CN114875003A - 一种短链脱氢酶的突变体、编码基因及编码基因获得方法、突变体的应用 - Google Patents

一种短链脱氢酶的突变体、编码基因及编码基因获得方法、突变体的应用 Download PDF

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    • C12Y101/01184—Carbonyl reductase (NADPH) (1.1.1.184)

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种短链脱氢酶的突变体，所述突变体为突变体L104A、突变体A150Y、突变体Y155A、突变体I158A、突变体I202A或者突变体T205A；所述短链脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的短链脱氢酶突变体相对野生型短链脱氢酶有更高的酶活性，可以泼尼松或者配合水解酶以醋酸泼尼松为底物制备泼尼松龙，底物的转化率高，产物的收率高，无副产物产生，而且反应可在更高的底物浓度水平下进行，适宜规模化生产。

Description

一种短链脱氢酶的突变体、编码基因及编码基因获得方法、突 变体的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种短链脱氢酶的突变体、编码基因及编码基因获得方法、突变体的应用
背景技术
泼尼松龙为肾上腺皮质激素类药物，主要用于治疗各种急性严重细菌感染、严重过敏性疾病，胶原性疾病，风湿、类风湿性关节炎，严重支气管哮喘等，而且泼尼松龙作为重要的甾体化合物，还可作为地索奈德、布地奈德等奈德类药物前体，市场潜力巨大。
目前泼尼松龙的制备主要有化学法和生物发酵法两种。化学法主要是以甾体母核或氢化可的松为原料经过多步的化学合成步骤得到泼尼松龙，如中国专利文献CN101397324A、CΝ101397324A、CΝ1361108A等采用化学方法合成泼尼松龙，但是化学方法普遍存在工艺路线长、工艺流程复杂，生产周期比较长，总收率较低以及对环境不友好等缺点，使得泼尼松龙的生产成本居高不下。
生物发酵法相对化学合成法具有更佳的环境友好性，如中国专利文献CN102206696A和CN101760495A中公开了微生物发酵和细胞转化制备泼尼松龙。但是生物发酵方法通常涉及菌种选择、发酵、转化和提纯等多个步骤，存在着底物浓度低、转化时间久(一般大于60小时)、转化率和收率都比较低、分离纯化比较困难等缺点。而专利号CN107058444 A的生物酶法虽避免了上述问题，但采用氢化可的松为原料，存在原料成本过高等缺点。因此开发更具有生产可行性的生物法是泼尼松龙制备技术发展的重要方向。
发明内容
针对现有生物法制备泼尼松龙的底物浓度低、转化率低等问题，本发明的目的在于提供一种短链脱氢酶的突变体，可以醋酸泼尼松或泼尼松为底物转化制备泼尼松龙，底物浓度可以处于更高的水平，而且底物转化率高、产物收率高。
本发明提供如下的技术方案：
一种短链脱氢酶的突变体，
所述突变体为短链脱氢酶的第104位的亮氨酸突变为丙氨酸的突变体L104A，
或者第150位的丙氨酸突变为酪氨酸的突变体A150Y，
或者第155位的酪氨酸突变为丙氨酸的突变体Y155A，
或者第158位的异亮氨酸突变为丙氨酸的突变体I158A，
或者第202位的异亮氨酸突变为丙氨酸的突变体I202A，
或者第205位的苏氨酸突变为丙氨酸的突变体T205A；
所述短链脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
发明人团队在研究中发现，氨基酸序列为SEQ ID NO.1的短链脱氢酶在特定的位置上发生突变得到的突变体，可以泼尼松或配合水解酶以醋酸泼尼松为底物制备泼尼松龙，相对该野生型短链脱氢酶具有更高的酶活性，底物转化率和产物收率都提到提升，没有其它副产物生成，而且底物浓度相对现有的生物发酵法可处于更高的水平，更适宜规模化生产，其中野生型短链脱氢酶的突变主要是L104A、A150Y、Y155A、I158A、I202A、T205A，优选I158A、I202A，更优选I158A，其对醋酸泼尼松的转化率可以达到98％以上，是野生型的短链脱氢酶的1.57倍，产物泼尼松龙的产率可以达到98％以上。
其中，短链脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MNEKFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREIAYHLAKMGAHVVVTARSKEALQKVVARCLELGAASAHYIAGSMEDMTFAEELVAEAGNLMGGLDMLILNHVLYNRLSFFHGEIDNVRKSMEVNFHSFVVLSVAAMPMLMQSQGSIAVVSSVAGKITYPLIAPYSASKFALDGFFSTLRSEFLVNKVNVSITLCILGLIDTETAIKATSGIYLGPASPKEECALEIIKGTALRQDEMYYVGSRWVPYLLGNPGRKIMEFLSATEYNWDNVLSNEKLY*。
各突变体的氨基酸序列如下：
突变体L104A氨酸序列SEQ ID NO.2：
MNEKFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREIAYHLAKMGAHVVVTARSKEALQKVVARCLELGAASAHYIAGSMEDMTFAEELVAEAGNLMGGLDMLILNHVLYNRASFFHGEIDNVRKSMEVNFHSFVVLSVAAMPMLMQSQGSIAVVSSVAGKITYPLIAPYSASKFALDGFFSTLRSEFLVNKVNVSITLCILGLIDTETAIKATSGIYLGPASPKEECALEIIKGTALRQDEMYYVGSRWVPYLLGNPGRKIMEFLSATEYNWDNVLSNEKLY*；
突变体A150Y氨酸序列SEQ ID NO.3：
MNEKFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREIAYHLAKMGAHVVVTARSKEALQKVVARCLELGAASAHYIAGSMEDMTFAEELVAEAGNLMGGLDMLILNHVLYNRLSFFHGEIDNVRKSMEVNFHSFVVLSVAAMPMLMQSQGSIAVVSSVYGKITYPLIAPYSASKFALDGFFSTLRSEFLVNKVNVSITLCILGLIDTETAYKATSGIYLGPASPKEECALEIIKGTALRQDEMYYVGSRWVPYLLGNPGRKIMEFLSATEYNWDNVLSNEKLY*；
突变体Y155A氨酸序列SEQ ID NO.4：
MNEKFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREIAYHLAKMGAHVVVTARSKEALQKVVARCLELGAASAHYIAGSMEDMTFAEELVAEAGNLMGGLDMLILNHVLYNRLSFFHGEIDNVRKSMEVNFHSFVVLSVAAMPMLMQSQGSIAVVSSVAGKITAPLIAPYSASKFALDGFFSTLRSEFLVNKVNVSITLCILGLIDTETAAKATSGIYLGPASPKEECALEIIKGTALRQDEMYYVGSRWVPYLLGNPGRKIMEFLSATEYNWDNVLSNEKLY*；
突变体I158A氨酸序列SEQ ID NO.5：
MNEKFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREIAYHLAKMGAHVVVTARSKEALQKVVARCLELGAASAHYIAGSMEDMTFAEELVAEAGNLMGGLDMLILNHVLYNRLSFFHGEIDNVRKSMEVNFHSFVVLSVAAMPMLMQSQGSIAVVSSVAGKITYPLAAPYSASKFALDGFFSTLRSEFLVNKVNVSITLCILGLIDTETAIKATSGIYLGPASPKEECALEIIKGTALRQDEMYYVGSRWVPYLLGNPGRKIMEFLSATEYNWDNVLSNEKLY*；
突变体I202A氨酸序列SEQ ID NO.6：
MNEKFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREIAYHLAKMGAHVVVTARSKEALQKVVARCLELGAASAHYIAGSMEDMTFAEELVAEAGNLMGGLDMLILNHVLYNRLSFFHGEIDNVRKSMEVNFHSFVVLSVAAMPMLMQSQGSIAVVSSVAGKITYPLIAPYSASKFALDGFFSTLRSEFLVNKVNVSITLCILGLIDTETAAKATSGIYLGPASPKEECALEIIKGTALRQDEMYYVGSRWVPYLLGNPGRKIMEFLSATEYNWDNVLSNEKLY*；
突变体T205A氨酸序列SEQ ID NO.7：
MNEKFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREIAYHLAKMGAHVVVTARSKEALQKVVARCLELGAASAHYIAGSMEDMTFAEELVAEAGNLMGGLDMLILNHVLYNRLSFFHGEIDNVRKSMEVNFHSFVVLSVAAMPMLMQSQGSIAVVSSVAGKITYPLIAPYSASKFALDGFFSTLRSEFLVNKVNVSITLCILGLIDTETAIKAASGIYLGPASPKEECALEIIKGTALRQDEMYYVGSRWVPYLLGNPGRKIMEFLSATEYNWDNVLSNEKLY*。
本发明提供编码上述突变体的编码基因，其中，
所述突变体L104A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9：
atgaatgaaaaatttcgtccggaaatgttacagggtaaaaaagtgattgtgaccggcgcatctaaaggcattggtcgcgaaattgcatatcatctggccaaaatgggcgcccatgtggttgtgaccgcacgctctaaagaagccttacagaaagtggtggcacgttgtttagaactgggtgccgccagtgcccattatattgcaggctctatggaagatatgacctttgcagaagaactggtggccgaagcaggcaatctgatgggcggtttagatatgctgattctgaatcatgtgctgtataatcgcgcgtccttttttcatggcgaaattgataatgttcgcaaatcaatggaagttaattttcatagctttgttgtgctgtcagttgcagccatgccgatgctgatgcagtctcagggctctattgccgtggtgagtagcgtggccggtaaaattacctatccgctgattgccccgtatagcgcaagcaaatttgccttagatggcttttttagtaccctgcgtagtgaatttctggttaataaagttaatgtgtctattaccctgtgtattctgggcctgattgataccgaaaccgccattaaagccaccagcggcatttatttaggtccggcctctccgaaagaagaatgtgcactggaaattattaaaggcaccgcactgcgtcaggatgaaatgtattatgttggctctcgttgggttccgtatctgttaggtaatccgggtcgtaaaattatggaatttctgtcagcaaccgaatataattgggataatgttctgagcaatgaaaaactgtat；
所述突变体A150Y的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10：
atgaatgaaaaatttcgtccggaaatgttacagggtaaaaaagtgattgtgaccggcgcatctaaaggcattggtcgcgaaattgcatatcatctggccaaaatgggcgcccatgtggttgtgaccgcacgctctaaagaagccttacagaaagtggtggcacgttgtttagaactgggtgccgccagtgcccattatattgcaggctctatggaagatatgacctttgcagaagaactggtggccgaagcaggcaatctgatgggcggtttagatatgctgattctgaatcatgtgctgtataatcgcttatccttttttcatggcgaaattgataatgttcgcaaatcaatggaagttaattttcatagctttgttgtgctgtcagttgcagccatgccgatgctgatgcagtctcagggctctattgccgtggtgagtagcgtgtatggtaaaattacctatccgctgattgccccgtatagcgcaagcaaatttgccttagatggcttttttagtaccctgcgtagtgaatttctggttaataaagttaatgtgtctattaccctgtgtattctgggcctgattgataccgaaaccgccattaaagccaccagcggcatttatttaggtccggcctctccgaaagaagaatgtgcactggaaattattaaaggcaccgcactgcgtcaggatgaaatgtattatgttggctctcgttgggttccgtatctgttaggtaatccgggtcgtaaaattatggaatttctgtcagcaaccgaatataattgggataatgttctgagcaatgaaaaactgtat；
所述突变体Y155A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11：
atgaatgaaaaatttcgtccggaaatgttacagggtaaaaaagtgattgtgaccggcgcatctaaaggcattggtcgcgaaattgcatatcatctggccaaaatgggcgcccatgtggttgtgaccgcacgctctaaagaagccttacagaaagtggtggcacgttgtttagaactgggtgccgccagtgcccattatattgcaggctctatggaagatatgacctttgcagaagaactggtggccgaagcaggcaatctgatgggcggtttagatatgctgattctgaatcatgtgctgtataatcgcttatccttttttcatggcgaaattgataatgttcgcaaatcaatggaagttaattttcatagctttgttgtgctgtcagttgcagccatgccgatgctgatgcagtctcagggctctattgccgtggtgagtagcgtggccggtaaaattaccgcgccgctgattgccccgtatagcgcaagcaaatttgccttagatggcttttttagtaccctgcgtagtgaatttctggttaataaagttaatgtgtctattaccctgtgtattctgggcctgattgataccgaaaccgccattaaagccaccagcggcatttatttaggtccggcctctccgaaagaagaatgtgcactggaaattattaaaggcaccgcactgcgtcaggatgaaatgtattatgttggctctcgttgggttccgtatctgttaggtaatccgggtcgtaaaattatggaatttctgtcagcaaccgaatataattgggataatgttctgagcaatgaaaaactgtat；
