CN109868293A - 一种酶催化酯交换动力学拆分2-氯扁桃酸对映体的方法 - Google Patents

Abstract

本专利介绍了一种采用生物催化剂催化酯交换动力学拆分2‑氯扁桃酸对映体的方法。利用脂肪酶的高催化效率和高立体选择性，在有机溶剂介质中催化酯交换动力学拆分外消旋2‑氯扁桃酸，制备(S)‑2‑氯扁桃酸和(R)‑乙酰基‑2‑氯扁桃酸。该反应体系采用有机溶剂作为反应介质，很大程度的改善了脂肪酶的热稳定性和催化效率，大大提高了底物转化率和光学活性，其底物的光学活性≥98.15%。与其他拆分技术相比，该方法反应条件温和，操作简单，对环境污染小，且能获得较高光学纯度的(S)‑2‑氯扁桃酸和(R)‑乙酰基‑2‑氯扁桃酸，其作为合成应用前途较高的手性拆分剂和氯吡格雷的关键中间体的前体，本专利提供了一种可行的获得方法。

Description

一种酶催化酯交换动力学拆分2-氯扁桃酸对映体的方法

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，利用生物催化法制备手性化合物。特别涉及一种应用lipase AK（荧光假单胞菌脂肪酶）立体选择性催化酯交换动力学拆分2-氯扁桃酸对映体的方法。

背景技术

2-氯扁桃酸属于羟基酸类药物中间体。光学纯(R)-2-氯扁桃酸((R)-2-ClMA)是合成氯吡格雷的重要中间体，氯吡格雷是一种广泛使用的抗凝剂，可以降低急性冠状动脉综合征患者心血管衰竭的风险。与具有相同药效的阿司匹林比较，阿司匹林可直接对胃黏膜造成损害，并可抑制前列腺素的合成，进而破坏胃黏膜屏障，导致氢离子回渗，引起胃黏膜损伤。而氯吡格雷对胃黏膜只有轻微的刺激性，也不会抑制前列腺素的合成。因此，氯呲格雷所引起的胃肠道反应大多较短暂、可以被患者耐受，引发上消化道出血的几率明显低于阿司匹林。氯吡格雷是阿司匹林过敏或者不耐受的替代品，并且在有效性和对外周血管疾病的治疗上优于阿司匹林。随着氯吡格雷、邻氯扁桃酸及其衍生物用途的进一步开发，邻氯扁桃酸的单一对映体的需求日益增加，但受到传统工艺限制，市场需求难以满足。

目前，制备单一对映体2-氯扁桃酸的主要方法有化学合成法和外消旋体拆分法。文献中已报道的方法包括以下几种：(1)直接利用不对称合成的方法制备光学纯的(R)-2-氯扁桃酸；(2)利用液-液萃取获得光学纯的2-氯扁桃酸对映体；(3)色谱法分离制备。其中，不对称合成法副产物多，分离难度大，并且纯度较低，产率不高；色谱法的拆分纯度高，但生产成本高，只适用于实验使用的小规模制备；液-液萃取法容易实现连续生产、易于工业放大、操作简单、生产成本低、适用范围广等，目前在工业生产中受到广泛关注，但是在实际应用过程中存在手性萃取剂选择性低，成本高的问题。相比于上述拆分方法，酶催化反应可直接将化学合成的外消旋体转化为单一对映体。酶催化酯交换拆分具有条件温和，选择性高，副反应少，杂质成分少，产率高，反应操作简单等优点，并且污染少，很大程度降低了化工生产对环境造成的影响，符合绿色化学理念，具有很好的发展前景。

