CN110643557A

CN110643557A - 一种辅酶再生体系的构建及其在高效催化5α-AD生产中的应用

Info

Publication number: CN110643557A
Application number: CN201910930871.6A
Authority: CN
Inventors: 申雁冰; 王敏; 任小贤; 欧阳微; 夏梦雷; 骆健美
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2019-09-29
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2039-09-29
Also published as: CN110643557B; CN110628735B; CN110628735A

Abstract

本发明提供一种辅酶再生体系，具体为串联葡萄糖‑6‑磷酸‑脱氢酶(G6PDH)及5α^Y187F‑还原酶重组体和串联NAD激酶及5α^Y187F‑还原酶重组体，构建其基因工程菌并应用在高效催化5α‑AD生产中的应用；将5α^Y187F‑还原酶分别与分枝杆菌来源的G6PDH和NAD激酶重组质粒电转至分枝杆菌中进行异源表达，再对其生产效率进行测定，发现串联表达的基因工程菌MNR M3/261‑5α^Y187F‑G6PDH2对5α‑AD的生产由原来的67.8％提高到了89.5％，串联表达菌株MNR M3/261‑5α^Y187F‑NAD2对5α‑AD的生产由原来的67.8％提高到了92.6％，有效解决了5α‑还原酶催化活性低的限制问题，为5α‑还原酶的分子改造提供了一条新的思路。

Description

一种辅酶再生体系的构建及其在高效催化5α-AD生产中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其是涉及一种辅酶再生体系的构建及其在高效催化5α-AD生产中的应用。

背景技术

5α-AD作为合成美雄诺龙、美睾酮等数十种甾体激素类药物的关键中间体，具有重要的市场价值和研究前景。目前工业上主要以雄甾-4烯-3,17-二酮(AD)经过一系列的化学反应制得，但也存在着耗时长，环境污染大等问题。生物转化的方法有着绿色、环保、高效的特点，正成为许多化学合成工艺的替代技术。

甾体5α-还原酶属于还原型辅酶II(NADPH)依赖型酶，其能够催化一系列类固醇底物在4,5位双键发生还原作用，并将C-5位上的氢加成在α位上成为相应的5α-还原产物。例如，睾酮(TS)在5α-还原酶的作用下被还原成一种活性更强的甾体激素：双氢睾酮(DHT)，其在雄激素的生理调节以及人的两性分化等方面，发挥着极其重要的作用；雄甾-4-烯-3,17二酮(AD)能够在类固醇5α-还原酶的催化作用被还原为重要的甾体药物中间体：5α-雄烯二酮(5α-AD)中间体。还原型辅酶Ⅱ(NADPH)作为微生物代谢网络中含量最丰富的氧化还原辅酶之一，参与细胞内的重要合成代谢。在微生物的催化反应中，细胞内辅酶含量也会不断消耗，随着辅酶含量的减少，催化反应便无法继续进行。近年来，人们陆续提出了一系列的方法，包括酶法、电化学、光化学等方法，以解决胞内辅酶NADPH再生，酶法再生因其选择性高、反应速率快等优势而受到广泛重视。

一些化学法和生物法可用于合成重要甾体化合物5α-AD，但化学法往往伴随着反应步骤多、环境污染大、过程不好控制等问题。生物法因其条件温和、环境友好、专一性强等优势，已越来越受关注。但现已发现的5α-还原酶，其对底物表现的活性并不能满足工业化生产的要求，在一定程度上限制了其应用。随着人们对5α-还原酶的功能和作用机理的认识的不断深入，采用基因工程技术改造酶分子以获得具有优良酶学性质的5α-还原酶，成为今后生物催化领域的另一发展趋势。采用基因工程技术改造酶分子以获得具有优良酶学性质的5α-还原酶，成为今后生物催化领域的另一发展趋势。目前关于5α-还原酶的分子改造，主要是对底物睾酮的酶活力研究，而且其催化效率并不理想；5α-还原酶是催化AD生产5α-AD的关键酶，目前针对底物AD的5α-还原酶基因的改造还没有报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种辅酶再生体系的构建及其在高效催化5α-AD生产中的应用。

本发明采用的技术方案是：将5α^Y187F-还原酶与辅因子再生酶串联构建得到的基因工程菌，辅因子再生酶为G6PDH2或NAD激酶。

一种串联G6PDH2与5α^Y187F-还原酶的质粒，包含于辅酶再生体系中，串联的5α^Y187F-还原酶序列如SEQ ID NO.4所示，串联的G6PDH2序列如SEQ ID NO.7所示。

优选地，将5α^Y187F-还原酶基因和表达载体连接构建携带5α^Y187F-还原酶基因的重组质粒pMV261-5α^Y187F，设计引物PCR扩增获得带有质粒pMV261核糖体结合位点的G6PDH2，将G6PDH2和重组质粒pMV261-5α^Y187F通过酶切连接，构建得到pMV261-5α^Y187F-G6PDH2重组质粒。

一种串联G6PDH2与5α^Y187F-还原酶的基因工程菌，将串联G6PDH2与5α^Y187F-还原酶的质粒电转至宿主菌，筛选获得的阳性转化子；

优选地，宿主菌为主产AD的新金分枝杆菌为MNR M3△ksdd。

一种串联NAD激酶与5α^Y187F-还原酶的质粒，包含于辅酶再生体系中，串联的5α^Y187F-还原酶序列如SEQ ID NO.4所示，串联的NAD激酶序列如SEQ ID NO.8所示。

优选地，将5α^Y187F-还原酶和NAD激酶分别与表达载体pMV261酶切连接构建带有5α^Y187F-还原酶基因的重组质粒pMV261-5α^Y187F及携带NAD激酶基因的重组质粒pMV261-NAD，设计引物PCR扩增获得带有质粒pMV261核糖体结合位点的NAD2，将NAD2和重组质粒pMV261-5α^Y187F通过酶切连接，构建得到pMV261-5α^Y187F-NAD2重组质粒。

一种串联NAD激酶与5α^Y187F-还原酶的基因工程菌，将串联NAD激酶与5α^Y187F-还原酶的质粒电转至宿主菌，筛选获得的阳性转化子；

优选地，宿主菌为主产AD的新金分枝杆菌为MNR M3△ksdd。

辅酶再生体系在5α-AD生产中的应用。

优选地，利用基因工程菌发酵制备5α-AD，按8％体积比的接种量转接至发酵培养基中，28-32℃，130-250r/min，pH 6.5-7.8条件下，发酵4-8d。

优选地，发酵培养基组成为：K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇1-30g/L，其余为水，pH为6.5-7.8。

