CN108913643A - 一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法 - Google Patents

一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法。本发明将植物甾醇代谢途径中甾醇C27位单加氧酶Cyp125引入到甾体转化微生物中，以提高重组微生物在发酵系统中雄烯二酮的转化效率，为解决菌体植物甾醇代谢缓慢提供了新方法。Cyp125的过表达促进分枝杆菌甾醇C27单加氧酶比酶活提高了22.2％，提高了胞内NAD+的再生，使胞内NAD+/NADH比例提高131％，同时意外的发现该酶的过表达使菌体生物量提高18.7％，最终达到使转化周期缩短24h，AD(D)产量提高10.0％的效果。

Description

一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法
技术领域：
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法。
背景技术：
雄烯二酮，雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)，是生产可的松、盐皮质激素类药物、常规口服避孕药和蛋白同化激素等其他甾体激素类药物的重要中间体，可以通过微生物降解植物甾醇侧链获得。植物甾醇代谢生成AD(D)的代谢途径复杂，不仅受自身代谢途径的影响也受胞内辅酶的调控。目前基于植物甾醇代谢途径分析提高AD(D)生产的策略主要包括：1、植物甾醇代谢途径中关键酶的改造；2、对植物甾醇代谢途径依赖的辅酶再生系统进行调控。
关于植物甾醇代谢途径中酶的改造，主要集中于通过过表达或敲除植物甾醇氧化途径中的酶来提高AD(D)生产效率及产量。例如过表达胆固醇氧化酶及3β-羟基甾体脱氢酶等，或失活3-酮甾体-9α-羟化酶以及3-酮甾体-1-脱氢酶。研究结果显示敲除某基因以后，会在不同程度上降低植物甾醇的转化率和产率，即造成菌体整体生产强度的下降。因此还需要从菌体整体代谢调控方面深入探索、系统研究，以寻求提高雄烯二酮生产效率的方法。植物甾醇代谢途径中许多关键酶属于辅酶依赖型酶，辅因子依赖的代谢途径不仅受代谢途径中酶的控制，而且还受辅因子浓度及辅因子氧化还原态比例的控制。前期研究通过调控微生物中辅酶再生系统来促进AD(D)生产效率，通过过表达NADH氧化酶促进胞内NAD+的再生，结果表明AD(D)的生成量有所提高，但是菌体生长受到了明显的抑制，使AD(D)的生产周期延长(Su LQ,Shen YB,Zhang WK,Gao T,Shang ZH,Wang M(2017)Cofactor engineeringto regulate NAD+/NADH ratio with its application to phytosterolsbiotransformation.Microb Cell Fact 16(1):182-192)。
微生物甾醇或胆固醇侧链降解开始于C27位羟基化进而氧化为C27位羧酸，甾醇C27单加氧酶(Cyp125)属于细胞色素P450酶，依赖NADH为辅酶催化甾醇侧链末端C进行连续的氧化反应，起始甾醇侧链降解途径。
发明内容：
为了解决上述问题，探索一种提高分枝杆菌AD(D)生产效率的方法，对植物甾醇代谢途径及调控途径综合考虑是有必要的。植物甾醇代谢途径中甾醇C27位单加氧酶Cyp125是依赖还原型辅酶NADH的酶，属于植物甾醇侧链降解途径初始酶，本发明将其引入到甾体转化微生物中，以提高重组微生物在发酵系统中雄烯二酮的转化效率，为解决菌体植物甾醇代谢缓慢提供了新方法。
本发明实现上述目的的技术方案如下：一种产雄烯二酮的基因工程菌，是以新金分枝杆菌为宿主细胞，过表达甾醇C27单加氧酶基因cyp125-3获得的；
所述cyp125-3的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述宿主细胞为新金分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3，该菌株可从中国工业微生物菌种保藏管理中心(简称CICC)购买获得，编号CICC 21097；
优选地，表达载体为质粒pMV306；
所述以CICC 21097为宿主细胞，以质粒pMV306为表达载体过表达甾醇C27单加氧酶基因cyp125-3获得的基因工程菌命名为MNR M3C3。
所述产雄烯二酮的基因工程菌的构建方法，具体如下：
(1)将cyp125-3基因(SEQ ID NO.1)和质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-cyp125-3重组质粒；
(2)将重组质粒pMV261-cyp125-3及质粒pMV306进行酶切，回收pMV261-cyp125-3中的启动子和目的基因片段，与酶切后的pMV306连接，构建pMV306-cyp125-3重组质粒；
(3)将重组质粒pMV306-cyp125-3导入新金分枝杆菌的感受态细胞中，获得的阳性转化子即为本发明新构建的基因工程菌株；
