CN104830944B - 一种酯酶拆分(±)‑扁桃酸甲酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酯酶拆分(±)‑扁桃酸甲酯的方法。它是在酯酶EST04211存在的情况下，对(±)‑扁桃酸甲酯进行水解，酯酶EST04211催化S‑扁桃酸甲酯生成S‑扁桃酸，然后再对R‑扁桃酸甲酯和S‑扁桃酸进行分离，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明与传统的化学拆分相比，具有反应条件温和、无污染、对映体过量值高的优点；与目前报道的酶法催化拆分相比，所用酯酶EST04211优先水解S构型的扁桃酸甲酯得到光学纯的R‑扁桃酸甲酯和S‑扁桃酸，立体选择性强。所得产品可以简单加以纯化后用于相应药物的合成。
Description
技术领域：
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法。
背景技术：
扁桃酸及其衍生物的对映体是一类非常重要的药物中间体，被广泛应用于多种药物的合成，如青霉素、头孢菌素、环扁桃酯、抗肿瘤制剂、辅酶A等。光学纯扁桃酸系列化合物传统制备工艺为化学合成外消旋产物后再进行手性化学拆分，此方法试剂昂贵，污染环境，且纯度不高。生物催化法制备手性化合物是一类集生物技术与化学工程于一体的新兴方法，该方法具有效率高、选择性强、环境友好等优点，是近年来科研人员研究的重点和热点。其中，生物催化法制备光学纯扁桃酸系列化合物基于所涉及催化剂种类的不同又可以细分为3种：1)依赖于氧化还原酶体系催化法，2)腈水解酶催化法，3)酯酶/脂肪酶催化法。Tsuchiya等利用氧化还原酶体系将外消旋的扁桃酸转化成单一异构体的R-扁桃酸，产率达到75％，对映体过量值大于99％。李忠琴等人利用酵母菌的突变株转化苯乙酮和苯乙酮酸甲酯得到相应的R构型酸和酯，产率大于90％，对映体过量值均大于99％。其次，Yamamoto和Banerjee等人分别利用腈水解酶催化外消旋扁桃腈，均获得较高的产率和对映体过量值的R-扁桃酸。再有，Kim等人利用Pseudomonas sp.细胞拆分(±)-扁桃酸，获得对映体过量值为99.4％的R-扁桃酸。这些例子均体现生物催化法具有转化效率高、立体选择性强的特点。其中，酯酶/脂肪酶是一类酯键水解酶，它可在油水界面催化长链甘油三酸酯水解形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸；而它在非水介质中又能催化酸的羧基与醇的羟基进行脱水缩合反应产生酯类化合物，如此独特的性质使其在多种反应(水解反应、酯化反应、醇解反应、酸解反应等)中具有广泛的应用，并且备受关注。
然而，目前报道的这些酶类大部分是优先作用R构型，通过水解或者转化得到R-扁桃酸，因此，有必要寻找和开发优先作用S构型的酶类，以制备S-扁桃酸和R构型的扁桃酸系列化合物，进而研究相应的作用机理。
发明内容：
本发明的目的是提供一种酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法，利用该方法能够拆分(±)-扁桃酸甲酯制备R-扁桃酸甲酯，其具有操作简单，对环境友好，耗时少，产物得率高，单一对映体光学纯度高的优点。
本发明的酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法，其特征在于，在酯酶EST04211存在的情况下，对(±)-扁桃酸甲酯进行水解，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃酸，然后再将R-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸进行分离，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
所述的酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法，具体步骤优选如下：
称取(±)-扁桃酸甲酯加入到反应器中，再加入pH为6～10的反应缓冲液和酯酶EST04211形成反应体系，在30～40℃下，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃酸，然后用疏水性溶剂进行萃取，从疏水性溶剂中得到R-扁桃酸甲酯。按照此方法进行拆分，R-扁桃酸甲酯的对映体过量值为>90％，最高达到99.9％以上，产率最高接近90％。
进一步优选，在反应体系中，反应缓冲液的pH值为6～7，(±)-扁桃酸甲酯的初始反应浓度为5～40mM，酯酶EST04211用量为20μg/ml，反应时间为1～2小时。
所述的疏水性溶剂优选为乙酸乙酯。
本发明还提供了酯酶EST04211在拆分(±)-扁桃酸甲酯获得R-扁桃酸甲酯中的应用，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的(±)-扁桃酸甲酯是指R-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸甲酯的混合物。
本发明与传统的化学拆分相比，具有反应条件温和、无污染、对映体过量值高的优点；与目前报道的酶法催化拆分相比，所用酯酶EST04211优先水解S构型的扁桃酸甲酯得到光学纯的R-扁桃酸甲酯，立体选择性强。所得产品可以简单加以纯化后用于相应药物的合成。
附图说明：
图1是酯酶EST04211催化(±)-扁桃酸甲酯水解的过程方程式；
图2是酯酶EST04211催化(±)-扁桃酸甲酯水解得到R-扁桃酸甲酯的GC分析图，图2A是(±)-扁桃酸甲酯的GC分析图，图2B是R-扁桃酸甲酯标样的GC分析图，图2C是S-扁桃酸甲酯标样的GC分析图，图2D是乙酸乙酯相中的GC分析图，乙酸乙酯相中只含有R-扁桃酸甲酯，而不含有S-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本发明的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.1所示，该酯酶EST04211公开于专利申请号为：201410333182.4，发明名称为：一种新的酯酶及其编码基因和应用，公开号为：CN104140959A的专利申请中，酯酶EST04211的制备方法见于该专利中，由此能够获得酯酶EST04211。
实施例1：
1、不同温度中酯酶EST04211水解拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响分析，酯酶EST04211催化(±)-扁桃酸甲酯水解的过程方程式如图1所示。
