CN101880695A

CN101880695A - 一种酶拆分外消旋萘普生酯制备(s)-萘普生的方法

Info

Publication number: CN101880695A
Application number: CN2010101144628A
Authority: CN
Inventors: 许建和; 刘想; 潘江; 赵晶
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2010-11-10
Anticipated expiration: 2030-02-26
Also published as: CN101880695B

Abstract

本发明公开了一种酶拆分外消旋萘普生酯制备(S)-萘普生的方法，包括在水相介质中利用酯酶或脂肪酶拆分外消旋萘普生酯水解形成(S)-萘普生，其中，所述的外消旋萘普生酯经机械破碎分散于水相介质中形成悬浮浆液后，再加入酯酶或脂肪酶进行水解反应。本发明还利用醇钠作为碱催化剂对(R)-萘普生酯进行消旋，降低了生产成本，提高了反应收率。本发明实现了萘普生酯在单一水相反应介质中的有效分散，使反应底物浓度大大提高，反应速度加快，反应收率提高，(S)-萘普生综合收率可达86％，光学纯度可达97％以上。本发明工艺方法简便，可以不使用有机溶剂或者表面活性剂，环境污染小。

Description

一种酶拆分外消旋萘普生酯制备(S)-萘普生的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一种酶拆分外消旋萘普生酯制备(S)-萘普生的方法。

背景技术

萘普生是一种重要的2-芳基丙酸类非甾体抗炎药，在医药行业中有着十分广泛的应用。(S)-萘普生的消炎活性是(R)-萘普生的28倍；为了提高药效，降低(R)-萘普生的毒副作用，扩大用药安全范围，有必要制备光学纯的单一对映体(S)-萘普生。

单一构型的(S)-萘普生可以通过化学拆分、酶催化不对称合成或者酶法拆分等方法获得。从产品得率、分离难易以及光学纯度等角度考虑，酯酶催化的外消旋萘普生酯的对映选择性水解已成为制备高光学纯度(S)-萘普生的首选方法。目前已经有很多酯酶/脂肪酶应用于萘普生酯的水解拆分，包括柱状假丝酵母脂肪酶、枯草芽胞杆菌酯酶以及沙雷氏菌脂肪酶等。

萘普生酯的水溶性较差，研究人员采用了很多方法提高萘普生酯的溶解度，促进其在反应介质中的分散，包括采用非水相反应体系以及使用表面活性剂。辛嘉英等使用柱状假丝酵母脂肪酶，在非水介质中催化萘普生甲酯的水解拆分，反应分别在水饱和有机溶剂(中国ZL 99126583.1)、水-异辛烷两相体系(中国ZL 00133042.X)以及水-离子液两相体系(中国ZL 03152790.6)中进行。非水相体系的应用在一定程度上提高了底物的溶解度，尽管如此，在上述体系中，萘普生甲酯的最高浓度仅15g/L，并且有机溶剂或非离子液等非水溶剂的采用，不仅增加了反应体系的复杂性，而且面临着有机溶剂挥发、易燃，非水介质对环境的污染以及反应体系乳化、反应物分离困难等问题。Steenkamp等采用来自DSM公司的枯草芽孢杆菌羧酯酶(carboxylesterase NP)催化萘普生甲酯的立体选择性水解[Process Biochem.，2008，43：1419-1426]，反应在磷酸盐缓冲液中进行，研究人员在反应体系中加入表面活性剂吐温80以促进底物萘普生甲酯的分散。与非水相体系相比，在水相反应体系中加入添加剂的方法简便易行，并且表面活性剂的加入有效地提高了反应底物的浓度或分散度，尽管如此，表面活性剂的使用增加了后续产物分离的难度，并且对产品有较大的污染。针对上述问题，有必要开发一种新的方法，既能促进底物固体萘普生酯的分散，从而提高底物浓度，又简便易行，不产生新的污染。