本发明具有的优点和积极效果是：

同时将葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶与5α^Y187F-还原酶进行串联表达，进一步提高了5α-AD的产量，其摩尔转化率与原始菌株相比提高了21.7％与突变体菌株相比提高了4.4％；将NAD激酶与5α^Y187F-还原酶进行串联表达，也提高了5α-AD的产量，其摩尔转化率与原始菌株相比提高了24.8％，与突变体菌株相比提高了7.5％；本发明解决了5α-还原酶催化活性低的限制问题，为5α-还原酶的分子改造提供了一条新的思路。

附图说明

图1为原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α、重组菌MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F和MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2转化PS生成5α-AD的HPLC图；

图2为原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α、重组菌MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F和MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-NAD2转化PS生成5α-AD的HPLC图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的一个实施例做出说明。

5α^Y187F-还原酶，将5α-还原酶中的一个酪氨酸突变为苯丙氨酸，使其能够提高酶活力，在5α-AD生产中实现高效催化。具体为将序列如SEQ ID NO.2所示的的5α-还原酶中第187位酪氨酸突变为苯丙氨酸，从而形成5α-还原酶突变体5α^Y187F-还原酶，5α^Y187F-还原酶序列如SEQ ID NO.4所示。5α-还原酶基因序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，5α^Y187F-还原酶基因序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示.

SEQ ID NO.1

ATGGAGCGGCTCATCTTCATCTTCAACATCACCCAGATCGTCCTCTTCGGCGTCGGTCTGATCTGCTTTGTGGTGCTGTTCTTCGTCCCGGCGGGCTACGGCAAGATGATCAACAAGAAGTGGGGCTTCTCGTTCAACAACAAGATCGCTTGGTTTTTAATGGAGGTGCCGACTTTAATCACCATGATCGTTTTAATGTGCGTGTGGGCCAAGCCCGAGAACTTCGTGCGGATCATCATCGGTTTATTCTTCGTGCTGCATTACGCCCAGCGGGTGTTCATCTTCCCCTTTTTACTGAAGGGCAAGTCCAAGATGCCGATTTTAATCGTGCTGATGGGCATCACCTTCAACACCATCAACGCCTTTTTAATCGGTGCTTGGCTCTTTTATTTATCGCCCAAGACCATGTACCCGATCTCTTGGCTGTACGACCCGCGCTTCATCATCGGTGCCCTCGTGTTTTTACTGGGCATGGCCATCAACATCGACTCGGACAAGTACATCCGCTCGCTGCGCAAGCCGGGTGACACCGCCCACTACTTCCCCCACAAGCGGATGTACAAGTACGTCTCCTCGGCCAACTACTTCGGTGAGATTTTAGAGTGGTTCGGCTTCGCTTTACTGTCGTGGTCGTTCGTCGGTCTGCTGTTTGCCTTCTGGACTTGTGCCAATTTAGTCCCCCGGGCCTACACGATCAACAAGCGCTACCGCGAGGAGTTCCCGGAGGAGTTCGCCGCGCTGAAGCCGAAGCGCGTCTTCCCGTTCATTTTCTGASEQ ID NO.2

MERLIFIFNITQIVLFGVGLICFVVLFFVPAGYGKMINKKWGFSFNNKIAWFLMEVPTLITMIVLMCVWAKPENFVRIIIGLFFVLHYAQRVFIFPFLLKGKSKMPILIVLMGITFNTINAFLIGAWLFYLSPKTMYPISWLYDPRFIIGALVFLLGMAINIDSDKYIRSLRKPGDTAHYFPHKRMYKYVSSANYFGEILEWFGFALLSWSFVGLLFAFWTCANLVPRAYTINKRYREEFPEEFAALKPKRVFPFIFSEQ ID NO.3

ATGGAGCGGCTCATCTTCATCTTCAACATCACCCAGATCGTCCTCTTCGGCGTCGGTCTGATCTGCTTTGTGGTGCTGTTCTTCGTCCCGGCGGGCTACGGCAAGATGATCAACAAGAAGTGGGGCTTCTCGTTCAACAACAAGATCGCTTGGTTTTTAATGGAGGTGCCGACTTTAATCACCATGATCGTTTTAATGTGCGTGTGGGCCAAGCCCGAGAACTTCGTGCGGATCATCATCGGTTTATTCTTCGTGCTGCATTACGCCCAGCGGGTGTTCATCTTCCCCTTTTTACTGAAGGGCAAGTCCAAGATGCCGATTTTAATCGTGCTGATGGGCATCACCTTCAACACCATCAACGCCTTTTTAATCGGTGCTTGGCTCTTTTATTTATCGCCCAAGACCATGTACCCGATCTCTTGGCTGTACGACCCGCGCTTCATCATCGGTGCCCTCGTGTTTTTACTGGGCATGGCCATCAACATCGACTCGGACAAGTACATCCGCTCGCTGCGCAAGCCGGGTGACACCGCCCACTACTTCCCCCACAAGCGGATGTTCAAGTACGTCTCCTCGGCCAACTACTTCGGTGAGATTTTAGAGTGGTTCGGCTTCGCTTTACTGTCGTGGTCGTTCGTCGGTCTGCTGTTTGCCTTCTGGACTTGTGCCAATTTAGTCCCCCGGGCCTACACGATCAACAAGCGCTACCGCGAGGAGTTCCCGGAGGAGTTCGCCGCGCTGAAGCCGAAGCGCGTCTTCCCGTTCATTTTCTGA

SEQ ID NO.4

MERLIFIFNITQIVLFGVGLICFVVLFFVPAGYGKMINKKWGFSFNNKIAWFLMEVPTLITMIVLMCVWAKPENFVRIIIGLFFVLHYAQRVFIFPFLLKGKSKMPILIVLMGITFNTINAFLIGAWLFYLSPKTMYPISWLYDPRFIIGALVFLLGMAINIDSDKYIRSLRKPGDTAHYFPHKRMFKYVSSANYFGEILEWFGFALLSWSFVGLLFAFWTCANLVPRAYTINKRYREEFPEEFAALKPKRVFPFIF

包含5α^Y187F-还原酶的基因工程菌的制备方法，将5α-还原酶基因和表达载体连接构建携带5α-还原酶基因的重组质粒，携带5α-还原酶基因的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过重叠延伸PCR进行定点突变，把突变质粒连接到表达载体上，得到携带编码突变体基因5α^Y187F-还原酶的重组表达载体，将5α^Y187F-还原酶重组表达载体电转至主产AD的分枝杆菌中即得到重组分枝杆菌基因工程菌，其中构建表达载体可采用大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261，基因工程菌的宿主菌选用主产AD的分枝杆菌，具体为MNR M3△ksdd。具体制备方法如下：