用100mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH＝8.0)配制一定量终浓度为10mM的(±)-扁桃酸甲酯，按1ml每管的体积分装到10个EP管中，其中5个加入20μg酯酶EST04211后分别置于10℃、20℃、30℃、40℃和50℃的恒温装置下反应，反应1h和2h后各分别取出500μl反应样品并加入终浓度为5mM的十二烷作为内标物，然后加入500μl乙酸乙酯进行萃取，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃酸，S-扁桃酸进入水相，乙酸乙酯相中得到R-扁桃酸甲酯(图2所示，通过GC分析，乙酸乙酯相中只存在R-扁桃酸甲酯，而不含有S-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸，乙酸乙酯相中的R-扁桃酸甲酯可以通过蒸馏的方法去除乙酸乙酯，而留下R-扁桃酸甲酯，如减压浓缩去除乙酸乙酯，获得R-扁桃酸甲酯)，乙酸乙酯相用气相色谱进行检测。与此同时，另外5个EP管不加任何酶也分别置于10℃、20℃、30℃、40℃和50℃的恒温装置下作为对照实验。
气相色谱仪为福立GC-9790Ⅱ，配备氢火焰离子化检测器，以氮气为载气。手性色谱柱为安捷伦产品112-6632CYCLOSIL-B(30m×0.25mmID,0.25μm df)，进样器和检测器温度分别为250℃和280℃，升温程序为：先60℃保持1分钟，然每分钟升温15℃至120℃保持1分钟，再每分钟升温10℃至200℃保持1分钟。对映体过量值(e.e％)和得率(Y％)按照下列公式计算：
A0和A分别为反应前后检测得到的R-扁桃酸甲酯的含量。(检测方法以下实施例同)
R-扁桃酸甲酯的对映体过量值(e.e％)和得率(Y％)如表1所示：
表1
从表1可以看出，酯酶EST04211水解拆分(±)-扁桃酸甲酯的最适温度为40℃，当反应1h时，R-扁桃酸甲酯的对映体过量值(e.e％)已经达到98.6％，反应2h时>99.9％，并且产率在60％以上，而当反应温度高于40℃或者低于30℃时，R-扁桃酸甲酯的e.e％均达不到90％。
2、不同pH缓冲液中酯酶EST04211水解拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响分析
用不同pH值的缓冲液配制一定量终浓度为10mM的(±)-扁桃酸甲酯(100mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液pH分别为6.0、7.0和8.0；100mM的TriS-HCl缓冲液pH分别为8.0、9.0和10.0)。每种pH按1ml每管的体积分装到2个EP管中，其中一个加入20μg酯酶EST04211后置于40℃的恒温装置下反应，另外一个不加酶做对照，反应1h和2h后各分别取出500μl反应样品并加入终浓度为5mM的十二烷作为内标物，然后加入500μl乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯相中得到R-扁桃酸甲酯，乙酸乙酯相用气相色谱进行检测。
R-扁桃酸甲酯的对映体过量值(e.e％)和得率(Y％)如表2所示：
表2
a为100mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液
b为100mM的TriS-HCl缓冲液
从表2可以看出，在不同pH值的缓冲液条件下，酯酶EST04211水解拆分(±)-扁桃酸甲酯2h均获得e.e％>99.9％的R-扁桃酸甲酯，然而对R-扁桃酸甲酯的产率却影响比较大，当pH值≤7.0时，得率Y％接近90％，而当pH≥8.0时，得率Y％迅速下降。所以酯酶EST04211水解拆分(±)-扁桃酸甲酯的最适缓冲液为pH＝6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
3、底物(±)-扁桃酸甲酯的不同浓度对酯酶EST04211光学拆分的影响分析
用pH值等于6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制一定量终浓度分别为5mM、10mM、20mM、40mM、60mM和80mM的(±)-扁桃酸甲酯，按1ml每管的体积分别分装到12个EP管中，其中6个加入20μg酯酶EST04211后置于40℃的恒温装置下反应，其余6管做相应的对照实验，反应1h和2h后各分别取出500μl反应样品并加入终浓度为5mM的十二烷作为内标物，然后加入500μl乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯相中得到R-扁桃酸甲酯，乙酸乙酯相用气相色谱进行检测。
R-扁桃酸甲酯的对映体过量值(e.e％)和得率(Y％)如表3所示：
表3
从表3可以看出，当底物浓度为5～40mM时，酯酶EST04211水解拆分(±)-扁桃酸甲酯可得到对映体过量值(e.e％)>95％的R-扁桃酸甲酯，而当底物浓度大于40mM时，R-扁桃酸甲酯的e.e值明显下降。
以上所述实施方式是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明，所述内容属于本发明的主要内容，但并不仅仅限于这些内容。有些可以显而易见地扩展的内容虽然并未在说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。
Claims (5)
1.一种酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法，其特征在于，在酯酶EST04211存在的情况下，对(±)-扁桃酸甲酯进行水解，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃酸，然后再对R-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸进行分离，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法，具体步骤如下：
称取(±)-扁桃酸甲酯加入到反应器中，再加入pH为6～10的反应缓冲液和酯酶EST04211形成反应体系，在30～40℃下，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃酸，然后用疏水性溶剂进行萃取，从疏水性溶剂中得到R-扁桃酸甲酯。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在反应体系中，反应缓冲液的pH值为6～7，(±)-扁桃酸甲酯的初始反应浓度为5～40mM，酯酶EST04211用量为20μg/ml，反应时间为1～2小时。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的疏水性溶剂为乙酸乙酯。
5.酯酶EST04211在拆分(±)-扁桃酸甲酯获得R-扁桃酸甲酯中的应用，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
Priority Applications (1)
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