优选地，所述新金分枝杆菌为CICC 21097，所述产雄烯二酮的基因工程菌为MNRM3C3。
本发明提供的技术方案之二，是利用上述构建的MNR M3C3菌株发酵生产雄烯二酮的方法，具体如下：
将MNR M3C3经种子培养后，按5-10％(v/v)的接种量接种入发酵培养基中，28-32℃，130-250r/min，pH6.5-7.8条件下，发酵4-6天；
所述发酵培养基组成如下：K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，羟丙基β-环糊精25mM，植物甾醇3g/L，其余为水，pH6.5-7.8；
发酵4-6天后，AD(D)产量达到1.82-1.98g/L，转化率可以达到100％。
有益效果：
本发明利用过表达甾醇C27位单加氧酶Cyp125,促进分枝杆菌甾醇C27单加氧酶比酶活提高了22.2％左右，提高了胞内NAD+的再生，使胞内NAD+/NADH比例提高131％，同时意外的发现该酶的过表达使菌体生物量提高18.7％，最终达到使转化周期由120h缩短至96h，AD(D)产量提高10.0％的效果。
附图说明：
图1cyp125-3基因扩增电泳图；M：DL5000 DNA Marker；1，2：cyp125-3基因扩增条带。
图2阳性转化子MNR M3C3菌液PCR验证图；M：DL5000 DNA Marker；1，2：阳性转化子MNR M3C3菌液PCR扩增条带。
图3原始菌株MNR M3及重组菌株MNR M3C3生长(a)，NAD+(b)，NADH(c)，NAD+/NADH(d)变化曲线图。
图4原始菌株MNR M3及重组菌株MNR M3C3AD(D)生成(a)及底物消耗过程图(b)。
图5阳性转化子pMV261-cyp125-3质粒双酶切验证图；M：DL5000 DNA Marker；1，2：阳性转化子pMV261-cyp125-3质粒双酶切条带。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
实施例1重组菌株MNR M3C3的构建
1、构建pMV306-cyp125-3质粒，其过程包括：
(1)合成目的基因，根据分枝杆菌M3甾醇C27位单加氧酶基因cyp125-3的核苷酸序列(SEQ ID NO.1),将酶切位点(BamH I及Hind III)添加于cyp125-3序列的两端，将所设计的序列交由金唯智公司进行基因合成；
(2)PCR扩增目的基因片段cyp125-3基因(验证图为图1)，目的片段cyp125-3及质粒pMV261分别用BamHI和Hind III双酶切，纯化，连接获得重组质粒pMV261-cyp125-3。
(3)将重组质粒pMV261-cyp125-3及表达质粒pMV306用XbaΙ和Hind III进行双酶切，胶回收pMV261-cyp125-3中启动子和目的基因片段，与酶切后的pMV306连接获得重组质粒pMV306-cyp125-3。
2、构建菌株MNR M3C3：
(1)分枝杆菌MNR M3感受态细胞制备：一级种子培养至OD600为1.0左右,按10％接种量转接到种子培养基中进行二级种子培养；24h后加入2％甘氨酸继续培养24h。离心收集菌体，分四次用10％预冷甘油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入甘油悬浮菌体，并分装保存；
种子培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，其余为水，pH7.2；
(2)电转化：10μL步骤1所得重组质粒加入100μL感受态菌体中放置10min，电击条件如下：1.5KV条件下电转两次，每次4-5ms；
(3)重组子筛选与验证：电转产物加入种子培养基复苏培养3-5h后，涂布于含有卡那霉素(50mg/L)种子培养基平板上，30℃静置培养7d，挑取单菌落至液体种子培养基培养，利用引物pMV–f及cyp125-3-r进行菌液PCR验证(验证图为图2)，菌液PCR出现1500bp大小的PCR条带，菌液PCR验证正确的阳性转化子即为重组菌MNR M3C3。
pMV-f：TAGGCGAGTGCTAAGAATAACGTTG；
cyp125-3-r：CCCAAGCTTCTAGCTCGAGGCGCCGGC。
实施例2重组菌MNR M3C3中NAD(H)含量及NAD+/NADH比例的比较。
1、菌种活化培养：
将重组菌MNR M3C3及原始菌MNR M3转接于新鲜斜面培养基上，29℃培养2-4d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种得洗脱液,吸取1mL洗脱液加入到30mL种子培养基中，在29℃，200r/min条件下摇床培养36h得种子液；
斜面培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.2；
种子培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，其余为水，pH7.2。