步骤一将序列如SEQ ID NO.1所示的5α-还原酶基因片段与表达载体pMV261连接构建得到重组质粒pMV261-5α；

步骤二以重组质粒pMV261-5α为模板，设计引物进行重叠延伸PCR，F1primer序列如SEQ ID NO.5所示，R1 primer序列如SEQ ID NO.6所示，得到第187位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸的5α-还原酶突变体重组表达载体pMV261-5α^Y187F；

步骤三将5α-还原酶突变体重组表达载体pMV261-5α^Y187F电转到主产AD的分枝杆菌MNR M3△ksdd，获得5α-还原酶突变体的分枝杆菌基因工程菌MNR M3△ksdd/pMV261-5α^Y187F。

SEQ ID NO.5：CACAAGCGGATGTTCAAGTA

SEQ ID NO.6：TACTTGAACATCCGCTTGTG

为了测定5α-还原酶突变体的分枝杆菌基因工程菌MNR M3△ksdd/pMV261-5α^Y187F酶活性，可提取其粗酶液，对其酶活进行测定。5α-还原酶酶活测定方法：总反应体系包括：50mM Tris-HCL缓冲液(pH 7.2)，0.6mM溶于甲醇中的AD，适量的粗酶液，加入0.2mM NADPH去启动反应。设定254nm为测定波长，反应温度为30℃，利用紫外分光光度法测定底物AD每分钟的还原量，酶活(U)定义为：每分钟还原1μmol AD所需的酶量为1个酶活单位。

构建一种辅酶再生体系，将5α^Y187F-还原酶与葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6PDH)和NAD激酶进行串联表达。分别串联G6PDH2与5α^Y187F-还原酶构建重组质粒，串联NAD激酶与5α^Y187F-还原酶构建重组质粒；将5α^Y187F-还原酶基因及G6PDH基因、NAD激酶基因和表达载体连接构建分别携带5α^Y187F-还原酶以及G6PDH基因和5α^Y187F-还原酶以及NAD激酶基因的重组质粒pMV261-5α^Y187F-G6PDH和pMV261-5α^Y187F-NAD，转入到主产AD的分枝杆菌中获得串联重组表达的基因工程菌；具体如下：

1以序列如SEQ ID NO.3所示的5α^Y187F-还原酶基因序列为模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列为上下游引物，在设定好的PCR扩增条件和体系下进行PCR；利用凝胶回收试剂盒对目的片段进行纯化和回收，采用相应的限制性内切酶对5α^Y187F-还原酶基因片段和表达质粒pMV261通过酶切，T4连接，构建pMV261-5α^Y187F重组质粒；

2以序列如SEQ ID NO.7所示的含质粒pMV261核糖体结合位点的G6PDH基因(G6PDH2)序列为模板，以SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示序列为上下游引物，在设计的PCR条件和体系下进行PCR；利用凝胶回收试剂盒对目的片段进行纯化和回收，采用相同的限制性内切酶对G6PDH2基因片段和重组质粒pMV261-5α^Y187F通过酶切，T4连接，构建pMV261-5α^Y187F-G6PDH2重组质粒；

3以序列如SEQ ID NO.8所示的NAD激酶基因序列为模板，以SEQ ID NO.13和SEQID NO.14所示序列为上下游引物，在设计好的PCR体系和反应条件进行PCR；PCR产物用凝胶回收试剂盒进行纯化回收；纯化后的目的片段和表达质粒pMV261通过相同的限制性内切酶进行酶切，T4 DNA连接酶连接，构建pMV261-NAD重组质粒；

4将所得的pMV261-NAD重组质粒为模板，以SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列为上下游引物，PCR扩增获得含质粒pMV261核糖体结合位点的NAD基因(NAD2)，采用凝胶试剂盒纯化回收后，将重组质粒pMV261-5α^Y187F和NAD2采用形同的限制性内切酶进行酶切；对酶切后重组质粒pMV261-5α^Y187F进行去磷酸化处理；T4连接，构建pMV261-5α^Y187F-NAD2重组质粒；

5分别将重组质粒pMV261-5α^Y187F-G6PDH2和pMV261-5α^Y187F-NAD2电转至新金分枝杆菌的感受态细胞中，获得的阳性转化子即为本发明新构建的基因工程菌株。

本方案所采用的新金分枝杆菌为MNR M3△ksdd，制备所得的产5α-雄烯二酮的基因工程菌为MNR M3/261-5α^Y187F-G6PDH2和MNR M3/261-5α^Y187F-NAD2。

SEQ ID NO.7

ATGAGCACAGCCGAGGCATCGACATGGCACAACCCGCTGCGGGACAAGCGCGACAAGCGCATGCCCCGCATCGCGGGGCCGTGTGCGGTGGTGATCTTCGGGGTCACCGGCGATCTGGCCCGCAAGAAGCTGATGCCGGCGATCTACGATCTGGCCAACCGCGGACTGTTGCCGCCGAGCTTCGCCCTCGTCGGCTTCGCGCGGCGGGACTGGGCCGACGAGGATTTCGGCCAGGTCGTCTACGACGCGGTCAAGCAGCACGCGCGTACCCCGTTCCGGCAGGAGGTCTGGGACCGCCTGGCGGAGGGTTTCCGATTCGTCCAGGGCGCATTCGATGACGACGAGGCCTTCGGACACTTGGCCGAGACTTTGCACACCCTCGACGTCGAGCGCGGGACCAACGGCAATCACGCGTTCTACCTGTCGATTCCGCCGAAGGCGTTCCCGCAGGTACTGGAGCAGCTGTCCCGGTCGGGCCTGGCCGCCAAGGACGGCGACAGCTGGAGCCGGGTGGTCATCGAGAAGCCGTTCGGCCACGACCTGTCCAGCGCCGAGGAGCTCAACGGCCTGGTCAACAGCGTGTTCCCGGAGTCGTCGGTGTTCCGCATCGACCACTATCTGGGCAAGGAGACGGTGCAGAACATCTTGGCGTTGCGTTTTGCCAACGAGATGTTCGAGCCGATCTGGAACGCCCATTACGTCGACCATGTCCAGATCACCATGGCCGAGGACATCGGTCTGGGCGGTCGGGGCGGCTACTACGACGGTGTCGGTGCGGCCCGCGATGTGATCCAGAACCATCTGATCCAGCTGCTGGCGCTGACGGCGATGGAGGAGCCGGTGAGCTTCTCCCCCGCCGAACTGCAGGCCGAGAAGATCAAGGTGCTGGCCGCCAGCCGGTTGGCCGAACCGTTGGACCAGACCACCTCCCGCGGCCAGTACGCCGCGGGCTGGCAGGGCGGTGAGAAGGTGGTCGGGCTGCTCGACGAGGAGGGGTTCTCCCAGACCTCGACTACGGAGACGTTCGCCGCGATCACCGTCGATGTCGACACCCGCCGCTGGGCCGGTGTGCCGTTCTATCTGCGCACCGGAAAACGCTTGGGCCGCAGGGTCACCGAGATCGCGCTGGTCTTCAAGCGGGCGCCCCATCTGCCGTTCGACGCGACCATGACCGAGGAGCTGGGCAAGAACGCCCTGGTGATCCGGGTGCAGCCCGACGAGGGCATCACGCTGCGGTTCGGCTCGAAGGTACCGGGTAATGCCATGGAGGTCCGCGATGTCAGCATGGACTTCTCCTACGGTTCGGCGTTCGCCGAGGAGTCCCCGGAGGCCTACGAGCGGCTGATCCTGGATGTGTTGCTCGGCGAACCATCGCTGTTTCCGGTCAATGCCGAGGTCGAACTGTCCTGGAAGATCCTGGATCCCGCGCTGGAGTACTGGGCGTCACACGGCACACCCGACAGCTACGAGTCCGGTACCTGGGGCCCGGAGTCGGCATTCGAGATGTTGCGCCGCGTCGGACGCGAGTGGCGGCGGCCGTGA