在萘普生酯的对映选择性水解拆分路线中，(S)-萘普生酯被立体选择性水解生成(S)-萘普生，留下较低光学纯度的未水解的(R)-萘普生酯。为提高产品得率，必须对(R)-萘普生酯进行消旋化处理，生成消旋的萘普生酯，以便重新作为酶促水解的底物循环使用。将未反应的(R)-萘普生酯溶解于含有氢氧化钠、氢氧化钾等强碱的醇溶剂中，在加热条件下进行碱催化消旋是芳基丙酸酯消旋化常用的方法。此外，也有文献报道选择二氮杂环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)等有机碱作为消旋化试剂，在加热条件下进行消旋。这些碱类化合物都能实现萘普生酯的消旋，但是都存在着缺陷。使用氢氧化物进行消旋容易导致萘普生酯的水解，而DBU等有机碱价格较昂贵，而且其使用会造成反应产物的污染。因此有必要选择一种更有效的廉价碱催化剂进行(R)-萘普生甲酯的消旋化。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的酶法拆分外消旋萘普生酯制备(S)-萘普生的方法存在萘普生酯在单一水相反应介质中溶解性差，减慢了酶促反应的速度，需要引入非水相反应体系或外加添加剂，从而导致环境污染和反应物分离困难的缺陷，提供一种萘普生酯酶法拆分制备(S)-萘普生的的新方法，其能够促进底物萘普生酯在单一水相反应介质中的分散，从而提高底物浓度，提高反应效率，又简便易行，不产生新的污染。本发明还针对(R)-萘普生酯的消旋方法中使用导致萘普生酯水解的氢氧化物强碱或者价格昂贵的DBU等有机碱作为消旋催化剂的不足，提供一种新的(R)-萘普生酯的消旋方法，其使用的消旋催化剂价格便宜而且不会引起萘普生酯的水解。

本发明人经过广泛的研究和反复的试验发现，萘普生酯在水中溶解性差，从而在单一水相介质中萘普生酯分散性差，水相介质中浓度很低，与酶接触面积小，从而导致产生反应速率慢的问题，因此，本发明人特别的采用机械破碎的方法，将萘普生酯分散于水相反应介质中，形成悬浮浆液，从而极大地增加了萘普生酯颗粒的表面积，有效地提高了酶促反应的速率，即使不借助非水溶剂或者表面活性剂等添加剂即可实现高浓度萘普生酯的高效酶促转化。本发明人还发现，选择醇钠作为碱催化剂，在(R)-萘普生酯的醇溶液中，加入醇钠，加热回流，即可进行萘普生酯的消旋。醇钠价廉、用量少，对产品无污染，而且在消旋反应条件下萘普生酯不会发生自发水解，从而完成了本发明。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种酶拆分外消旋萘普生酯制备(S)-萘普生的方法，包括在水相介质中利用酯酶或脂肪酶拆分外消旋萘普生酯水解形成(S)-萘普生，其中，所述的外消旋萘普生酯经机械破碎分散于水相介质中形成悬浮浆液后，再加入酯酶或脂肪酶进行水解反应。

根据本发明，所述的机械破碎较佳的是匀浆，所述匀浆优选高压匀浆法或者高速捣碎匀浆法。所述的高压匀浆或者高速匀浆都是本领域常规技术，可利用高压匀浆机或高速匀浆机进行，一般较佳的高压匀浆采用200～1000bar的压力，高速匀浆采用10,000rpm，1～20分钟。

所述的水相介质可以是现有技术的任何水相介质，优选水或者缓冲溶液。所述的缓冲溶液可以是常规的缓冲对水溶液，较佳的选自磷酸盐、Tris-HCl、硼酸盐缓冲溶液。所述的水相介质中较佳的不包括表面活性剂。

所述的酯酶或脂肪酶可以是现有技术，包括能够酶法拆分外消旋萘普生酯水解形成(S)-萘普生的任何酯酶或脂肪酶。所述的酯酶较佳的是羧酯酶，更佳的如枯草芽孢杆菌羧酯酶，更优选重组枯草芽孢杆菌羧酯酶，如其基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示的枯草芽孢杆菌羧酯酶，其是来源于枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis CGMCC 2548的羧酯酶，已经在GENBANK中注册，注册号为GQ868652。

所述的萘普生酯可以是现有技术中的任何萘普生酯，最常用的是萘普生甲酯，为本发明优选。萘普生酯作为底物，其浓度较佳的为1～100g/L。

根据本发明，所述的酶拆分反应的反应温度、反应时间、反应液pH值都同现有技术，较佳的，反应温度为20～50℃，更优选25～35℃，反应液的pH为6～10，更优选pH7～9，反应过程中连续补加碱液以维持反应液的pH恒定不变，反应时间为1～10小时。