2、菌种酶活及辅酶测定
按7％的接种量，将种子液接种至含有发酵培养基的250mL挡板瓶中，在30℃，150r/min条件下进行培养96小时得发酵液。
发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，羟丙基β-环糊精25mM，植物甾醇3g/L，其余为水，pH7.2。
(1)甾醇C27单加氧酶酶活测定：
收集发酵液菌体细胞进行超声破碎，4℃，12000r/min离心30min，取上清液即为粗酶液。
酶促反应体系：60μL 150μmol/L的4-胆甾烯-3-酮，300μL磷酸盐缓冲液(50mmol/LpH7.2)，200μL 1U/mL的黄素氧化还原蛋白还原酶，20μL 50μmol/L的黄素氧化还原蛋白，400μL粗酶液，20μL 10mmol/L的NADPH。加入NADPH启动反应，采用分光光度法测量340nm处NADPH的吸光值变化。
酶活单位的定义为：30℃和pH 7.5的条件下，1min内转化1mmol的NADPH所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。根据酶活定义得到酶活计算公式(U/mL)＝(Vt×ΔA÷Δt)÷(e×L×Vs)，其中Vt为反应液总体积(本文中为1mL)；Vs为待测样品体积；e为摩尔吸光系数；L为比色杯光径(cm)。
比酶活单位：U/mg，蛋白浓度通过Bradford法来测定。
(2)胞内NAD(H)的测量：
①辅因子的提取：
NADH的提取：800μL发酵液里加入400μL预冷的0.3mol/L KOH，留在冰上10min，30℃水浴10min后放回冰上，逐滴加入0.3mol/L HCl中和pH在7.5-8.0间，放置冰上10min，4℃，12000r/min，离心10min，上清液待测。
NAD+的提取：800μL发酵液里加入400μL预冷的0.3mol/L HCl，留在冰上10min，50℃水浴10min后放回冰上，逐滴加入0.3mol/L KOH中和pH在7.2-7.4间，放置冰上10min，4℃，12000r/min，离心10min，上清液待测。
②测定及分析方法：
采用酶循环法，向96孔板中加入270μL辅因子循环液(组成为：16.3g/L Bicinebuffer,1.52g/L EDTA,11.2g/L PES,0.17g/L MTT,10％乙醇)，30μL步骤①所述上清液(NADH提取上清液或NAD+提取上清液)，10μL乙醇脱氢酶(250U/mL)引发反应，用酶标仪测定反应液在570nm吸光度随时间的变化曲线，求得酶促反应速率；酶反应速率与辅因子浓度呈线性关系，据此，通过与标准品的反应速率进行对比，能够准确测得样品中辅因子浓度。
3、结果比较
如表1所示，重组分枝杆菌MNR M3C3与原始菌株相比甾醇C27单加氧酶比酶活提高22.2％。胞内NAD+及NADH含量随着发酵进行不断变化(图3b，c，d所示)，MNR M3C3与原始菌相比，胞内NADH含量降低，NAD+/NADH比例提高。发酵72h，MNR M3C3中NAD+/NADH比例与原始菌相比提高16.5％，发酵96h，MNR M3C3中NAD+/NADH比例与原始菌相比提高131％。
表1 72h胞内甾醇C27单加氧酶酶活及NAD(H)含量测定
实施例3重组菌株生长比较
1、菌种活化培养:
将重组菌MNR M3C3及原始菌MNR M3分别转接于新鲜斜面培养基上，29℃培养3d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种，混合均匀得洗脱液，吸取1mL洗脱液加入到30mL种子培养基中，在29℃，200r/min条件下摇床培养36h得种子培养液；
斜面培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.2；
种子培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，其余为水，pH7.2。
2、植物甾醇微生物转化：
将步骤1中活化的种子培养液以7％的接种量转接于含有发酵培养基的250mL挡板瓶中，在29℃，150r/min条件下摇床培养120h；
发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，羟丙基β-环糊精25mM，植物甾醇3g/L，其余为水，pH 7.2。
3、分枝杆菌生长性能检测：
(1)无植物甾醇添加
对分枝杆菌进行活化及种子培养，当菌株生长到对数生长期时，按7％的接种量转接至装有50mL不含3g/L植物甾醇的发酵培养基(步骤2所述)中，每隔12h取样测定吸光度600nm处的吸光值，绘制生长曲线。
(2)含植物甾醇添加
对分枝杆菌进行活化及种子培养，当菌株生长到对数生长期时，按7％的接种量转接至装有50mL含3g/L植物甾醇的发酵培养基(步骤2所述)中，由于底物难溶，不能直接测定OD600，采用碱处理法测定分枝杆菌总蛋白含量。具体操作如下：
取1mL菌液，12000r/min离心2min，去除上清液；向收集的菌体中加入200μL浓度为1mol/L的NaOH溶液，将菌体吹吸混匀；沸水浴处理10min；待其冷却至室温，向其中加入40μL浓度为5mol/L的HCl，混匀；向其中加入1.76mL浓度为20mmol/L的PBS缓冲液，12000r/min离心10min；取上清稀释到适当浓度，测定样品在230nm和260nm处的吸光值，使蛋白浓度数值应落在6-225μg/mL之间。
将测得的吸光值带入以下公式，计算出总蛋白浓度；
Cpr(μg/mL)＝n×[(183×A230)-(75.8×A260)]；
其中，A230：230nm处的吸光值；A260：260nm处的吸光值；n：稀释倍数；将样品所得总蛋白浓度带入以下公式，计算细胞干重：
细胞干重(mg/mL)＝2.10×Cpr(mg/mL)-0.17(R2＝0.99)。
4、结果比较：
如图3a所示，无植物甾醇情况下，生长36-48h，原始菌株的最高生长速率为0.208/h，工程菌株MNR M3C3最高生长速率为0.278/h，是原始菌株的1.34倍；生长至96h，原始菌的最终OD600值为7.51，工程菌株MNR M3C3最终OD600值为9.32，是原始菌株的1.24倍。表明，在无植物甾醇存在下，重组菌MNR M3C3甾醇C27单加氧酶的表达促进分枝杆菌的生长。
如表2所示，植物甾醇存在下，生物转化96h后，工程菌株MNR M3C3最终生物量为2.434g/L，是原始菌株的1.19倍。表明，在植物甾醇转化过程中，工程菌甾醇C27单加氧酶氧化酶的表达促进分枝杆菌的生长。
表2植物甾醇存在下，菌体最终生物量
实施例4 MNR M3C3菌株催化植物甾醇生产雄烯二酮
1、菌种活化培养:
将重组菌MNR M3C3及原始菌MNR M3分别转接于新鲜斜面培养基上，29℃培养3d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种，混合均匀得洗脱液，吸取1mL洗脱液加入到30mL种子培养基中，在29℃，200r/min条件下摇床培养36h得种子培养液；
斜面培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.2；
种子培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，其余为水，pH7.2。
2、植物甾醇微生物转化：
将步骤1中活化的种子培养液以7％的接种量转接于装有发酵培养基的250mL挡板瓶中，在29℃，150r/min条件下摇床培养120h；
发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，羟丙基β-环糊精25mM，植物甾醇3g/L，其余为水，pH 7.2。
3、雄烯二酮摩尔生成率的检测：
用乙酸乙酯超声萃取发酵液，离心，取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL管中,自然风干后加1mL的流动相，溶解，离心后进行HPLC分析。色谱条件：C18柱,流动相为甲醇：水(4：1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。
4、结果比较：
如表3及图4所示，生物转化48h后，工程菌株MNR M3C3AD(D)生成量为1.10g/L，是原始菌株的1.41倍；72h后，工程菌株MNR M3C3AD(D)生成量为1.67g/L，是原始菌株的1.15倍；96h后，工程菌株MNR M3C3AD(D)生成量为1.98g/L，是原始菌株的1.18倍。120h后，工程菌株MNR M3C3AD(D)生成量为1.98g/L，是原始菌株的1.10倍。96h后，工程菌株MNR M3C3底物植物甾醇消耗率为96.7％，原始菌株MNR M3C3底物植物甾醇消耗率仅为84.5％。表明，工程菌甾醇C27单加氧酶的表达对分枝杆菌转化植物甾醇具有促进作用，使转化周期缩短24h，产物产量提高10％。
表3分枝杆菌转化过程中AD(D)产量(g/L)
实施例5 MNR M3C3菌株与MNR M3pMV261-cyp125-3菌株催化植物甾醇生产雄烯二酮比较
1、构建pMV261-cyp125-3质粒，其过程包括：
(1)合成目的基因，根据分枝杆菌M3甾醇C27位单加氧酶基因cyp125-3的核苷酸序列(SEQ ID NO.1),将酶切位点(BamH I及Hind III)添加于cyp125-3序列的两端，将所设计的序列交由金唯智公司进行基因合成；
(2)PCR扩增目的基因片段cyp125-3基因(验证图为图1)，目的片段cyp125-3及表达质粒pMV261分别用BamHI和Hind III双酶切，纯化，连接获得重组质粒pMV261-cyp125-3。
2、构建菌株MNR M3 pMV261-cyp125-3：
(1)分枝杆菌MNR M3感受态细胞制备同实施例1；
(2)将质粒pMV261-cyp125-3电转化至MNR M3感受态细胞，步骤同实施例1；
(3)重组子筛选与验证：电转产物加入种子培养基复苏培养3-5h后，涂布于含有卡那霉素(50mg/L)种子培养基平板上，30℃静置培养7d，挑取单菌落至液体种子培养基培养，提取质粒进行双酶切验证(验证图为图5)，双酶切理论出现4500bp与1300bp大小的两条带，酶切验证正确的阳性转化子即为重组菌MNR M3 pMV261-cyp125-3。
3、菌种活化培养同实施例3；
4、植物甾醇微生物转化同实施例3：
5、分枝杆菌生长性能检测同实施例3；
6、雄烯二酮摩尔生成率测定同实施例4：
7、结果比较：
如表4所示，植物甾醇存在下，生物转化96h后，工程菌株MNR M3C3最终生物量为2.434g/L，与原始菌株MNR M3相比提高18.7％；MNR M3 pMV261-cyp125-3最终生物量为1.905g/L，与原始菌株相比降低7.1％。表明，在植物甾醇转化过程中，含pMV306-cyp125-3重组载体的工程分枝杆菌的生长优于含pMV261-cyp125-3重组载体的工程菌的生长。
如表5所示，生物转化48h后，工程菌株MNR M3C3AD(D)生成量为1.10g/L，与原始菌株MNR M3相比提高41％，工程菌株MNR M3 pMV261-cyp125-3AD(D)生成量为0.58g/L，与原始菌株相比降低25.6％；72h后，工程菌株MNR M3C3AD(D)生成量为1.67g/L，与原始菌株相比提高15.2％，工程菌株MNR M3 pMV261-cyp125-3AD(D)生成量为1.36g/L，与原始菌株相比降低6.2％；96h后，工程菌株MNR M3C3AD(D)生成量为1.98g/L，与原始菌株相比提高17.9％，工程菌株MNR M3 pMV261-cyp125-3AD(D)生成量为1.58g/L，与原始菌株相比降低6.0％。120h后，工程菌株MNR M3C3AD(D)生成量为1.98g/L，与原始菌株相比提高10.0％，工程菌株MNR M3 pMV261-cyp125-3AD(D)生成量为1.83g/L，与原始菌株相比提高1.7％。表明，在植物甾醇转化过程中，含pMV306-cyp125-3重组载体的工程分枝杆菌的转化效率及转化率优于原始菌株MNR M3，但是含pMV261-cyp125-3重组载体的工程菌的转化效率低于原始菌株MNR M3，最终转化率与原始菌株相比并没有明显变化。
表4植物甾醇存在下，菌体最终生物量
表5分枝杆菌转化过程中AD(D)产量(g/L)
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法
<130> 1
<141> 2018-08-01
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
atgcccagcc ccaacctgcc caagggcttc gacccgctgg acgccagtct gaacctcgaa 60
cgcctgcccg tggaggagtt ggcggagatt cgccgcgccg agcccgtcca ctgggtggac 120
gtgccggaag ggaccggggg cttcggcgac aagggctact ggatcgtcac caagcatgcc 180
gacgtcaaag aggtctcgaa gcgaaacgac atcttcggca gctcacccga cggcgccatc 240
ccggtctggc cgcaggagat gacccgcgac gccatcgatc tgcagaaggc cgtcctgctc 300
aacatggacg cgccgcagca cacccggttg cgcaagatca tctcgcgcgg gttcaccccg 360
cgcgccatcg gacggctcga agacgagttg cgggcccgtg cccgcaagat cgccgaaacc 420
gcggcggcag ccggttcggg cgacttcgtc gagcaggtgt cctgcgaact gccgctgcag 480
gccatcgccg aactgctcgg tgtgccgcag gacgaccggg acaagatctt ccgctggtcc 540
aatgagatga ctgcgggcga ggaccccgag tacgccgatg tcgatccggc gatgtcctcc 600
ttcgagctca tcacctacgc catgaagatg gccgaggagc gggcgcagaa cccgaccgag 660
gacatcgtga ccaagctgat cgaggccgat atcgagggcg agaagctctc tgacgacgag 720
ttcggtttct tcgtggtcat gcttgccgtc gcaggcaacg agaccacccg caactcgatc 780
acccacggca tgatcgcctt cgccgacaat cccgaccagt gggagctcta caagaaggaa 840
cgcccgggca ccgccgccga cgagatcatc cgttgggcga caccggtgtc ggcgttccag 900
cgcacggcac tggaggacac cgagctcgcc ggggcgaaga tcaagaaggg cgatcgtgtg 960
gtgatgtcct accgcgccgc caacttcgac gacgaggcgt tcgacaaccc gcaccagttc 1020
aacatcctgc gtgatcccaa cccgcacgtc ggattcggtg gtaccggtgc gcactactgt 1080
atcggcgcaa acctggcccg catgaccatc aacctgatct tcaacgcgat cgccgacgtg 1140
atgcccgaca tcacaccgat cggcgagccg gagcggttga agtccggctg gctcaacgga 1200
atcaagcact ggcaggtcga ctacaccggc gcgggcgccg gcgcctcgag ctag 1254
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
taggcgagtg ctaagaataa cgttg 25
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
cccaagcttc tagctcgagg cgccggc 27

Claims (8)

1.甾醇C27单加氧酶基因cyp125-3在提高新金分枝杆菌中雄烯二酮产量中的应用，其特征在于，通过在新金分枝杆菌中过表达cyp125-3基因实现。
2.一种产雄烯二酮的基因工程菌，其特征在于，是以新金分枝杆菌为宿主细胞，过表达甾醇C27单加氧酶基因cyp125-3获得的。
3.权利要求2所述的一种产雄烯二酮的基因工程菌，其特征在于，所述新金分枝杆菌具体为新金分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3，编号CICC 21097。
4.权利要求2所述的一种产雄烯二酮的基因工程菌，其特征在于，表达载体为质粒pMV306。
5.权利要求2-4任意一项所述产雄烯二酮的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体如下：
(1)将cyp125-3基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-cyp125-3重组质粒；
(2)将重组质粒pMV261-cyp125-3及质粒pMV306进行酶切，回收pMV261-cyp125-3中的启动子和目的基因片段，与酶切后的pMV306连接，构建pMV306-cyp125-3重组质粒；
(3)将重组质粒pMV306-cyp125-3导入新金分枝杆菌的感受态细胞中，获得的阳性转化子。
6.权利要求2-4任意一项所述产雄烯二酮的基因工程菌的应用。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于，利用所述基因工程菌发酵生产雄烯二酮的方法，具体如下：
将菌种经种子培养后，按5-10％的接种量接种入发酵培养基中，28-32℃，130-250r/min，pH6.5-7.8条件下，发酵4-6天；
所述发酵培养基组成如下：K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，羟丙基β-环糊精25mM，植物甾醇3g/L，其余为水，pH6.5-7.8。
8.权利要求1或2所述的cyp125-3基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109706108A (zh) * 2019-01-29 2019-05-03 天津科技大学 一种通过强化nadh脱氢增强甾药前体生产的方法
CN110628735A (zh) * 2019-04-23 2019-12-31 天津科技大学 一种5α-还原酶突变体，基因工程菌及其在高效催化5α-AD生产中的应用
CN111172186A (zh) * 2020-01-16 2020-05-19 天津科技大学 一种降低氮源用量的甾体药物前体生产方法
CN111454871A (zh) * 2020-03-03 2020-07-28 天津大学 一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用
CN111484964A (zh) * 2020-03-14 2020-08-04 天津大学青岛海洋技术研究院 一种高产9-ohad的分枝杆菌及其构建的方法
CN111484962A (zh) * 2019-01-29 2020-08-04 天津科技大学 一种高效产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用
CN111484961A (zh) * 2019-01-29 2020-08-04 天津科技大学 一种产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用