SEQ ID NO.8

ATGACCTCACAGGAATCGAGCCCGGGCCGCACCATCCTGTTGGTGGTGCACACCGGGCGCGAAGAGGCCACCGAGACCGCCCGCCGGGTGGAAAAGGTGCTCGGTGAGCATGGCATCGCGCTGCGGGTGCTGACGGCCGAAGCCGTCGACCGAGGTTCACTGCACCTGGCGCCGGGGGAGATGCGTTCCCTCGGCGTCGACATCGACGTCGTCGATGCCGACGAGCAGGCCGCCGAGGGATGCGAGCTGGTTCTCGCCCTCGGTGGTGACGGTACTTTCCTGCGCGCTGCCGAACTCGCCCGCAATGTCGAGATCCCGGTTCTCGGAATCAATCTCGGCCGGATCGGTTTCCTGGCAGAGGCGGAGGCCGACGCGATCGACAAGGTGCTCGATCACGTCATCGCCAGGGACTATCGCGTAGAGCAGCGCATGACACTGGACGTCGCGGTCCGCCAGGACGGTGCGGTGTGTGACCGCGGATGGGCACTCAATGAGGCGAGCCTGGAGAAGGGCCCACGCCTGGGTGTGTTGGGGGTGGTGCTCGAGGTCGACGGGCGCCCGGTATCGCAGTTCGGCTGTGATGGTGTGCTGGTATCGACGCCGACGGGTTCGACGGCCTACGCGTTCTCCGCGGGGGGACCCATTCTGTGGCCCGATCTGGAGTCGATTCTGGTGGTACCCAACAACGCTCACGCATTGTTCGCCCGCCCGATGGTGACCAGTCCGGATGCGTCCATCGCCATCGAGGTCGAAGCCGGTGGTAATGATGCGATTGCCTATTGCGATGGGAGACGCAAGATGGTGGTGCCTGCCGGGGCACGTCTGGAAGTGACCCGCTGCGGTACGTCGTTGAAGTGGGTTCGCCTGGACAGTGCGCCGTTCACCGACCGGCTGGTGCGCAAGTTCCGGCTGCCGGTCAAGGGATGGCGCGGCCAGTAG

SEQ ID NO.9：5＇-CGCGGATCCATGGAGCGGCTCATCTTC-3＇(BamHⅠ)

SEQ ID NO.10：5＇-CCCAAGCTTTCAGAAAATGAACGGGAAGAC-3＇(Hind Ⅲ)

SEQ ID NO.11：5＇-CCCAAGCTTTAAGTAGCGGGGTTGCCGTCACC-3＇(BamH Ⅰ)

SEQ ID NO.12：5＇-AACAAGCTTTCACGGCCGCCGCCACTC-3＇(HindⅢ)

SEQ ID NO.13：5＇-CCGGAATTCATGACGCGGCGTGCACGGGTGGAT-3＇(BamHⅠ)

SEQ ID NO.14：5＇-CCCAAGCTTTCATTGCGGCCCTTCGTCGATCG-3＇(Hind Ⅲ)

SEQ ID NO.15：5＇-CCCAAGCTTTAAGTAGCGGGGTTGCCGTCACC-3＇(Hind Ⅲ)

SEQ ID NO.16：5＇-CCCAAGCTTTCATTGCGGCCCTTCGTCGATCG-3＇(Hind Ⅲ)

5α-还原酶突变体的基因工程菌的制备方法制备所得的5α-还原酶突变体的基因工程菌，以及MNR M3/261-5α^Y187F-G6PDH2和MNR M3/261-5α^Y187F-NAD2基因工程菌在5α-AD生产中的应用。利用5α-还原酶突变体基因工程菌发酵制备5α-AD，按8％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，28-32℃，130-250r/min，pH 6.5-7.8条件下，发酵4-9d。其中，发酵培养基组成为：K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇1-30g/L，其余为水，pH6.5-7.8。经检测得到，菌株MNRM3/261-5α^Y187F-G6PDH2转化5α-AD产量达到2.04g/L；菌株MNR M3/261-5α^Y187F-NAD2达到2.11g/L。

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅仅在于更好地理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1：突变酶基因及重组表达载体的构建

以合成好的带有耻垢密螺旋体5α-还原酶基因的重组质粒pUC57-5α为模板，扩增得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的5α-还原酶基因，将扩增产物与大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261连接，转化至E.coli DH5α中，经抗性筛选、质粒PCR、双酶切验证和DNA测序。选取测序正确并能够稳定遗传的重组质粒命名为pMV261-5α。

以pMV261-5α重组质粒为模板，以F1 primer(序列如SEQ ID NO.5所示)、R1primer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，通过重叠延伸PCR进行定点突变，得到携带编码5α-还原酶突变体基因的重组质粒，命名为pMV261-5α^Y187F。

PCR反应体系：5×Trans pfu Buffer 10μL，2.5mMdNTPS 4μL，模板DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，Trans FastpfuDNAploy 1μL，ddH₂O补齐至总体积50μL。

PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，63℃30s，72℃1min，循环30次，72℃10min，10℃保持。

实施例2：重组菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F的构建

将实施例1得到的重组质粒pMV261-5α^Y187F电转至MNR M3△ksdd感受态细胞，筛选能够稳定遗传的菌株即为5α-还原酶突变体分枝杆菌工程菌；具体方法如下：