所述的酯酶或脂肪酶的加入量也同现有技术，较佳的以外消旋萘普生酯的重量为基准为1～100U/g底物，最适用量为5～10U/g底物。

根据本发明，酶拆分反应终止后，可以按照常规方法将反应液过滤分离出滤液和滤饼。水解生成的(S)-萘普生以盐的形式溶解于滤液中，而未反应的(R)-萘普生酯则被截留在滤布上，实现(R)-和(S)-萘普生的拆分。其中，含有(S)-萘普生盐的滤液可以按照常规方法，从中分离得到(S)-萘普生。如在搅拌状态下，可通过向滤液中加入硫酸或盐酸，调节滤液pH至1～2，滤液中的(S)-萘普生以沉淀的形式析出，经过滤分离、精制即可得到目标产品(S)-萘普生。而(R)-萘普生酯可以按照常规的方法进行消旋化，也可以按照本发明的方法进行消旋化，本发明的方法见下文所述。消旋化的萘普生酯即可进一步作为酶促拆分制备(S)-萘普生的低物。本发明较佳的选择将消旋化的萘普生酯与新鲜萘普生酯混合重新用于酶促拆分反应，反复套用，从而减少产品的物料消耗，提高生产效率，获得更高的经济效益和环境效益。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种(R)-萘普生的消旋方法，包括将(R)-萘普生酯溶解于醇溶剂中，加入强碱作为催化剂，在加热条件下进行碱催化消旋即得，其中，所述的强碱是醇钠。

根据本发明，所述的醇钠可以是任何有机醇钠，如甲醇钠、乙醇钠等，优选甲醇钠。所述的醇钠的浓度较佳的为1～20g/L，更佳的为5～10g/L。所述的醇溶剂可以是任何有机醇，如甲醇、乙醇等，优选甲醇。所述的加热条件是常规条件，较佳的是加热至60～80℃进行回流反应。所述的回流较佳的进行0.5～4小时，更佳的进行2小时。

本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明的一较佳实施例为：一种从外消旋萘普生酯酶法拆分制备S-萘普生的方法，包括以下步骤：

(1)外消旋萘普生酯经机械破碎分散于水或者缓冲液中形成悬浮浆液；

(2)加入羧酯酶进行酶拆分反应；

(3)酶拆分反应终止后，将反应液过滤分离出滤液和滤饼；

(4)在搅拌状态下，调节滤液pH至1～2，滤液中析出沉淀，过滤分离，即得(S)-萘普生；

(5)滤饼溶解于醇溶剂中，加入醇钠，加热回流，即得外消旋萘普生酯；

(6)步骤(5)所得的外消旋的萘普生酯与新鲜萘普生酯混合重新用于酶促拆分反应。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明实现了底物萘普生酯在单一水相反应介质中的有效分散，使酶法拆分外消旋萘普生酯制备(S)-萘普生的反应速度加快，底物浓度高，反应收率高，(S)-萘普生总收率高，综合收率可达86％，化学纯度及光学纯度均高，光学纯度可达97％以上。并且本发明工艺方法简便，可以不使用有机溶剂或者表面活性剂，环境污染很小。反应体系简单，反应产物容易分离，生产成本低，适合在现有化学法(S)-萘普生生产企业中推广应用。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 羧酯酶BsE-NP01的制备

设计引物：

引物1：5’-TTCCATATGTCAAACCATTCATCTAGTATTCCCG-3’；

引物2：5’-GGATCCTTACCGTGAAATGCCTGTTTCTGCATTG-3’。

以提取的枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis CGMCC 2548基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，所得PCR产物连接到质粒pMD 18-T(购自Takara公司)上，转化到大肠杆菌DH 5α中，筛选阳性克隆。对阳性克隆质粒进行核苷酸测序，其中插入的重组片段的羧酯酶BsE-NP01基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，该DNA序列已经在GENBANK中注册，注册号为GQ868652。使用限制性内切核苷酸酶NdeI和BamHI(购自Takara公司)分别对如上获得的重组质粒以及质粒pET-11a(购自Takara公司)进行酶切、连接，并转化到大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆。对阳性克隆质粒核苷酸测序，证明目标羧酯酶BsE-NP01的基因DNA片段已经正确插入载体pET-11a中。

将重组大肠杆菌BL21接种到液体培养基中进行目标酯酶的高效表达。在5L体积的搅拌发酵罐中，加入3L的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠5g/L)，高压灭菌后按2％的比例接入在LB培养基中预培养的种子液，在37℃，培养至对数生长中期后，加入0.1mmol/L的诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，于接种9h后离心收集菌体，经高压匀浆破碎后，离心收集含酶的上清液，作为酯酶粗酶液直接用于萘普生甲酯的酶促水解拆分。