本发明利用脂肪酶较高的催化活性和立体选择性，在有机溶剂体系中催化酯交换动力学拆分外消旋体2-氯扁桃酸，制备高光学活性的(S)-氯扁桃酸和(R)-乙酰基-2-氯扁桃酸。由于脂肪酶在有机溶剂中具有极高的热稳定性和较高的催化活性，并且不同有机溶剂可以影响脂肪酶的活性和和立体选择性，故本方法根据脂肪酶的催化活性和立体选择性，对其有机溶剂的种类进行了筛选。与水溶液体系比较，酶与有机介质不相溶，易于回收重复利用；可以更加方便从有机溶剂中分离得到产物，显著降低生产成本。该技术解决了一般拆分技术所存在的低光学纯度和产率低的问题，同时该方法反应条件温和、绿色环保、操作简便。

发明内容

本发明提出了一种利用荧光假单胞菌脂肪酶催化酯交换动力学拆分2-氯扁桃酸对映体的方法。通过对其反应条件进行优化，获得最佳的反应参数，得到较高的产率和纯度。并针对脂肪酶在水相介质中热稳定性和立体选择性低，导致反应时间长和转化率较低的问题，通过改用有机介质体系，提高脂肪酶热稳定性和催化活性，从而提高转化率和光学活性。

本发明的技术方案：本发明以有机溶剂作为反应介质，以外消旋2-氯扁桃酸和乙酸乙烯酯作为反应底物，将其底物溶解在有机溶剂中，2-氯扁桃酸酸对映体浓度为50 mmol/L，乙酸乙烯酯浓度为100-600 mmol/L；加入一定量的脂肪酶作为生物催化剂，脂肪酶的浓度为10-50 mg/mL；在温度范围20-70 ℃下，于25 mL的封闭反应管体系中搅拌、加热反应一定时间，反应结束后，取一定量的样品通过高效液相色谱仪对产物进行定性和定量检测，并计算底物转化率和对映体过剩量。

所述有机溶剂选自甲苯、1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、异丙醚、甲基叔丁基醚、四氢呋喃、丙酮和乙腈。

所述脂肪酶选自lipase AYS (褶皱假丝酵母脂肪酶)、Novocor ADL (南极假丝酵母脂肪酶A)、Novozym435(固定化南极假丝酵母脂肪酶B)、lipase AK(荧光假单胞菌脂肪酶)、lipase PS (洋葱假单胞菌脂肪酶)、Novozym 40086(固定化米曲霉脂肪酶)、LipozymeTL(固定化疏棉状嗜热胞菌脂肪酶)、 Lipozyme RM (固定化米黑根毛脂肪酶、Porcinepancreatic lipase(猪胰脂肪酶)。

本发明相比现有技术有如下优势：

本发明利用脂肪酶作为反应催化剂，可以提高底物立体选择性，减少副产物的生成，获得高产率和高纯度的目标产物。采用烯醇酯作为酰基供体，可以消除逆反应带来的平衡障碍，提高转化率。采用有机溶剂作为有机介质，可以改善脂肪酶的热稳定性和催化效率，从而提高产品的纯度和产率。本发明采用脂肪酶对2-氯扁桃酸对映体进行动力学拆分，通过控制脂肪酶种类、有机溶剂种类、水含量、反应温度、底物浓度比、酶用量、反应时间等条件，可提高（R）-对映体的转化率和底物的对映体过剩量。本方法实施操作简便，绿色环保，产物易于分离，催化剂重复使用率高。

【具体实施方案】

本发明具体的方法步骤如下：

一、测试与分析

本发明所述实施例中产物的光学纯度和底物转化率采用美国Waters 1525高效液相色谱仪分析，Daicel Chiralcel OJ-RH 手性柱 (150 mm × 4.6 mm I.D.)。流动相组成为V(无水乙醇)：V(水)=23:77，其中水相用磷酸调节pH 至3.0。流速为0.6 mL/min，UV检测波长为225 nm，柱温为25.0 ℃，进样量10 μL。

二、实施例

实施例1

将1.25 mmol的外消旋2-氯扁桃酸对映体和7.5 mmol乙酸乙烯酯加入到25 mL容量瓶中，并加入甲基叔丁基醚定容，制得反应液。在一系列的反应管中加入50 mg不同商品化脂肪酶和0.10%磷酸缓冲液，再分别加入2 mL反应液，在500 rpm、50 ℃下加热反应24 h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和底物的对映体过剩量进行分析。分析结果表明：荧光假单胞菌脂肪酶优先识别(R)-2-氯扁桃酸，其(R)-2-氯扁桃酸的转化率为99.26%，底物的对映体过剩量为98.48%。