所述突变体I158A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12：
atgaatgaaaaatttcgtccggaaatgttacagggtaaaaaagtgattgtgaccggcgcatctaaaggcattggtcgcgaaattgcatatcatctggccaaaatgggcgcccatgtggttgtgaccgcacgctctaaagaagccttacagaaagtggtggcacgttgtttagaactgggtgccgccagtgcccattatattgcaggctctatggaagatatgacctttgcagaagaactggtggccgaagcaggcaatctgatgggcggtttagatatgctgattctgaatcatgtgctgtataatcgcttatccttttttcatggcgaaattgataatgttcgcaaatcaatggaagttaattttcatagctttgttgtgctgtcagttgcagccatgccgatgctgatgcagtctcagggctctattgccgtggtgagtagcgtggccggtaaaattacctatccgctggcggccccgtatagcgcaagcaaatttgccttagatggcttttttagtaccctgcgtagtgaatttctggttaataaagttaatgtgtctattaccctgtgtattctgggcctgattgataccgaaaccgccattaaagccaccagcggcatttatttaggtccggcctctccgaaagaagaatgtgcactggaaattattaaaggcaccgcactgcgtcaggatgaaatgtattatgttggctctcgttgggttccgtatctgttaggtaatccgggtcgtaaaattatggaatttctgtcagcaaccgaatataattgggataatgttctgagcaatgaaaaactgtat；
所述突变体I202A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13：
atgaatgaaaaatttcgtccggaaatgttacagggtaaaaaagtgattgtgaccggcgcatctaaaggcattggtcgcgaaattgcatatcatctggccaaaatgggcgcccatgtggttgtgaccgcacgctctaaagaagccttacagaaagtggtggcacgttgtttagaactgggtgccgccagtgcccattatattgcaggctctatggaagatatgacctttgcagaagaactggtggccgaagcaggcaatctgatgggcggtttagatatgctgattctgaatcatgtgctgtataatcgcttatccttttttcatggcgaaattgataatgttcgcaaatcaatggaagttaattttcatagctttgttgtgctgtcagttgcagccatgccgatgctgatgcagtctcagggctctattgccgtggtgagtagcgtggccggtaaaattacctatccgctgattgccccgtatagcgcaagcaaatttgccttagatggcttttttagtaccctgcgtagtgaatttctggttaataaagttaatgtgtctattaccctgtgtattctgggcctgattgataccgaaaccgccgcgaaagccaccagcggcatttatttaggtccggcctctccgaaagaagaatgtgcactggaaattattaaaggcaccgcactgcgtcaggatgaaatgtattatgttggctctcgttgggttccgtatctgttaggtaatccgggtcgtaaaattatggaatttctgtcagcaaccgaatataattgggataatgttctgagcaatgaaaaactgtat；
所述突变体T205A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14：
atgaatgaaaaatttcgtccggaaatgttacagggtaaaaaagtgattgtgaccggcgcatctaaaggcattggtcgcgaaattgcatatcatctggccaaaatgggcgcccatgtggttgtgaccgcacgctctaaagaagccttacagaaagtggtggcacgttgtttagaactgggtgccgccagtgcccattatattgcaggctctatggaagatatgacctttgcagaagaactggtggccgaagcaggcaatctgatgggcggtttagatatgctgattctgaatcatgtgctgtataatcgcttatccttttttcatggcgaaattgataatgttcgcaaatcaatggaagttaattttcatagctttgttgtgctgtcagttgcagccatgccgatgctgatgcagtctcagggctctattgccgtggtgagtagcgtggccggtaaaattacctatccgctggcggccccgtatagcgcaagcaaatttgccttagatggcttttttagtaccctgcgtagtgaatttctggttaataaagttaatgtgtctattaccctgtgtattctgggcctgattgataccgaaaccgccattaaagccgcgagcggcatttatttaggtccggcctctccgaaagaagaatgtgcactggaaattattaaaggcaccgcactgcgtcaggatgaaatgtattatgttggctctcgttgggttccgtatctgttaggtaatccgggtcgtaaaattatggaatttctgtcagcaaccgaatataattgggataatgttctgagcaatgaaaaactgtat。
本发明提供获得上述编码基因的方法，所述突变体的编码基因由短链脱氢酶的编码基因经特异性引物对扩增得到，其中：
突变体L104A的编码基因对应的特异性引物对为L104A_F/R，核苷酸序列L104A-F(SEQ ID NO.15)、L104A-R(SEQ ID NO.16)如下：
L104A-F tgctgtataatcgcgcgtccttttttcatggcgaaat；
L104A-R aaaaggacgcgcgattatacagcacatgattcagaatcagc；
突变体A150Y的编码基因对应的特异性引物对为A150Y_F/R，核苷酸序列A150Y-F(SEQ ID NO.17)、A150Y-R(SEQ ID NO.18)如下：
A150Y-F gtagcgtgtatggtaaaattacctatccgctgattg；
A150Y-R attttaccatacacgctactcaccacggcaata；
突变体Y155A的编码基因对应的特异性引物对为Y155A_F/R，核苷酸序列Y155A-F(SEQ ID NO.19)、Y155A-R(SEQ ID NO.20)如下：
Y155A-F tatccgctggcggccccgtatagcgcaa；
Y155A-R tacggggccgccagcggataggtaattttaccg；
突变体I158A的编码基因对应的特异性引物对为I158A_F/R，核苷酸序列I158A-F(SEQ ID NO.21)、I158A-R(SEQ ID NO.22)如下：
I158A-F cattaaagccgcgagcggcatttatttaggtc；
I158A-R aatgccgctcgcggctttaatggcggttt；
突变体I202A的编码基因的对应的特异性引物对为I202A_F/R，核苷酸序列I202A-F(SEQ ID NO.23)、I202A-R(SEQ ID NO.24)如下：
I202A-F aaaccgccgcgaaagccaccagcggcatttattta；
I202A-R ggtggctttcgcggcggtttcggtatcaatca；
突变体T205A的编码基因的对应的特异性引物对为T205A_F/R，核苷酸序列T205Y-F(SEQ ID NO.25)、T205Y-R(SEQ ID NO.26)如下：
T205Y-F cattaaagcctatagcggcatttatttaggtccgg；
T205Y-R aaatgccgctataggctttaatggcggttt；
短链脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：
atgaatgaaaaatttcgtccggaaatgttacagggtaaaaaagtgattgtgaccggcgcatctaaaggcattggtcgcgaaattgcatatcatctggccaaaatgggcgcccatgtggttgtgaccgcacgctctaaagaagccttacagaaagtggtggcacgttgtttagaactgggtgccgccagtgcccattatattgcaggctctatggaagatatgacctttgcagaagaactggtggccgaagcaggcaatctgatgggcggtttagatatgctgattctgaatcatgtgctgtataatcgcttatccttttttcatggcgaaattgataatgttcgcaaatcaatggaagttaattttcatagctttgttgtgctgtcagttgcagccatgccgatgctgatgcagtctcagggctctattgccgtggtgagtagcgtggccggtaaaattacctatccgctgattgccccgtatagcgcaagcaaatttgccttagatggcttttttagtaccctgcgtagtgaatttctggttaataaagttaatgtgtctattaccctgtgtattctgggcctgattgataccgaaaccgccattaaagccaccagcggcatttatttaggtccggcctctccgaaagaagaatgtgcactggaaattattaaaggcaccgcactgcgtcaggatgaaatgtattatgttggctctcgttgggttccgtatctgttaggtaatccgggtcgtaaaattatggaatttctgtcagcaaccgaatataattgggataatgttctgagcaatgaaaaactgtat。
一种含有上述编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为含有突变体编码基因的质粒、噬菌体或病毒载体。
作为本发明的优选，所述重组表达载体为含有突变体编码基因的质粒pET-28a。
一种表达上述的突变体的工程菌，工程菌通过将上述重组表达载体转化至宿主细菌中获得。
一种泼尼松龙的制备方法，包括以醋酸泼尼松为底物，加入上述的突变体、水解酶、葡糖脱氢酶、葡萄糖和含有机溶剂的pH缓冲溶液反应；
或者，包括以泼尼松为底物，加入上述的突变体、葡糖脱氢酶、葡萄糖和含有机溶剂的pH缓冲溶液反应。
本发明提供的突变体可直接以泼尼松为底物催化转化得到泼尼松龙，或者可在水解酶的配合下，以醋酸泼尼松为底物，催化转化得到泼尼松龙，制备方法具有操作简单、成本低廉等优点，大大降低了生产成本，具有广阔的应用前景，其中所用水解酶选自现有技术中可水解醋酸泼尼松的水解酶。
作为本发明方法的优选，所述突变体以如上述工程菌发酵培养后的湿菌体形式加入，或者以所得湿菌体破碎后的粗酶液的形式加入；
以湿菌体形式表示，突变体的加入量为150～250g/L湿菌体。
作为本发明方法的优选，所述有机溶剂为异丙醇或N,N-二甲基甲酰胺；有机溶剂在pH缓冲溶液中的体积分数为8～12％。
作为本发明方法的优选，
底物的添加浓度为20～80g/L，更优选为60g/L；
葡萄糖脱氢酶的加入浓度为150～250g/L，更优选为200g/L；
葡萄糖的加入浓度为20～40g/L，更优选为30g/L；
水解酶的添加浓度为150～250g/L，更优选为200g/L；
所用pH缓冲溶液为磷酸钾缓冲液，即K2HPO4-KH2PO4缓冲液，其缓冲pH值优选不大于7.0，优选为6.0～7.0，进一步优选为6.2～6.8，更优选为6.5；
反应温度为30～48℃，优选为37℃；
反应时间为16～30h，优选为24h；
振荡速率为150～300rpm，优选为220rpm。
上述各原料的添加浓度，如湿菌体、底物、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖、水解酶均以1L磷酸钾缓冲液计算。
本发明的有益效果如下：
1、本发明的短链脱氢酶突变体相对野生型短链脱氢酶有更高的酶活性，可以泼尼松或者配合水解酶以醋酸泼尼松为底物制备泼尼松龙，底物的转化率高，产物的收率高，无副产物产生，而且反应可在更高的底物浓度水平(20～80g/L)下进行，适宜规模化生产；
2、本发明的发明方法具有操作简单、成本低廉等优点，大大降低了生产成本，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是泼尼松龙的标准品的液相色谱图。
图2是实施例3反应结束后的物料体系的液相色谱图。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
实施例1构建可表达各突变体的工程菌
根据野生型的短链脱氢酶的氨基酸序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)基因合成其编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，然后以质粒pET28a为载体，通过常规制备操作获得包含该编码基因的重组质粒pET28a，将该重组质粒转入大肠杆菌BL21中获得野生型短链脱氢酶的工程重组菌株，将该重组菌株在含1‰Kan抗性的LB平板上活化，37℃培养18h，挑取单菌落于同样含1‰Kan抗性的50mL LB锥形瓶中，37℃、220rpm培养至OD600为0.6左右，按照质粒小提试剂盒说明书提取质粒。然后以提取的质粒作为模板，使用点突变试剂盒完成突变质粒的构建，包括PCR、DpnⅠ消化模板。其中各突变体的引物对如表1所示，PCR扩增体系如表2所示，PCR扩增条件如表3所示。
表1获得各突变体编码基因的引物对
Figure BDA0003582958960000081
表2 PCR体系
组分 体积(μL)
ddH<sub>2</sub>O 11.7
5×KODⅠ 15
模板 1.5
F-引物 0.6
R-引物 0.6
总体积 29.4
表3 PCR条件
Figure BDA0003582958960000082
Figure BDA0003582958960000091
Dpn I消化模板反应体系及反应过程如下：PCR反应液中加入1μL Dpn I，在37℃下反应1h。
将上述构建好的突变质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞，混匀后置于冰上30min，结束后将大肠杆菌BL21感受态放入温度42℃下热激90s后置于冰上缓和5min，再加入1mL未添加抗性的LB培养基，于37℃下培养1h，结束后取菌体200μL涂布于含1‰Kan的LB平板上，于37℃恒温培养箱培养直至长出单菌落。
待长出单菌落后挑取单菌落于含同样抗性的LB试管中37℃、220rpm培养过夜，后于超净台无菌操作条件下吸取200μL 菌液用于测序，若测序成功将剩余菌液于菌保管添加等体积甘油溶液(40％甘油)，后置于-80℃冰箱中保存备用。
实施例2各突变体的诱导表达
将实施例1构建的表达野生酶的工程菌和表达各突变体的工程菌分别接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，制备菌保管保藏，再以1％接种量(v/v)接种到含50μg/mL卡那霉素的50mL LB培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，25℃诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心10min收集湿菌体，分别得到表达野生酶的工程菌、表达各突变体的工程菌的湿菌体，于-80℃贮存备用。
实施例3(突变体I158A制备泼尼松龙醋酸泼尼松浓度60g/L)
将0.06g醋酸泼尼松，200mg水解酶(购自蔚蓝生物)，200mgGDH，0.03g葡萄糖，200mg突变体I158A的湿菌体(来自实施例2)混合，加入1mL含10％(v/v)的N,N-二甲基甲酰胺的K2HPO4-KH2PO4缓冲液(100mM，pH 6.5)中，置于37℃，220rpm恒温摇床条件下反应24h。反应结束后，用N,N-二甲基甲酰胺萃取并离心，加入2倍N,N-二甲基甲酰胺体积水，60℃真空旋蒸3h，随后乙腈过滤，高效液相色谱(HPLC)分析确定其转化率和产率，泼尼松龙标准品的液相色谱图如图1所示，本实施反应后的物料体系的液相色谱图如图2所示，最终测得底物转化率98.54％，ee值达99％以上，产率为98.07％。
实施例4(突变体I202A制备泼尼松龙醋酸泼尼松浓度60g/L)
将0.06g醋酸泼尼松，200mg水解酶(购自蔚蓝生物)，200mgGDH，0.03g葡萄糖，200mg突变体I202A的湿菌体(实施例2)，加入1mL含10％异丙醇的K2HPO4-KH2PO4缓冲液(100mM，pH 6.5)中，置于37℃，220rpm恒温摇床条件下反应24h。反应结束后，用N,N-二甲基甲酰胺萃取并离心，加入2倍N,N-二甲基甲酰胺体积水，60℃真空旋蒸3h，随后乙腈过滤，高效液相色谱(HPLC)分析确定其转化率和产率，最终测得底物转化率为82.38％，ee值达99％以上，产率为81.97％。
实施例5(突变体Y155A制备泼尼松龙醋酸泼尼松浓度60g/L)
将0.06g醋酸泼尼松，200mg水解酶(购自蔚蓝生物)，200mgGDH，0.03g葡萄糖，200mg突变体Y155A的湿菌体，加入1mL含10％异丙醇的K2HPO4-KH2PO4缓冲液(100mM，pH6.5)中，置于37℃，220rpm的恒温摇床条件下反应24h。反应结束后，用N,N-二甲基甲酰胺萃取并离心，加入2倍N,N-二甲基甲酰胺体积水，60℃真空旋蒸3h，随后乙腈过滤，高效液相色谱(HPLC)分析确定其转化率和产率，最终所得底物转化率为67.06％，ee值达99％以上，产率为66.66％。
实施例6(突变体A150Y制备泼尼松龙醋酸泼尼松浓度60g/L)
将0.06g醋酸泼尼松，200mg水解酶C(购自蔚蓝生物)，200mgGDH，0.03g葡萄糖，200mg突变体A150Y的湿菌体，加入1mL含10％异丙醇的K2HPO4-KH2PO4缓冲液(100mM，pH6.5)中，置于37℃，220rpm的恒温摇床条件下反应24h。反应结束后，用N,N-二甲基甲酰胺萃取并离心，加入2倍N,N-二甲基甲酰胺体积水，60℃真空旋蒸3h，随后乙腈过滤，高效液相色谱(HPLC)分析确定其转化率和产率，最终所得底物转化率为71.03％，ee值达99％以上，产率为70.74％。
实施例7(突变体T205A制备泼尼松龙醋酸泼尼松浓度60g/L)
将0.06g醋酸泼尼松，200mg水解酶(购自蔚蓝生物)，200mgGDH，0.03g葡萄糖，200mg突变体T205A的湿菌体，加入1mL含10％异丙醇的K2HPO4-KH2PO4缓冲液(100mM，pH6.5)中，置于37℃，220rpm的恒温摇床条件下反应24h。反应结束后，用N,N-二甲基甲酰胺萃取并离心，加入2倍N,N-二甲基甲酰胺体积水，60℃真空旋蒸3h，随后乙腈过滤，高效液相色谱(HPLC)分析确定其转化率和产率，最终所得底物转化率为64.03％，ee值达99％以上，产率为63.27％。
实施例8(突变体Y104A制备泼尼松龙醋酸泼尼松浓度60g/L)
将0.08g醋酸泼尼松，200mg水解酶(购自蔚蓝生物)，200mgGDH，0.03g葡萄糖，200mg突变体Y104A的湿菌体(来自实施例2)混合，加入1mL含10％N,N-二甲基甲酰胺的K2HPO4-KH2PO4缓冲液(100mM，pH 6.5)中，置于37℃，220rpm的恒温摇床条件下反应24h。反应结束后，用N,N-二甲基甲酰胺萃取并离心，加入2倍N,N-二甲基甲酰胺体积水，60℃真空旋蒸3h，随后乙腈过滤，高效液相色谱(HPLC)分析确定其转化率和产率。所得转化率达64.45％，ee值达99％以上，产率为63.68％。
实施例9(突变体I158A制备泼尼松龙醋酸泼尼松浓度80g/L)
将0.08g醋酸泼尼松，200mg水解酶(购自蔚蓝生物)，200mgGDH，0.03g葡萄糖，200mg突变体I158A的湿菌体(来自实施例2)混合，加入1mL含10％N,N-二甲基甲酰胺的K2HPO4-KH2PO4缓冲液(100mM，pH 6.5)中，置于37℃，220rpm的恒温摇床条件下反应24h。反应结束后，用N,N-二甲基甲酰胺萃取并离心，加入2倍N,N-二甲基甲酰胺体积水，60℃真空旋蒸3h，随后乙腈过滤，高效液相色谱(HPLC)分析确定其转化率和产率。所得转化率达80.05％，ee值达99％以上，产率为79.22％。
对比例(野生型短链脱氢酶制备泼尼松龙醋酸泼尼松浓度60g/L)
将0.06g醋酸泼尼松，200mg水解酶(购自蔚蓝生物)，200mg GDH，0.03g葡萄糖，200mg野生型短链脱氢酶的湿菌体(来自实施例2)，加入1mL含10v/v％N,N-二甲基甲酰胺的K2HPO4-KH2PO4缓冲液(100mM，pH 6.5)中，置于37℃，220rpm的恒温摇床条件下反应24h。反应结束后，用N,N-二甲基甲酰胺萃取并离心，加入2倍N,N-二甲基甲酰胺体积水，60℃真空旋蒸3h，随后乙腈过滤，高效液相色谱(HPLC)分析确定其转化率。最终所得底物的转化率为63.06％，ee值达99％以上，产率为62.29％。
上述各实施例和对比例中ee值根据液相谱图各个对映异构体的量计算，方式如下：ee＝(S-R)/(S+R)*100％
R/S：分别表示具备两个手性中心的物质的构型。
序列表
<110> 浙江大学
杭州馨海酶源生物科技有限公司
<120> 一种短链脱氢酶的突变体、编码基因及编码基因获得方法、突变体的应用
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 274
<212> PRT
<213> 短链脱氢酶(野生型)
<400> 1
Met Asn Glu Lys Phe Arg Pro Glu Met Leu Gln Gly Lys Lys Val Ile
1 5 10 15
Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg Glu Ile Ala Tyr His Leu
20 25 30
Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr Ala Arg Ser Lys Glu Ala
35 40 45
Leu Gln Lys Val Val Ala Arg Cys Leu Glu Leu Gly Ala Ala Ser Ala
50 55 60
His Tyr Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Met Thr Phe Ala Glu Glu Leu
65 70 75 80
Val Ala Glu Ala Gly Asn Leu Met Gly Gly Leu Asp Met Leu Ile Leu
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Asn His Val Leu Tyr Asn Arg Leu Ser Phe Phe His Gly Glu Ile Asp
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Asn Val Arg Lys Ser Met Glu Val Asn Phe His Ser Phe Val Val Leu
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Ser Val Ala Ala Met Pro Met Leu Met Gln Ser Gln Gly Ser Ile Ala
130 135 140
Val Val Ser Ser Val Ala Gly Lys Ile Thr Tyr Pro Leu Ile Ala Pro
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Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu Asp Gly Phe Phe Ser Thr Leu Arg
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Ser Glu Phe Leu Val Asn Lys Val Asn Val Ser Ile Thr Leu Cys Ile
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Trp Val Pro Tyr Leu Leu Gly Asn Pro Gly Arg Lys Ile Met Glu Phe
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<211> 274
<212> PRT
<213> 短链脱氢酶(突变体L104A)
<400> 2
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Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg Glu Ile Ala Tyr His Leu
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Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr Ala Arg Ser Lys Glu Ala
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Leu Gln Lys Val Val Ala Arg Cys Leu Glu Leu Gly Ala Ala Ser Ala
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His Tyr Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Met Thr Phe Ala Glu Glu Leu
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Val Ala Glu Ala Gly Asn Leu Met Gly Gly Leu Asp Met Leu Ile Leu
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Ser Val Ala Ala Met Pro Met Leu Met Gln Ser Gln Gly Ser Ile Ala
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Lys Gly Thr Ala Leu Arg Gln Asp Glu Met Tyr Tyr Val Gly Ser Arg
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Trp Val Pro Tyr Leu Leu Gly Asn Pro Gly Arg Lys Ile Met Glu Phe
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<212> PRT
<213> 短链脱氢酶(突变体A150Y)
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Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg Glu Ile Ala Tyr His Leu
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Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr Ala Arg Ser Lys Glu Ala
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Leu Gln Lys Val Val Ala Arg Cys Leu Glu Leu Gly Ala Ala Ser Ala
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Val Ala Glu Ala Gly Asn Leu Met Gly Gly Leu Asp Met Leu Ile Leu
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Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu Asp Gly Phe Phe Ser Thr Leu Arg
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Lys Gly Thr Ala Leu Arg Gln Asp Glu Met Tyr Tyr Val Gly Ser Arg
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<213> 短链脱氢酶(突变体Y155A)
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Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg Glu Ile Ala Tyr His Leu
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Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr Ala Arg Ser Lys Glu Ala
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Leu Gln Lys Val Val Ala Arg Cys Leu Glu Leu Gly Ala Ala Ser Ala
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<213> 短链脱氢酶(突变体I158A)
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Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr Ala Arg Ser Lys Glu Ala
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<211> 822
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gtgaccgcac gctctaaaga agccttacag aaagtggtgg cacgttgttt agaactgggt 180
gccgccagtg cccattatat tgcaggctct atggaagata tgacctttgc agaagaactg 240
gtggccgaag caggcaatct gatgggcggt ttagatatgc tgattctgaa tcatgtgctg 300
tataatcgcg cgtccttttt tcatggcgaa attgataatg ttcgcaaatc aatggaagtt 360
aattttcata gctttgttgt gctgtcagtt gcagccatgc cgatgctgat gcagtctcag 420
ggctctattg ccgtggtgag tagcgtggcc ggtaaaatta cctatccgct gattgccccg 480
tatagcgcaa gcaaatttgc cttagatggc ttttttagta ccctgcgtag tgaatttctg 540
gttaataaag ttaatgtgtc tattaccctg tgtattctgg gcctgattga taccgaaacc 600
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ctggaaatta ttaaaggcac cgcactgcgt caggatgaaa tgtattatgt tggctctcgt 720
tgggttccgt atctgttagg taatccgggt cgtaaaatta tggaatttct gtcagcaacc 780
gaatataatt gggataatgt tctgagcaat gaaaaactgt at 822
<210> 10
<211> 822
<212> DNA
<213> 短链脱氢酶编码基因(突变体A150Y)
<400> 10
atgaatgaaa aatttcgtcc ggaaatgtta cagggtaaaa aagtgattgt gaccggcgca 60
tctaaaggca ttggtcgcga aattgcatat catctggcca aaatgggcgc ccatgtggtt 120
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<210> 11
<211> 822
<212> DNA
<213> 短链脱氢酶编码基因(突变体Y155A)
<400> 11
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<210> 12
<211> 822
<212> DNA
<213> 短链脱氢酶编码基因(突变体I158A)
<400> 12
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<210> 13
<211> 822
<212> DNA
<213> 短链脱氢酶编码基因(突变体I202A)
<400> 13
atgaatgaaa aatttcgtcc ggaaatgtta cagggtaaaa aagtgattgt gaccggcgca 60
tctaaaggca ttggtcgcga aattgcatat catctggcca aaatgggcgc ccatgtggtt 120
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tgggttccgt atctgttagg taatccgggt cgtaaaatta tggaatttct gtcagcaacc 780
gaatataatt gggataatgt tctgagcaat gaaaaactgt at 822
<210> 14
<211> 822
<212> DNA
<213> 短链脱氢酶编码基因(突变体T205A)
<400> 14
atgaatgaaa aatttcgtcc ggaaatgtta cagggtaaaa aagtgattgt gaccggcgca 60
tctaaaggca ttggtcgcga aattgcatat catctggcca aaatgggcgc ccatgtggtt 120
gtgaccgcac gctctaaaga agccttacag aaagtggtgg cacgttgttt agaactgggt 180
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tataatcgct tatccttttt tcatggcgaa attgataatg ttcgcaaatc aatggaagtt 360
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ggctctattg ccgtggtgag tagcgtggcc ggtaaaatta cctatccgct ggcggccccg 480
tatagcgcaa gcaaatttgc cttagatggc ttttttagta ccctgcgtag tgaatttctg 540
gttaataaag ttaatgtgtc tattaccctg tgtattctgg gcctgattga taccgaaacc 600
gccattaaag ccgcgagcgg catttattta ggtccggcct ctccgaaaga agaatgtgca 660
ctggaaatta ttaaaggcac cgcactgcgt caggatgaaa tgtattatgt tggctctcgt 720
tgggttccgt atctgttagg taatccgggt cgtaaaatta tggaatttct gtcagcaacc 780
gaatataatt gggataatgt tctgagcaat gaaaaactgt at 822
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> 特异性引物(L104A-F)
<400> 15
tgctgtataa tcgcgcgtcc ttttttcatg gcgaaat 37
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 特异性引物(L104A-R)
<400> 16
aaaaggacgc gcgattatac agcacatgat tcagaatcag c 41
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 特异性引物(A150Y-F)
<400> 17
gtagcgtgta tggtaaaatt acctatccgc tgattg 36
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 特异性引物(A150Y-R)
<400> 18
attttaccat acacgctact caccacggca ata 33
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> 特异性引物(Y155A-F)
<400> 19
tatccgctgg cggccccgta tagcgcaa 28
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 特异性引物(Y155A-R)
<400> 20
tacggggccg ccagcggata ggtaatttta ccg 33
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 特异性引物(I158A-F)
<400> 21
cattaaagcc gcgagcggca tttatttagg tc 32
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 特异性引物(I158A-R)
<400> 22
aatgccgctc gcggctttaa tggcggttt 29
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 特异性引物(I202A-F)
<400> 23
aaaccgccgc gaaagccacc agcggcattt attta 35
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> 特异性引物(I202A-R)
<400> 24
ggtggctttc gcggcggttt cggtatcaat ca 32
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> 特异性引物(T205Y-F)
<400> 25
cattaaagcc tatagcggca tttatttagg tccgg 35
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性引物(T205Y-R)
<400> 26
aaatgccgct ataggcttta atggcggttt 30

Claims (10)

1.一种短链脱氢酶的突变体，其特征在于，
所述突变体为短链脱氢酶的第104位的亮氨酸突变为丙氨酸的突变体L104A，
或者第150位的丙氨酸突变为酪氨酸的突变体A150Y，
或者第155位的酪氨酸突变为丙氨酸的突变体Y155A，
或者第158位的异亮氨酸突变为丙氨酸的突变体I158A，
或者第202位的异亮氨酸突变为丙氨酸的突变体I202A，
或者第205位的苏氨酸突变为丙氨酸的突变体T205A；
所述短链脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的突变体的编码基因，其特征在于，
所述突变体L104A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9；
所述突变体A150Y的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10；
所述突变体Y155A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11；
所述突变体I158A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12；
所述突变体I202A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13；
所述突变体T205A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14。
3.一种获得如权利要求2所述的编码基因的方法，其特征在于，所述突变体的编码基因由短链脱氢酶的编码基因经特异性引物对扩增得到，其中：
突变体L104A的编码基因对应的特异性引物对为L104A_F/R，核苷酸序列如下：
L104A-F tgctgtataatcgcgcgtccttttttcatggcgaaat；
L104A-R aaaaggacgcgcgattatacagcacatgattcagaatcagc；
突变体A150Y的编码基因对应的特异性引物对为A150Y_F/R，核苷酸序列如下：
A150Y-F gtagcgtgtatggtaaaattacctatccgctgattg；
A150Y-R attttaccatacacgctactcaccacggcaata；
突变体Y155A的编码基因对应的特异性引物对为Y155A_F/R，核苷酸序列如下：
Y155A-F tatccgctggcggccccgtatagcgcaa；
Y155A-R tacggggccgccagcggataggtaattttaccg；
突变体I158A的编码基因对应的特异性引物对为I158A_F/R，核苷酸序列如下：
I158A-F cattaaagccgcgagcggcatttatttaggtc；
I158A-R aatgccgctcgcggctttaatggcggttt；
突变体I202A的编码基因的对应的特异性引物对为I202A_F/R，核苷酸序列如下：
I202A-F aaaccgccgcgaaagccaccagcggcatttattta；
I202A-R ggtggctttcgcggcggtttcggtatcaatca；
突变体T205A的编码基因的对应的特异性引物对为T205A_F/R，核苷酸序列如下：
T205Y-F cattaaagcctatagcggcatttatttaggtccgg；
T205Y-R aaatgccgctataggctttaatggcggttt；
短链脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.一种含有如权利要求2所述的编码基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为含有突变体编码基因的质粒、噬菌体或病毒载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为含有突变体编码基因的质粒pET-28a。
6.一种表达如权利要求1所述的突变体的工程菌，特征在于，工程菌通过如权利要求4或5任一所述的重组表达载体转化至宿主细菌中获得。
7.一种泼尼松龙的制备方法，其特征在于，包括以醋酸泼尼松为底物，加入如权利要求1所述的突变体、水解酶、葡糖脱氢酶、葡萄糖和含有机溶剂的pH缓冲溶液反应；
或者，包括以泼尼松为底物，加入如权利要求1所述的突变体、葡糖脱氢酶、葡萄糖和含有机溶剂的pH缓冲溶液反应。
8.根据权利要求7所述的泼尼松龙的制备方法，其特征在于，所述突变体以如权利要求6所述的工程菌发酵培养后的湿菌体形式加入，或者以所得湿菌体破碎后的粗酶液的形式加入；
以湿菌体形式表示，突变体的加入量为150～250g/L湿菌体。
9.根据权利要求7所述的泼尼松龙的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为异丙醇或N,N-二甲基甲酰胺；有机溶剂在pH缓冲溶液中的体积分数为8～12%。
10.根据权利要求7至9任一所述的制备方法，其特征在于，
底物的添加浓度为20～80g/L；
葡萄糖脱氢酶的加入浓度为150～250g/L;
葡萄糖的加入浓度为20～40 g/L；
水解酶的添加浓度为150～250g/L；
所用pH缓冲溶液为磷酸钾缓冲液，pH值为6.0～7.0；
反应温度为30～48℃；
反应时间为16～30h；
振荡速率为150～300rpm。
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