枯草芽胞杆菌羧酯酶BsE-NP01的酶活单位(U)定义为：将100μl粗酶液加到2.87ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)中，在30℃保温3min之后，加入30μl100mM的对硝基苯酚丁酸酯的二甲基亚砜溶液，混匀后利用分光光度计，跟踪405nm下吸光值的变化，计算对硝基苯酚丁酸酯酶促水解反应的转化速率。1个羧酯酶活力单位(U)定义为：在上述反应条件下，每分钟催化对硝基苯酚丁酸酯水解生成1.0μmol对硝基苯酚所需的酶量。

实施例2

将80g消旋萘普生甲酯与500ml自来水混合，置于高速捣碎匀浆机JJ-2(上海浦东物理光学仪器厂金坛实验仪器分厂)中，高速匀浆(10,000rpm、20min)捣碎。将所得外消旋萘普生甲酯的悬浮浆液加置于2-L玻璃反应釜中，加入实施例1中得到的羧酯酶粗酶600U，加自来水补足至总体积2.0L，恒温于28℃反应，搅拌转速为300rpm，通过自动流加浓氨水将反应液pH恒定于7.5，5小时后终止反应，此时转化率约36％。

反应终止后，将反应混合物抽滤，滤饼为未参与反应的(R)-萘普生甲酯，滤液中含有(S)-萘普生的铵盐。在滤液中小心加入少量50％(w/v)的浓硫酸调节pH至1～2，析出(S)-萘普生沉淀，经抽滤、水洗和干燥，获得24.0g目标产品(S)-萘普生，纯度高于99％，ee值为96.2％。

实施例3

将实施例2中收集的(R)-萘普生甲酯滤饼烘干，约50g，加入100ml甲醇和0.6g甲醇钠，加热至回流，持续回流反应2h，冷却后抽滤，获得消旋萘普生甲酯46.5g。获得的消旋萘普生甲酯可直接与新鲜底物混合，匀浆后用于下一批酶促水解反应。

实施例4

将80g消旋萘普生甲酯匀浆所得的悬浮液置于2-L玻璃反应釜中，按实施例2中描述的方法，酶促反应并分离后获得(S)-萘普生和(R)-萘普生甲酯。未反应的(R)-萘普生甲酯按实施例3中描述的方法进行消旋化后与新合成的(R，S)-萘普生甲酯混合套用。每轮反应中补加新鲜的消旋萘普生甲酯至总重量80g，然后再次按实施例2中描述的方法，进行酶促拆分反应。如此重复反应10批，重复反应的结果见表1。总体而言，(S)-萘普生的综合收率达86％，光学纯度可达97％ee，再经一次结晶精制后即满足制药的要求。

表1 (S)-萘普生的重复拆分结果

实施例5

使用高速捣碎匀浆法制备萘普生甲酯的悬浮浆液。将5g消旋萘普生甲酯与100ml水混合，置于高速捣碎匀浆机JJ-2(上海浦东物理光学仪器厂金坛实验仪器分厂)中，10,000rpm高速捣碎匀浆，处理20min后，取20ml消旋萘普生甲酯的悬浮浆液置于250ml三口烧瓶中，加入80ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)，分别加入柱状假丝酵母脂肪酶CRL(购自Sigma公司)、皱褶假丝酵母脂肪酶Lipase OF(购自Meito Sangyo公司)以及实施例1中得到的羧酯酶粗酶各30U(活力测定方法同实施例1)，在恒温震荡摇床上反应，反应温度为28℃，震荡频率为200rpm，反应0.5小时后终止反应，反应结果见表2。

表2 不同酯酶/脂肪酶催化外消旋萘普生甲酯水解的转化率

酯酶/脂肪酶转化率(％)

Lipase OF 2.3

CRL 10.2

BsE-NP01 17.8

实施例6

使用高压匀浆法制备萘普生甲酯的悬浮浆液。分别将4g消旋萘普生甲酯与100ml水混合，用高压匀浆机AH110B(ATS工业系统有限公司)在不同压力下进行高压匀浆，将生成的消旋萘普生甲酯的悬浮浆液置于250ml三口烧瓶中，加入实施例1中得到的羧酯酶粗酶30U，加入少量硼酸钠调节初始pH为7.5。恒温于28℃反应，搅拌转速为300rpm，通过自动流加浓氨水将反应液pH恒定于7.5，5小时后终止反应，反应结果见表3。

表3 高压匀浆对酶法水解外消旋萘普生甲酯转化率的影响

消旋萘普生甲酯高压匀浆处理压力(bar) 转化率(％)

0 10.2

200 18.7

500 39.3

800 48.8

1000 51.8

实施例7

使用高速捣碎匀浆法制备萘普生甲酯的悬浮浆液。将20g消旋萘普生甲酯与500ml水混合，置于高速捣碎匀浆机JJ-2(上海浦东物理光学仪器厂金坛实验仪器分厂)中，10,000rpm高速捣碎匀浆，处理不同时间后，取100ml消旋萘普生甲酯的悬浮浆液置于250ml三口烧瓶中，加入实施例1中得到的羧酯酶粗酶30U，加入1ml Tris-HCl缓冲液(2M，pH 7.5)，恒温于28℃反应，搅拌转速为300rpm，通过自动流加浓氨水将反应液pH恒定于7.5，5小时后终止反应，反应结果见表4。

表4 高速匀浆捣碎对酶法水解外消旋萘普生甲酯转化率的影响

萘普生甲酯高速捣碎匀浆处理时间(min) 反应转化率(％)

0 10.2

1 15.7

5 30.9

10 35.5

15 38.7

20 39.8

序列表

<110>华东理工大学

<120>一种酶拆分外消旋萘普生酯制备(S)-萘普生的方法

<130>P4-101121C

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>903

<212>DNA

<213>枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)

<400>1

atgtcaaacc attcatctag tattcccgaa ttaagtgaca acggtatccg ctattatcaa 60

acttataatg aaagccttag tctttggccg gtccgttgca aatcattcta tatatctact 120

cgttttggtc aaacacatgt gattgcaagc ggcccagagg atgccccgcc gcttgtatta 180

ctccacggag cattattcag ctcgacgatg tggtatccca acatcgccga ttggagcagc 240

aaatacagaa cttatgcagt tgatatcata ggtgataaaa acaagagtat tcctgagaat 300

gtaagcggta caagaacgga ttacgccaat tggcttcttg atgtgtttga caatctgggg 360

atcgaaaagt cccacatgat cggactttcg cttggcggtc tccatacgat gaatttcctt 420

ttacgtatgc ctgagagagt aaaaagcgca gctatactga gtccggcaga aacgtttttg 480

ccatttcatc acgatttcta caaatacgct cttggcctta cagcgtcaaa tggagttgaa 540

acattcttaa attggatgat gaatgatcag aatgtgctgc acccgatttt tgtgaagcag 600

tttcaggcag gggtaatgtg gcaggatgga tcaagaaatc caaatcctaa agccgacgga 660

tttccgtatg tttttaccga tgaggaatta cgttcagcaa gagttcctat cctattatta 720

cttggtgaac atgaagtcat ctatgatccc cactcagccc tgcaccgagc ctcttcattc 780

gttcctgata ttgaggcgga agtcattaaa aatgccggac atgttttatc gatggaacaa 840

cccgcttacg taaatgaacg tgtaatgcgt tttttcaatg cagaaacagg catttcacgg 900

taa 903

Claims

1.一种酶拆分外消旋萘普生酯制备(S)-萘普生的方法，包括在水相介质中利用酯酶或脂肪酶拆分外消旋萘普生酯水解形成(S)-萘普生，其特征在于，所述的外消旋萘普生酯经机械破碎分散于水相介质中形成悬浮浆液后，再加入酯酶或脂肪酶进行水解反应。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的机械破碎是匀浆。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水相介质是水或者缓冲溶液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酯酶是重组枯草芽孢杆菌羧酯酶。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌羧酯酶的基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的萘普生酯是萘普生甲酯。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酶促反应终止后，将反应液过滤分离出滤液和滤饼，在搅拌状态下调节滤液pH至1～2，有沉淀析出，即(S)-萘普生。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的滤饼即是(R)-萘普生酯，将(R)-萘普生酯进行消旋化，得消旋的萘普生酯。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的消旋的萘普生酯与新鲜萘普生酯混合重新用于酶促拆分反应。

10.一种(R)-萘普生的消旋方法，包括将(R)-萘普生酯溶解于醇溶剂中，加入强碱作为催化剂，在加热条件下进行碱催化消旋即得，其特征在于，所述的强碱是醇钠。

11.如权利要求10所述的消旋方法，其特征在于，所述的醇钠是甲醇钠，所述的醇溶剂是甲醇。

12.如权利要求10所述的消旋方法，其特征在于，加热条件是加热至60～80℃进行回流反应。