1)取前期测序正确的质粒10μL加入到融化了的MNR M3Δksdd感受态细胞中，用枪轻轻吹吸混匀，冰浴处理15min左右；

2)将预冷的质粒与感受态细胞混合溶液完全转入1mm的电转杯中(用无水乙醇清洗电转杯后置于无菌操作台，吹干后放于冰上预冷5min)；

3)将装有质粒和感受态细胞混合液的电转杯放置于高压脉冲电转仪上，在1.5-2.5kV电压下，电转4-6ms，电转2次后，冰上放置5min；

4)迅速将电转并预冷后的细胞悬浮液转移至装有800μL LB复苏培养基的无菌离心管中，于30℃，200rpm条件下振荡培养4-6h。

5)将培养好的菌悬液在室温条件下，适当离心后并弃部分上清，剩余菌液吹吸混匀后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，30℃恒温倒置培养至长出单菌落。

6)挑取单菌落至液体种子培养基培养3d左右，进行菌液PCR以及质粒双酶切验证，验证正确的阳性转化子即为5α-还原酶突变体工程菌MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F。

实施例3：重组菌株MNR M3△ksdd/261-5α的构建

以如SEQ ID NO.1所示5α-还原酶序列为模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列为上下游引物，构建重组菌株MNR M3△ksdd/261-5α，操作过程如实施例1实施例2相同。

实施例4：串联表达菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2的构建4.1构建pMV261-5α^Y187F-G6PDH2重组质粒

以专利CN2019100877177中所构建的pMV261-G6PDH2质粒为模板，以P3和P4为上下游引物，以实施例1中所用的PCR扩增体系以及条件进行PCR。利用凝胶回收试剂盒对目的片段进行纯化和回收后，将G6PDH2基因片段以及实施例1中所得的pMV261-5α^Y187F质粒进行Hind III单酶切处理，然后将酶切后的pMV261-5α^Y187F质粒进行去磷酸化处理，22℃，连接2-2.5h，化转至大肠杆菌DH5α感受态中，挑取转化子进行PCR、双酶切验证，验证正确的送金唯智公司测序，测序正确的即为重组质粒pMV261-5α^Y187F-G6PDH2。

优选地去磷酸化体系：单酶切后的pMV261-5α^Y187F质粒25μL,10x BacterialAlkaline Phosphatase Buffer 5μL，Bacterial Alkaline Phosphatase 1μL，灭菌ddH₂O19μL，50℃水浴30min。

4.2构建菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2

将10μL步骤1所得的重组质粒加入到100μL的新金分枝杆菌感受态细胞中，冰浴15min后加入提前预冷的电转杯中，1.2kv条件下电击2次，每次4-5ms；加入800μL LB复苏培养基，吹吸混匀后吸回至1.5ml无菌离心管中，于30℃，200rpm条件下振荡培养3-5h；将培养好的菌悬液在室温下，适当离心后并弃部分上清，剩余菌液吹吸混匀后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，30℃恒温倒置培养至长出单菌落。挑选单菌落至含有卡那霉素抗性的LB试管中，培养3-4d后进行菌液PCR和质粒单酶切验证，验证正确的阳性转化子即为重组菌MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2。

实施例5：串联表达菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-NAD2的构建

5.1构建pMV261-5α^Y187F-NAD2质粒，其过程包括：

1)构建pMV261-NAD重组质粒

在NCBI上进行序列查找，发现分枝杆菌自身存在NAD激酶，故本发明选用分枝杆菌自身的NAD激酶作为目的基因。以分枝杆菌基因组为模板，以SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示序列为上下游引物，在设计好的PCR体系和条件下进行PCR扩增；利用凝胶回收试剂盒进行纯化并回收，获得目的基因片段NAD激酶；将目的片段及穿梭质粒pMV261用BamHⅠ和Hind III双酶切并纯化，然后22℃连接2-2.5h，化转至大肠杆菌DH5α感受态，挑取转化子进行PCR、双酶切验证，验证正确的进行测序，测序正确的即为重组质粒pMV261-NAD。其中，PCR体系和反应条件如实施例1。

2)构建pMV261-5α^Y187F-NAD2重组质粒

以质粒pMV261-NAD为模板，以SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列为上下游引物，在设计好的PCR体系和条件下进行PCR扩增获得含有质粒pMV261核糖体结合位点的NAD(NAD2)，采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化、回收。将纯化后的目的片段与实施例1中得到的重组质粒pMV261-5α^Y187F用HindⅢ酶进行单酶切，其中将单酶切后的重组质粒pMV261-5α^Y187F进行去磷酸化处理，22℃，T4连接2-2.5h，化转至大肠杆菌DH5α感受态中，挑取阳性转化子进行PCR、双酶切验证，验证正确的送测序，测序正确的即为重组质粒pMV261-5α^Y187F-NAD2。其中，去磷酸化体系如实施例4。

5.2构建菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-NAD2

取10μL的上述重组质粒pMV261-5α^Y187F放入100μL的分枝杆菌感受态细胞中，冰浴15min，放入到已预冷的电转杯中，在电压1.2-1.5kv条件下，电2次，每次4-5ms；取800μL预冷的LB培养液于电转杯中，吹吸混匀后，吸至无菌的1.5mL离心管中，30℃,200r/min，复苏培养3-5h；将培养好的菌悬液室温条件下，5000-6000r/min，离心1min，在超净台中去适当上清液后，剩余菌液吹吸混匀后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，30℃恒温倒置培养至长出单菌落。挑取转化子于含有卡那霉素抗性的LB试管中，30℃,200r/min培养3-4d后进行菌液PCR和质粒双酶切验证，验证正确的送测序，测序正确的即为重组菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-NAD2。

实施例6：5α-还原酶突变体工程菌MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F转化PS生产5α-AD

1)菌种活化培养:

将5α-还原酶突变体工程菌MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F转接于新鲜斜面培养基上，30℃培养3d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种，混合均匀得洗脱液，吸取1mL洗脱液加入到30mL种子培养基中，在30℃，200r/min条件下摇床培养36h得种子培养液；

斜面培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO₃ 10g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.2；

种子培养基组成：K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO₃ 10g/L，其余为水，pH7.2。

2)植物甾醇微生物转化：

将步骤1中活化的种子培养液按8％(V/V)的接种量转接于装有发酵培养基的250mL挡板瓶中，在30℃，140r/min条件下摇床培养5-8d；

发酵培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇3g/L，其余为水，pH 7.2。

反应结束后，甾体转化物可用同体积的乙酸乙酯等有机溶剂萃取。以薄层层析(TLC)或高效液相色谱(HPLC)分析确定产物的生成情况。

实施例7：串联菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2和MNR M3/261-5α^Y187F-NAD2转化PS生产5α-AD7.1菌体活化培养

将实施例2中所得的菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2和MNR M3/261-5α^Y187F-NAD2接于斜面培养基上，30℃静止培养2d，再转接至斜面培养基上进行二次活化，30℃培养3d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种，混合均匀后，吸取1-2mL洗脱液加入到30mL种子培养基中，在30℃，200r/min条件下摇床培养36h得种子培养液；

7.2植物甾醇的转化

步骤1中所得的种子液按8％(V/V)的接种量转接于装有发酵培养基的250mL挡板瓶中，30℃，140r/min条件下摇床培养5-9d；

发酵培养基组分为：柠檬酸2g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇3g/L，羟丙基-β-环糊精38g/L，其余为水，pH7.2。

反应结束后，甾体转化物可用同体积的乙酸乙酯等有机溶剂萃取。高效液相色谱(HPLC)分析确定产物的生成情况。

实施例8：串联菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2和MNR M3/261-5α^Y187F-NAD2与突变体菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F及原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α转化PS生产5α-AD比较

将菌株分为两组，分别进行以下菌株性能的测定。分组如下：

实验组：本发明实施例4所构的重组菌MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2和实施例5所构的重组菌MNR M3/261-5α^Y187F-NAD2；

对照组：本发明中构建的突变体工程菌：MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F；构建的原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α；

1)基因工程菌转化植物甾醇实验方法如下：

按照实施例9中菌种活化培养方法，分别将两组菌株经相同的方法活化后，将活化的种子培养液以8％(v/v)的接种量转接于含有发酵培养基的250mL挡板瓶中，在30℃，140r/min条件下摇床培养5-9d；

发酵培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇3g/L，羟丙基-β-环糊精38g/L,其余为水，pH 7.2。

2)5α-AD摩尔生成率的检测：

所取的样品中加入等体积的乙酸乙酯超声萃取，离心，取乙酸乙酯相0.2mL于1.5mL管中,自然风干后加1mL的流动相，超声溶解，离心后进行HPLC分析。色谱条件：C18柱,流动相为甲醇：水(4：1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为290nm。

3)结果比较：

如图1所示，生物转化4d时，串联的工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2的5α-AD的摩尔转化率为44.6％，与原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高了20.3％，与突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F相比提高12.8％；

5d时，串联的工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2的5α-AD的摩尔转化率为64.6％，与原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高了30.5％，与突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F相比提高21.2％；

6d时，串联的工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2的摩尔转化率为64.7％，与原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高了9.2％，与突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F几乎相同；

7d后，串联的工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2的5α-AD的摩尔转化率为82.8％，与原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高了19.8％，与突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F相比几乎相同；

8d后，串联的工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2的摩尔转化率为89.5％，与原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高了22.6％，与突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F相比提高4.4％。表明，在植物甾醇转化过程中，串联的工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-G6PDH2的的转化效率及转化率明显优于原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α，优于突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F。

如图2所示，生物转化4d时，串联的工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-NAD2的5α-AD的摩尔转化率为45.2％，与原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高了20.9％，与突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F相比提高14.4％；

5d时，串联的工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-NAD2的5α-AD的摩尔转化率为66.7％，与原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高了32.6％，与突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F相比提高22.8％；

6d时，串联的工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-NAD2的摩尔转化率为77.5％，与原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高了32.6％，与突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F相比提高了12.5％；

7d后，串联的工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-NAD2的5α-AD的摩尔转化率为86.3％，与原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高了18.5％，与突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F相比提高了3.1％；

8d后，串联的工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-NAD2的摩尔转化率为91.2％，与原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α相比提高了24.3％，与突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F相比提高6.1％。表明，在植物甾醇转化过程中，串联的工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F-NAD2的的转化效率及转化率明显优于原始菌株MNR M3△ksdd/261-5α，优于突变体工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α^Y187F。

根据上述数据，如图1-2所示，串联表达5α^Y187F-还原酶及葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶以及串联表达5α^Y187F-还原酶及NAD激酶，均提高了植物甾醇的转化效率，为5α-还原酶在工业上的应用具有重大意义。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种辅酶再生体系的构建及其在高效催化5α-AD生产中的应用

<130> 2019

<150> 2019103266387

<151> 2019-09-29

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagcggc tcatcttcat cttcaacatc acccagatcg tcctcttcgg cgtcggtctg 60

atctgctttg tggtgctgtt cttcgtcccg gcgggctacg gcaagatgat caacaagaag 120

tggggcttct cgttcaacaa caagatcgct tggtttttaa tggaggtgcc gactttaatc 180

accatgatcg ttttaatgtg cgtgtgggcc aagcccgaga acttcgtgcg gatcatcatc 240

ggtttattct tcgtgctgca ttacgcccag cgggtgttca tcttcccctt tttactgaag 300

ggcaagtcca agatgccgat tttaatcgtg ctgatgggca tcaccttcaa caccatcaac 360

gcctttttaa tcggtgcttg gctcttttat ttatcgccca agaccatgta cccgatctct 420

tggctgtacg acccgcgctt catcatcggt gccctcgtgt ttttactggg catggccatc 480

aacatcgact cggacaagta catccgctcg ctgcgcaagc cgggtgacac cgcccactac 540

ttcccccaca agcggatgta caagtacgtc tcctcggcca actacttcgg tgagatttta 600

gagtggttcg gcttcgcttt actgtcgtgg tcgttcgtcg gtctgctgtt tgccttctgg 660

acttgtgcca atttagtccc ccgggcctac acgatcaaca agcgctaccg cgaggagttc 720

ccggaggagt tcgccgcgct gaagccgaag cgcgtcttcc cgttcatttt ctga 774

<210> 2

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Arg Leu Ile Phe Ile Phe Asn Ile Thr Gln Ile Val Leu Phe

1 5 10 15

Gly Val Gly Leu Ile Cys Phe Val Val Leu Phe Phe Val Pro Ala Gly

20 25 30

Tyr Gly Lys Met Ile Asn Lys Lys Trp Gly Phe Ser Phe Asn Asn Lys

35 40 45

Ile Ala Trp Phe Leu Met Glu Val Pro Thr Leu Ile Thr Met Ile Val

50 55 60

Leu Met Cys Val Trp Ala Lys Pro Glu Asn Phe Val Arg Ile Ile Ile

65 70 75 80

Gly Leu Phe Phe Val Leu His Tyr Ala Gln Arg Val Phe Ile Phe Pro

85 90 95

Phe Leu Leu Lys Gly Lys Ser Lys Met Pro Ile Leu Ile Val Leu Met

100 105 110

Gly Ile Thr Phe Asn Thr Ile Asn Ala Phe Leu Ile Gly Ala Trp Leu

115 120 125

Phe Tyr Leu Ser Pro Lys Thr Met Tyr Pro Ile Ser Trp Leu Tyr Asp

130 135 140

Pro Arg Phe Ile Ile Gly Ala Leu Val Phe Leu Leu Gly Met Ala Ile

145 150 155 160

Asn Ile Asp Ser Asp Lys Tyr Ile Arg Ser Leu Arg Lys Pro Gly Asp

165 170 175

Thr Ala His Tyr Phe Pro His Lys Arg Met Tyr Lys Tyr Val Ser Ser

180 185 190

Ala Asn Tyr Phe Gly Glu Ile Leu Glu Trp Phe Gly Phe Ala Leu Leu

195 200 205

Ser Trp Ser Phe Val Gly Leu Leu Phe Ala Phe Trp Thr Cys Ala Asn

210 215 220

Leu Val Pro Arg Ala Tyr Thr Ile Asn Lys Arg Tyr Arg Glu Glu Phe

225 230 235 240

Pro Glu Glu Phe Ala Ala Leu Lys Pro Lys Arg Val Phe Pro Phe Ile

245 250 255

Phe

<210> 3

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggagcggc tcatcttcat cttcaacatc acccagatcg tcctcttcgg cgtcggtctg 60

atctgctttg tggtgctgtt cttcgtcccg gcgggctacg gcaagatgat caacaagaag 120

tggggcttct cgttcaacaa caagatcgct tggtttttaa tggaggtgcc gactttaatc 180

accatgatcg ttttaatgtg cgtgtgggcc aagcccgaga acttcgtgcg gatcatcatc 240

ggtttattct tcgtgctgca ttacgcccag cgggtgttca tcttcccctt tttactgaag 300

ggcaagtcca agatgccgat tttaatcgtg ctgatgggca tcaccttcaa caccatcaac 360

gcctttttaa tcggtgcttg gctcttttat ttatcgccca agaccatgta cccgatctct 420

tggctgtacg acccgcgctt catcatcggt gccctcgtgt ttttactggg catggccatc 480

aacatcgact cggacaagta catccgctcg ctgcgcaagc cgggtgacac cgcccactac 540

ttcccccaca agcggatgtt caagtacgtc tcctcggcca actacttcgg tgagatttta 600

gagtggttcg gcttcgcttt actgtcgtgg tcgttcgtcg gtctgctgtt tgccttctgg 660

acttgtgcca atttagtccc ccgggcctac acgatcaaca agcgctaccg cgaggagttc 720

ccggaggagt tcgccgcgct gaagccgaag cgcgtcttcc cgttcatttt ctga 774

<210> 4

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Glu Arg Leu Ile Phe Ile Phe Asn Ile Thr Gln Ile Val Leu Phe

1 5 10 15

Gly Val Gly Leu Ile Cys Phe Val Val Leu Phe Phe Val Pro Ala Gly

20 25 30

Tyr Gly Lys Met Ile Asn Lys Lys Trp Gly Phe Ser Phe Asn Asn Lys

35 40 45

Ile Ala Trp Phe Leu Met Glu Val Pro Thr Leu Ile Thr Met Ile Val

50 55 60

Leu Met Cys Val Trp Ala Lys Pro Glu Asn Phe Val Arg Ile Ile Ile

65 70 75 80

Gly Leu Phe Phe Val Leu His Tyr Ala Gln Arg Val Phe Ile Phe Pro

85 90 95

Phe Leu Leu Lys Gly Lys Ser Lys Met Pro Ile Leu Ile Val Leu Met

100 105 110

Gly Ile Thr Phe Asn Thr Ile Asn Ala Phe Leu Ile Gly Ala Trp Leu

115 120 125

Phe Tyr Leu Ser Pro Lys Thr Met Tyr Pro Ile Ser Trp Leu Tyr Asp

130 135 140

Pro Arg Phe Ile Ile Gly Ala Leu Val Phe Leu Leu Gly Met Ala Ile

145 150 155 160

Asn Ile Asp Ser Asp Lys Tyr Ile Arg Ser Leu Arg Lys Pro Gly Asp

165 170 175

Thr Ala His Tyr Phe Pro His Lys Arg Met Phe Lys Tyr Val Ser Ser

180 185 190

Ala Asn Tyr Phe Gly Glu Ile Leu Glu Trp Phe Gly Phe Ala Leu Leu

195 200 205

Ser Trp Ser Phe Val Gly Leu Leu Phe Ala Phe Trp Thr Cys Ala Asn

210 215 220

Leu Val Pro Arg Ala Tyr Thr Ile Asn Lys Arg Tyr Arg Glu Glu Phe

225 230 235 240

Pro Glu Glu Phe Ala Ala Leu Lys Pro Lys Arg Val Phe Pro Phe Ile

245 250 255

Phe

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacaagcgga tgttcaagta 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tacttgaaca tccgcttgtg 20

<210> 7

<211> 1542

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgagcacag ccgaggcatc gacatggcac aacccgctgc gggacaagcg cgacaagcgc 60

atgccccgca tcgcggggcc gtgtgcggtg gtgatcttcg gggtcaccgg cgatctggcc 120

cgcaagaagc tgatgccggc gatctacgat ctggccaacc gcggactgtt gccgccgagc 180

ttcgccctcg tcggcttcgc gcggcgggac tgggccgacg aggatttcgg ccaggtcgtc 240

tacgacgcgg tcaagcagca cgcgcgtacc ccgttccggc aggaggtctg ggaccgcctg 300

gcggagggtt tccgattcgt ccagggcgca ttcgatgacg acgaggcctt cggacacttg 360

gccgagactt tgcacaccct cgacgtcgag cgcgggacca acggcaatca cgcgttctac 420

ctgtcgattc cgccgaaggc gttcccgcag gtactggagc agctgtcccg gtcgggcctg 480

gccgccaagg acggcgacag ctggagccgg gtggtcatcg agaagccgtt cggccacgac 540

ctgtccagcg ccgaggagct caacggcctg gtcaacagcg tgttcccgga gtcgtcggtg 600

ttccgcatcg accactatct gggcaaggag acggtgcaga acatcttggc gttgcgtttt 660

gccaacgaga tgttcgagcc gatctggaac gcccattacg tcgaccatgt ccagatcacc 720

atggccgagg acatcggtct gggcggtcgg ggcggctact acgacggtgt cggtgcggcc 780

cgcgatgtga tccagaacca tctgatccag ctgctggcgc tgacggcgat ggaggagccg 840

gtgagcttct cccccgccga actgcaggcc gagaagatca aggtgctggc cgccagccgg 900

ttggccgaac cgttggacca gaccacctcc cgcggccagt acgccgcggg ctggcagggc 960

ggtgagaagg tggtcgggct gctcgacgag gaggggttct cccagacctc gactacggag 1020

acgttcgccg cgatcaccgt cgatgtcgac acccgccgct gggccggtgt gccgttctat 1080

ctgcgcaccg gaaaacgctt gggccgcagg gtcaccgaga tcgcgctggt cttcaagcgg 1140

gcgccccatc tgccgttcga cgcgaccatg accgaggagc tgggcaagaa cgccctggtg 1200

atccgggtgc agcccgacga gggcatcacg ctgcggttcg gctcgaaggt accgggtaat 1260

gccatggagg tccgcgatgt cagcatggac ttctcctacg gttcggcgtt cgccgaggag 1320

tccccggagg cctacgagcg gctgatcctg gatgtgttgc tcggcgaacc atcgctgttt 1380

ccggtcaatg ccgaggtcga actgtcctgg aagatcctgg atcccgcgct ggagtactgg 1440

gcgtcacacg gcacacccga cagctacgag tccggtacct ggggcccgga gtcggcattc 1500

gagatgttgc gccgcgtcgg acgcgagtgg cggcggccgt ga 1542

<210> 8

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgacctcac aggaatcgag cccgggccgc accatcctgt tggtggtgca caccgggcgc 60

gaagaggcca ccgagaccgc ccgccgggtg gaaaaggtgc tcggtgagca tggcatcgcg 120

ctgcgggtgc tgacggccga agccgtcgac cgaggttcac tgcacctggc gccgggggag 180

atgcgttccc tcggcgtcga catcgacgtc gtcgatgccg acgagcaggc cgccgaggga 240

tgcgagctgg ttctcgccct cggtggtgac ggtactttcc tgcgcgctgc cgaactcgcc 300

cgcaatgtcg agatcccggt tctcggaatc aatctcggcc ggatcggttt cctggcagag 360

gcggaggccg acgcgatcga caaggtgctc gatcacgtca tcgccaggga ctatcgcgta 420

gagcagcgca tgacactgga cgtcgcggtc cgccaggacg gtgcggtgtg tgaccgcgga 480

tgggcactca atgaggcgag cctggagaag ggcccacgcc tgggtgtgtt gggggtggtg 540

ctcgaggtcg acgggcgccc ggtatcgcag ttcggctgtg atggtgtgct ggtatcgacg 600

ccgacgggtt cgacggccta cgcgttctcc gcggggggac ccattctgtg gcccgatctg 660

gagtcgattc tggtggtacc caacaacgct cacgcattgt tcgcccgccc gatggtgacc 720

agtccggatg cgtccatcgc catcgaggtc gaagccggtg gtaatgatgc gattgcctat 780

tgcgatggga gacgcaagat ggtggtgcct gccggggcac gtctggaagt gacccgctgc 840

ggtacgtcgt tgaagtgggt tcgcctggac agtgcgccgt tcaccgaccg gctggtgcgc 900

aagttccggc tgccggtcaa gggatggcgc ggccagtag 939

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcggatcca tggagcggct catcttc 27

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cccaagcttt cagaaaatga acgggaagac 30

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cccaagcttt aagtagcggg gttgccgtca cc 32

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aacaagcttt cacggccgcc gccactc 27

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccggaattca tgacgcggcg tgcacgggtg gat 33

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cccaagcttt cattgcggcc cttcgtcgat cg 32

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cccaagcttt aagtagcggg gttgccgtca cc 32

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cccaagcttt cattgcggcc cttcgtcgat cg 32

Claims

1.一种辅酶再生体系，其特征在于：将5α^Y187F-还原酶与辅因子再生酶串联构建得到的基因工程菌，辅因子再生酶为G6PDH2或NAD激酶。

2.一种串联G6PDH2与5α^Y187F-还原酶的质粒，包含于权利要求1所述辅酶再生体系中，其特征在于：串联的5α^Y187F-还原酶序列如SEQ ID NO.4所示，串联的G6PDH2序列如SEQ IDNO.7所示。

3.根据权利要求2所述的串联G6PDH2与5α^Y187F-还原酶的质粒，其特征在于：将5α^Y187F-还原酶基因和表达载体连接构建携带5α^Y187F-还原酶基因的重组质粒pMV261-5α^Y187F，设计引物PCR扩增获得带有质粒pMV261核糖体结合位点的G6PDH2，将G6PDH2和重组质粒pMV261-5α^Y187F通过酶切连接，构建得到pMV261-5α^Y187F-G6PDH2重组质粒。

4.一种串联G6PDH2与5α^Y187F-还原酶的基因工程菌，其特征在于：将权利要求2或3所述的串联G6PDH2与5α^Y187F-还原酶的质粒电转至主产AD的分枝杆菌中，筛选获得的阳性转化子；

优选地，主产AD的新金分枝杆菌为MNR M3△ksdd。

5.一种串联NAD激酶与5α^Y187F-还原酶的质粒，包含于权利要求1所述辅酶再生体系中，其特征在于：串联的5α^Y187F-还原酶序列如SEQ ID NO.4所示，串联的NAD激酶序列如SEQ IDNO.8所示。

6.根据权利要求5所述的串联NAD激酶与5α^Y187F-还原酶的质粒，其特征在于：将5α^Y187F-还原酶和NAD激酶分别与表达载体pMV261酶切连接构建带有5α^Y187F-还原酶基因的重组质粒pMV261-5α^Y187F及携带NAD激酶基因的重组质粒pMV261-NAD，设计引物PCR扩增获得带有质粒pMV261核糖体结合位点的NAD2，将NAD2和重组质粒pMV261-5α^Y187F通过酶切连接，构建得到pMV261-5α^Y187F-NAD2重组质粒。

7.一种串联NAD激酶与5α^Y187F-还原酶的基因工程菌，其特征在于：将权利要求5或6所述的串联NAD激酶与5α^Y187F-还原酶的质粒电转至宿主菌，筛选获得的阳性转化子；

优选地，宿主菌为主产AD的新金分枝杆菌为MNR M3△ksdd。

8.权利要求1、4或7中任一所述的基因工程菌在5α-AD生产中的应用。

9.根据权利要求8所述的基因工程菌在5α-AD生产中的应用，其特征在于：利用所述基因工程菌发酵制备5α-AD，按8％体积比的接种量转接至发酵培养基中，28-32℃，130-250r/min，pH 6.5-7.8条件下，发酵4-8d。

10.根据权利要求9所述的基因工程菌在5α-AD生产中的应用，其特征在于：所述发酵培养基组成为：K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇1-30g/L，其余为水，pH为6.5-7.8。