays |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110207 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20110705 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20110803 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110816 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111017 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111108 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111121 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111213 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120106 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4904298 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150113 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313114 |
|
R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313114 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
S201 | Request for registration of exclusive licence |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R314201 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S211 | Written request for registration of transfer of exclusive licence |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R314211 |
|
S804 | Written request for registration of cancellation of exclusive licence |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R314803 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |