CN114457055B - 一种羧酯酶、编码基因、基因工程菌及其应用 - Google Patents

一种羧酯酶、编码基因、基因工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种羧酯酶及其编码基因，以及由该编码基因构建的基因工程，以及其在微生物催化制备S‑萘普生中的应用。所述羧酯酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因核苷酸核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用该基因构建工程菌进行酶法立体选择性催化生产S‑萘普生，具有时空产率高，效果稳定的特点，在较短时间内可以获得转化效率可达到48%以上，光学纯度可达到99%以上，对实现高产量高纯度的S‑萘普生生产具有重要意义。

Description

一种羧酯酶、编码基因、基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种羧酯酶及其编码基因，以及由该编码基因构建的基因工程，以及其在微生物催化制备S-萘普生中的应用。
背景技术
萘普生（6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙酸）是一类具有抗炎、抗风湿、解热镇痛作用的非甾体类抗炎药。萘普生有两种构型，其中S-萘普生是R-萘普生活性的28倍，制备光学纯萘普生能在提高药效的同时降低其临床风险性。传统的S-萘普生合成以化学法为主，化学法工艺复杂且手性催化剂价格昂贵，易对环境造成巨大的污染。相比之下采用酶法水解拆分制备S-萘普生具有的反应条件温和，工艺流程简单，对环境友好等优点，使得生物酶法越来越受到重视。
据辛嘉英等研究，在水-离子液体两相体系中（中国ZL 03152790.6），应用脂肪酶柱状酵母L-1754进行萘普生甲酯的水解在底物加量为75 mg/mL转化率为38.13 %，光学纯度为97.67 %。许建和团队采用高速匀浆（中国ZL 2010114462.8）的方法将制备的含有40g/L萘普生甲酯悬浮浆液与羧酯酶粗酶进行反应转化率为39.8%。据李海艳（学术论文，哈尔滨商业大学，2016）报道采用褶皱假丝酵母脂肪酶在萘普生甲酯加量为10 g/L时，反应3 h转化率>20 %，光学纯度为98 %。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供一种分离自某传统蚕豆酱酿造工厂的酱曲样品0305宏基因组DNA的羧酯酶及其编码基因，以及由该编码基因构建的基因工程，以及其在微生物催化制备S-萘普生中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种羧酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明构建并筛选了四种不同来源的酯酶，分别来源于实验室常用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株168、分离自土壤样品的菌株B. subtilis IFE602、安徽某传统蚕豆酱酿造工厂的酱曲样品0305宏基因组DNA和某公司生物肥料样品B501宏基因组DNA，其中来自酱曲样品0305宏基因组DNA的羧酯酶活性最高，即本发明羧酯酶，该羧酯酶以大肠杆菌为宿主进行异源表达，用于选择性拆分(R，S)-萘普生甲酯制备S-萘普生，具有高催化效率和高选择性的特点。
本发明还涉及编码所述的羧酯酶的基因。
具体的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体。
本发明还涉及含有所述编码基因的基因工程菌。
具体的，所述工程菌按如下方法构建获得：将SEQ ID NO.1所示的羧酯酶基因克隆到pET28a质粒上，构建pET28a-cesA0305重组表达质粒，并转化到大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3) (pET28a-cesA0305)，即所述基因工程菌。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物催化制备S-萘普生中的应用。
具体的，所述应用为：以所述基因工程菌经发酵培养获得的发酵液、发酵液离心后的湿菌体（湿菌体添加量30~70 g/L，60 g/L）与缓冲液或去离子水的菌悬液或菌悬液破碎液为催化剂，以（R,S）-萘普生甲酯为底物（添加量150~250 g/L，优选200 g/L），并加入辅助剂，在30~45℃、pH为6.0~8.0的条件下进行反应，获得含S-萘普生的反应液，反应液经分离纯化得到所述S-萘普生；所述辅助剂为下列之一：PEG20000，石油醚，正庚烷，吐温-20，Span80，PEG2000，异辛烷，正丁醇，异丙醇。优选的，所述辅助剂为异辛烷。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种羧酯酶及其编码基因，利用该基因构建工程菌进行酶法立体选择性催化生产S-萘普生，具有时空产率高，效果稳定的特点，在较短时间内可以获得转化效率可达到48 %以上，光学纯度可达到99 %以上，对实现高产量高纯度的S-萘普生生产具有重要意义。
附图说明
图1为萘普生的分子结构式。
图2为pET28a-cesA-0305质粒图。
图3为4种羧酯酶基因的序列比对图。
图4为萘普生甲酯的HPLC分析图谱。
图5为萘普生的HPLC分析图谱。
图6为羧酯酶0305催化液的HPLC分析图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
种子培养基组成：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，溶剂为去离子水，pH=6.8~7.0。
发酵培养基组成：酵母粉12 g/L，蛋白胨15 g/L，甘油10 g/L，Na2HPO4·12H2O 8.9g/L，KH2PO4 3.4 g/L，NH4Cl 2.67 g/L，Na2SO4 0.71 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，溶剂为去离子水，pH=6.8-7.0。
实施例1：四种含羧酯酶基因的重组大肠杆菌的构建
（1）羧酯酶基因扩增
以实验室常用的枯草芽孢杆菌菌株168的基因组DNA、分离自土壤样品的保藏菌株B. subtilis IFE602的基因组DNA、安徽某传统蚕豆酱酿造工厂的酱曲样品0305宏基因组DNA、某公司生物肥料样品B501宏基因组DNA为DNA模板，以cesA-NdeI-F/cesA-R为扩增引物，采用南京诺唯赞生物科技有限公司的高保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase进行PCR扩增得到一系列羧酯酶基因其PCR扩增程序为：95 ℃，3 min；95 ℃，15s；53 ℃，15 s；72 ℃，3 min；30个循环；72 ℃，5 min；4 ℃保存。用DNA胶回收试剂盒进行PCR产物纯化。
cesA-NdeI-F：
5’-GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGTCAAACCATTCATCTAGTATTC-3’；
cesA-R:
5’-cttgtcgacggagctcgaattcggatccttaccgtgaaatgcctgtttctg-3’。
扩增获得四种羧酯酶基因序列如下：
cesA168：
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cesAIFE602：
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cesA0305（即SEQ ID No.1）：
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cesAB501：
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（2）羧酯酶基因克隆到pET-28a质粒上，得到重组质粒
提取质粒pET-28a，经过BamHI/NdeI酶切后，采用DNA胶回收试剂盒纯化酶切后的线性化质粒。将已纯化的PCR产物和线性化质粒进行重组连接反应，采用南京诺唯赞生物科技有限公司的一步克隆试剂盒One Step Cloning Kit转化到E. coli BL21感受态细胞中，在含终浓度50 mg/L卡那霉素的LB平板上进行筛选。菌落PCR验证阳性克隆子，并提取质粒进行测序分析。最终获得重组大肠杆菌cesA168，重组大肠杆菌cesAIFE602，重组大肠杆菌cesA0305，重组大肠杆菌cesAB501。
实施例2：2 L发酵罐制备生产羧酯酶
（1）种子活化
将四种重组大肠杆菌接种到含有50 mg/L卡那霉素的LB培养基中，37 ℃，200 rpm培养至对数生长中期，获得种子液。
（2）将新鲜种子液以体积5 %接种量接种在含有0.05 %（v/v）消泡剂和50 mg/L卡那霉素的发酵培养基中，发酵温度37 ℃，溶解氧DO控制大于20 %，用25 %氨水控制pH为6.86。从接种发酵罐开始四个小时开始补料甘油，以每小时30 mL/h/L补料12 h，发酵五小时补料乳糖，以每小时40 mL/h/L诱导10 h。补料甘油组成：60 g甘油和4 g MgSO4·7H2O溶解在400 mL去离子水中，加入补料乳糖组成：30 g乳糖溶解在200 mL去离子水中。发酵时长20 h，最终获得OD600=24的发酵液。
将新鲜发酵液4000 rpm离心10 min后弃上清得含羧酯酶湿菌体，适当稀释或浓缩即可直接用作催化剂进行反应，需尽快用作催化反应，避免长时间保存。
实施例3：比较四种不同来源羧酯酶的水解萘普生甲酯制备S-萘普生的催化活性
取实施例2中的四种含羧酯酶湿菌体各1 g，重新悬浮在20 mL pH=8 0.2 MNa2HPO4-柠檬酸缓冲液中，加入10 g/L萘普生甲酯，于40 ℃恒温水浴中磁力搅拌，反应液用于HPLC分析。测得转化率和ee p 如表1所示。通过对四种羧酯酶进行不同时间的反应过程监测发现，羧酯酶0305的转化效率远远高于羧酯酶B501和羧酯酶IFE602，且与羧酯酶168相比，羧酯酶0305的转化率和ee值更优。
（2）HPLC液相检测方法：取反应液100 μL，加入20μL 1mol/L盐酸酸化，涡旋混匀后吸取少量样品点涂于广泛pH试纸，将pH值控制在1~2。之后向其中加入适量正丁醇进行萃取，振荡混匀。正丁醇微溶于水，样品会出现分层，色谱柱OD柱在运行过程中若有水会影响柱效，因此向其中加入约0.5 g无水硫酸钠超声20 min以除水。放置过夜，待样品不分层后，12000 rpm离心2 min后用0.22 μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中进行液相分析。检测器采用Waters 1525-2489高效液相色谱仪，流速为1 mL/min，检测波长为254 nm。色谱柱：DAICLE CHIRALPAK® OD-H，流动相为正己烷：异丙醇：三氟乙酸=98:2:0.01（v/v）。R-萘普生甲酯出峰时间一般为：6~8 min，S-萘普生甲酯出峰时间一般为：7~9 min，R-萘普生出峰时间一般为：20~22 min，S-萘普生出峰时间一般为：24~26 min。
实施例4：比较不同辅助剂对羧酯酶CesA0305水解萘普生甲酯制备S-萘普生的效果
取实施例2中得到的羧酯酶-0305湿菌体40 g/L，加入1 %（v/v）辅助剂（吐温20，Span80，PEG2000，PEG20000，石油醚，正庚烷，异辛烷，正丁醇，异丙醇）与100 g/L萘普生甲酯充分混合溶解，以pH=8 0.2 M Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制200 mL催化体系，于40 ℃恒温水浴中磁力搅拌反应12 h，反应液用于HPLC分析，分析结果如表2所示。筛选结果表明异辛烷的转化率和ee值远远高于其他八种辅助剂，为本次实验中的最优水平。
实施例5：羧酯酶-0305湿菌体用于制备S-萘普生
（1）湿菌体用量为30 g/L
取实施例2中得到的羧酯酶-0305湿菌体，加入1 %（v/v）异辛烷辅助剂与100 g/L萘普生甲酯充分溶解，以pH=8 0.2 M Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制200 mL催化体系，于40 ℃恒温水浴中磁力搅拌反应12 h，反应液用于HPLC分析，测得反应时间12 h转化率34.5 %，ee=99%。单位时间内每克湿菌体转化产生0.096 g/L S-萘普生。
（2）湿菌体用量为40 g/L
取实施例2中得到的羧酯酶-0305湿菌体，加入1 %（v/v）异辛烷辅助剂与100 g/L萘普生甲酯充分溶解，以pH=8 0.2 M Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制200 mL催化体系，于40 ℃恒温水浴中磁力搅拌反应12 h，反应液用于HPLC分析，测得反应时间12 h转化率为44.2 %，ee=99 %。单位时间内每克湿菌体转化产生0.122 g/L S-萘普生。
（3）湿菌体用量为50 g/L
取实施例2中得到的羧酯酶-0305湿菌体，加入1 %（v/v）异辛烷辅助剂与100 g/L萘普生甲酯充分溶解，以pH=8 0.2 M Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制200 mL催化体系，于40 ℃恒温水浴中磁力搅拌反应12 h，反应液用于HPLC分析，测得反应时间12 h内转化率为46.5%，ee=99 %。单位时间内每克湿菌体转化产生0.122 g/L S-萘普生。
（4）湿菌体用量为60 g/L
取实施例2中得到的羧酯酶-0305湿菌体，加入1 %（v/v）异辛烷辅助剂与100 g/L萘普生甲酯充分溶解，以pH=8 0.2 M Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制200 mL催化体系，于40 ℃恒温水浴中磁力搅拌反应12 h，反应液用于HPLC分析，测得反应时间12 h内转化率为48.1%，ee=99 %。单位时间内每克湿菌体转化产生0.133 g/L S-萘普生。
（5）湿菌体用量为70 g/L
取实施例2中得到的羧酯酶-0305湿菌体，加入1 %（v/v）异辛烷辅助剂与100 g/L萘普生甲酯充分溶解，以pH=8 0.2 M Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制200 mL催化体系，于40 ℃恒温水浴中磁力搅拌反应12 h，反应液用于HPLC分析，测得反应时间12 h内转化率为48.5%，ee=99 %。单位时间内每克湿菌体转化产生0.134 g/L S-萘普生。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种羧酯酶、编码基因、基因工程菌及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 903
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atgtcaaacc attcatctag tattcccgaa ttaagtgaca acggtatccg ctattatcaa 60
acttataatg aaagccttag tctttggccg gtccgttgta aatcattcta tatatctact 120
cgttttggtc aaacacatgt gattgcaagc ggcccagagg atgccccgcc gcttgtatta 180
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aaatacagaa cttatgcagt tgatatcata ggtgataaaa acaagagtat tcctgagaat 300
gtaagcggta caagaacgga ttacgccaat tggcttcttg atgtgtttga caatctgggg 360
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Claims (8)

1.一种羧酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述的羧酯酶的基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.含有权利要求2所述编码基因的重组载体。
5.含有权利要求2所述编码基因的基因工程菌。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述工程菌按如下方法构建获得：将SEQ ID NO.1所示的羧酯酶基因克隆到pET28a质粒上，构建pET28a-cesA0305重组表达质粒，并转化到大肠杆菌E. coli BL21（DE3）中，得到重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3），即所述基因工程菌。
7.权利要求5所述基因工程菌在微生物催化制备S-萘普生中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用为：以所述基因工程菌经发酵培养获得的发酵液、发酵液离心后的湿菌体与缓冲液或去离子水的菌悬液或菌悬液破碎液为催化剂，以（R，S）-萘普生甲酯为底物，并加入辅助剂，在30~45℃、pH为6.0~8.0的条件下进行反应，获得含S-萘普生的反应液，反应液经分离纯化得到所述S-萘普生；所述辅助剂为异辛烷。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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