CN111690586A (zh) * 2019-07-04 2020-09-22 天津科技大学 一种加强胞内丙酰辅酶a代谢提高甾药前体生产的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105219829A (zh) * 2015-10-15 2016-01-06 上海应用技术学院 一种制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法
CN106282080A (zh) * 2016-08-10 2017-01-04 江南大学 一种新金色分枝杆菌来源的甾酮c27‑单加氧酶及其应用
CN107354138A (zh) * 2017-07-12 2017-11-17 湖北共同生物科技有限公司 一种单氧化酶及其转化植物甾醇的方法
CN107779423A (zh) * 2017-10-25 2018-03-09 天津科技大学 辅因子再生分枝杆菌及其在油水双液相发酵中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105219829A (zh) * 2015-10-15 2016-01-06 上海应用技术学院 一种制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法
CN106282080A (zh) * 2016-08-10 2017-01-04 江南大学 一种新金色分枝杆菌来源的甾酮c27‑单加氧酶及其应用
CN107354138A (zh) * 2017-07-12 2017-11-17 湖北共同生物科技有限公司 一种单氧化酶及其转化植物甾醇的方法
CN107779423A (zh) * 2017-10-25 2018-03-09 天津科技大学 辅因子再生分枝杆菌及其在油水双液相发酵中的应用

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109706108B (zh) * 2019-01-29 2021-04-09 天津科技大学 一种通过强化nadh脱氢增强甾药前体生产的方法
CN109706108A (zh) * 2019-01-29 2019-05-03 天津科技大学 一种通过强化nadh脱氢增强甾药前体生产的方法
CN111484961B (zh) * 2019-01-29 2022-11-29 天津科技大学 一种产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用
CN111484961A (zh) * 2019-01-29 2020-08-04 天津科技大学 一种产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用
CN111484962A (zh) * 2019-01-29 2020-08-04 天津科技大学 一种高效产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用
CN110643557A (zh) * 2019-04-23 2020-01-03 天津科技大学 一种辅酶再生体系的构建及其在高效催化5α-AD生产中的应用
CN110628735B (zh) * 2019-04-23 2022-04-08 天津科技大学 一种5α-还原酶突变体，基因工程菌及其在高效催化5α-AD生产中的应用
CN110643557B (zh) * 2019-04-23 2021-12-31 天津科技大学 一种基因工程菌的构建及其在高效催化5α-雄烯二酮生产中的应用
CN110628735A (zh) * 2019-04-23 2019-12-31 天津科技大学 一种5α-还原酶突变体，基因工程菌及其在高效催化5α-AD生产中的应用
CN111690586A (zh) * 2019-07-04 2020-09-22 天津科技大学 一种加强胞内丙酰辅酶a代谢提高甾药前体生产的方法
CN111172186A (zh) * 2020-01-16 2020-05-19 天津科技大学 一种降低氮源用量的甾体药物前体生产方法
CN111172186B (zh) * 2020-01-16 2023-04-07 天津科技大学 一种降低氮源用量的甾体药物前体生产方法
CN111454871A (zh) * 2020-03-03 2020-07-28 天津大学 一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用
CN111454871B (zh) * 2020-03-03 2022-06-14 天津大学 一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用
CN111484964A (zh) * 2020-03-14 2020-08-04 天津大学青岛海洋技术研究院 一种高产9-ohad的分枝杆菌及其构建的方法

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