实施例2

在25 mL 容量瓶中，加入1.25 mmol的外消旋2-氯扁桃酸对映体和6.25 mmol乙酸乙烯酯，再加入甲基叔丁基醚定容。在反应管中，依次加入50 mg荧光假单胞菌脂肪酶和水含量为0.10% (v/v)的磷酸缓冲液，再加入2 mL反应液，在500 rpm、50 ℃条件下反应 24 h。反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和底物对映体过剩量进行分析。分析结果表明：(R)-2-氯扁桃酸的转化率为97.94 %，底物的对映体过剩量为95.98%。

实施例3

在25 mL 容量瓶中，加入1.25 mmol的外消旋2-氯扁桃酸对映体和7.50 mmol乙酸乙烯酯，再加入甲基叔丁基醚定容。在反应管中依次加入50 mg荧光假单胞菌脂肪酶和水含量为0.10% (v/v)的磷酸缓冲液，再加入2 mL反应液，在45℃、500 rpm下反应 24 h。反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和底物对映体过剩量进行分析。分析结果表明：(R)-2-氯扁桃酸的转化率为99.24 %，底物的对映体过剩量为 98.43%。

实施例4

在25 mL容量瓶中，分别加入1.25 mmol 2-氯扁桃酸对映体和7.50 mmol 乙酸乙烯酯，用甲基叔丁基醚定容。在反应管中，依次加入40 mg荧光假单胞菌脂肪酶和0.10%磷酸缓冲液，再加入2 mL反应，在500 rpm、50 ℃条件下反应24 h。反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和底物的对映体过剩量进行分析。分析结果表明：(R)-2-氯扁桃酸的转化率为92.72%，底物的对映体过剩量为86.25 %。

以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但其技术范围不受限于以上实施方式。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以做各种改进并实施，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种应用具有高催化活性和立体选择性的脂肪酶催化酯交换动力学拆分2-氯扁桃酸对映体的方法，其特征在于所述的方法是以外消旋2-氯扁桃酸酸和烯醇酯为底物，在有机溶剂体系中通过脂肪酶的立体选择性催化酯交换作用得到(R)-乙酰基-2-氯扁桃酸和(S)-2-氯扁桃酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包含下述操作步骤：选择一种有机溶剂作为反应介质，加入一定量的外消旋2-氯扁桃酸酸和烯醇酯，再向反应管中投加一定量的脂肪酶作为生物催化剂和一定量的磷酸缓冲液，在一定的温度下搅拌反应一定时间，反应结束后，取一定体积的反应液烘干并稀释反应液，取样进行检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲苯、1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、异丙醚、甲基叔丁基醚、四氢呋喃、丙酮和乙腈。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶选自lipase AYS （褶皱假丝酵母脂肪酶）、Novocor ADL （南极假丝酵母脂肪酶A）、Novozym435（固定化南极假丝酵母脂肪酶B）、lipase AK（荧光假单胞菌脂肪酶）、lipase PS （洋葱假单胞菌脂肪酶）、Novozym40086（固定化米曲霉脂肪酶）、Lipozyme TL（固定化疏棉状嗜热胞菌脂肪酶）、 LipozymeRM （固定化米黑根毛脂肪酶）、Porcine pancreatic lipase（猪胰脂肪酶）。

5.根据权利要根据权利要求2所述的方法，其特征在于，水(磷酸缓冲液)含量为0-0.50% (v/v)。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，反应温度为40℃-65℃。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，外消旋的2-氯扁桃酸酸浓度为50 mmol/L，乙酸乙烯酯浓度为200-500 mmol/L。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对于2mL反应介质，脂肪酶的用量为20-80mg。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，酯化反应的时间为1-28 h。