CN111484962A - 一种高效产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种高效产5α‑雄烷二酮的基因工程菌及其应用，可实现直接从廉价底物植物甾醇(PS)为原料到新型甾体药物中间体5α‑雄烯二酮(5α‑AD)的绿色高效生产以及通过辅酶再生策略来提高其产量的方法。本发明将来自齿垢密螺旋体中的5α‑还原酶基因异源表达到主产雄烯二酮(AD)的分枝杆菌中，实现从PS到5α‑AD的一步生物转化；同时为了解决辅酶II(NADPH)在5α‑还原反应中的供给问题，过表达葡萄糖‑6‑磷酸‑脱氢酶，维持了胞内NADPH/NADP+的平衡，在辅酶再生系统中显著提高了5α‑AD的转化率。

Description

一种高效产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用
技术领域：
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种能够直接从廉价底物植物甾醇到5α-雄烷二酮一步转化的基因工程菌及其应用。
背景技术：
甾体药物作为一类在医药上占有重要地位的激素类药物，目前已被鉴定的已经超过250多种，其市场需求仅次于抗生素，全球年产量超过100万吨，具有非常广阔的市场前景。甾体激素类药物在抗肿瘤、抗炎症、抗过敏等方面被广泛应用，同时在治疗风湿性关节炎、支气管炎以及艾迪森等内分泌疾病也是必不可少的药物。
5α-雄烷二酮(5α-AD)作为一种重要的甾体药物中间体，被广泛应用于合成美睾酮、雄诺龙、美替诺龙等甾体激素类药物，具有广泛的应用前景。目前5α-AD的现有合成途径主要以化学合成法为主，其往往伴随着反应步骤多、环境污染大、过程不好控制等问题。
近年来，随着生物转化与生物催化技术的发展，利用微生物转化法发酵获得重要甾体激素类药物已经屡见不鲜。如利用分枝杆菌对植物甾醇(PS)进行侧链降解来生产雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)；AD可以在简单节杆菌的3-甾酮-△1-脱氢酶(ksdD)催化作用下生成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)；AD又可以在赭曲霉的11α-羟化酶作用下生成11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮(11α-OH-AD)。这些酶对底物的专一性作用是化学生产法所无法比拟的。随着可持续发展理念的提出，开发一条绿色生物法生产重要甾体激素类药物的新方法已经成为近期技术发展的重要方向。
发明内容：
本发明针对现有化学法生产5α-AD的诸多问题，探索出一种绿色生物法生产5α-AD的新途径。
本发明所要解决的技术问题为克服现有化学法生产5α-AD带来的诸多问题，探索出一种绿色生物法生产5α-AD的新途径。因此对5α-AD的合成路线进行重新设计。廉价的植物甾醇经分枝杆菌侧链降解作用生成AD，AD经甾体5α-还原酶的催化作用生成5α-AD。同时，AD到5α-AD的催化反应是由5α-还原酶和辅酶II(NADPH)的共同作用所完成。葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6PDH)可以以葡萄糖为底物，催化其脱氢生成NADPH。为了实现5α-还原反应中NADPH的循环再生，将5α-还原酶与G6PDH串联表达于分枝杆菌，来提高5α-AD的生产效率。
本发明实现上述目的的技术方案如下：一种高效产5α-AD的基因工程菌，是以主产AD的分枝杆菌为宿主细胞，异源表达5α-还原酶基因，来获得一株直接转化PS为5α-AD的分枝杆菌，并通过串联表达表达葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6PDH)基因，使胞内NADPH循环再生，以实现5α-AD高效生产。
所述5α-还原酶基因是以齿垢密螺旋体中的5α-还原酶基因为原始基因，根据分枝杆菌表达的密码子偏好性，对5α-还原酶原始基因序列进行优化，获得优化的5α-还原酶基因序列。
所述5α-还原酶基因原始核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
所述5α-还原酶基因优化后核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
所述G6PDH基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述分枝杆菌为快速生长型分枝杆菌，包括分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)NRRLB-3683、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)NRRLB-3805、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatism)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、微黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)、新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)、草分枝杆菌(Mycobacterium Phlei)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)。
更优选地，所述分枝杆菌为新金分枝杆菌。
更优选地，所述新金分枝杆菌具体为新金分枝杆菌MNR M3△ksdD。
所述新金分枝杆菌MNR M3△ksdD由实验室成员谢日丽所构建。所述新金分枝杆菌由原始菌株TCCC11028(MNR)(保藏编号为CICC 21097)经自发突变后得到的突变菌株TCCC11028M3(MNR M3)为出发菌株，通过敲除3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，从而获得基因缺陷型菌株MNR M3△ksdD。新金分枝杆菌MNR M3△ksdD的构建方法来源于文章：Xie R,Shen Y,Qin N,et al.Genetic differences in ksdD influence on the ADD/AD ratio ofMycobacterium neoaurum[J].Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2015,42(4):507-513.)优选地，所述高效产5α-AD的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)将所述优化后的5α-还原酶基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-5α重组质粒；
(2)将所述G6PDH基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-G6PDH重组质粒；
(3)以所述重组质粒pMV261-G6PDH为模板，通过扩增得到带有质粒pMV261核糖体结合位点的G6PDH基因，将所述步骤(3)第二次扩增得到的G6PDH基因与重组质粒pMV261-5α通过酶切，连接，构建pMV261-5α-G6PDH重组质粒；
(4)将所述重组质粒pMV261-5α-G6PDH导入至所述分枝杆菌感受态细胞，通过构建获得高效产5α-AD的基因工程菌。
更优选地，所述高效产5α-AD的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)将所述5α-还原酶基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-5α重组质粒；
(2)将所述G6PDH基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-G6PDH重组质粒；
(3)以所述重组质粒pMV261-G6PDH为模板，通过扩增得到带有质粒pMV261核糖体结合位点的G6PDH基因，将所述步骤(3)第二次扩增得到的G6PDH基因与重组质粒pMV261-5α通过酶切，连接，构建pMV261-5α-G6PDH重组质粒；
(4)将所述重组质粒pMV261-5α-G6PDH导入至新金分枝杆菌MNR M3△ksdD的感受态细胞中，构建得到基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH。
本发明的另一目的是提供上述高效产5α-AD的基因工程菌用于发酵制备5α-AD的用途。
优选地，所述基因工程菌发酵制备5α-AD具体如下：
将所述高效产5α-AD的基因工程菌经种子培养后，按5-10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，28-32℃，130-250r/min，pH 6.5-7.8条件下，发酵4-8d；
所述发酵培养基组成如下：K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇1-30g/L，其余为水，pH6.5-7.8。
有益效果：
现有技术中公开的不同来源的5α-还原酶基因有很多类型，例如哺乳动物细胞(人、猴、小鼠、蟾蜍等)，植物细胞(棉花、油菜、水稻、拟南芥等)，微生物细胞(链霉菌属、红球菌属、结核分枝杆菌、新生隐球菌等)，但本发明发现，现有技术中不同来源的5α-还原酶基因并不能在新金分枝杆菌中成功表达，如：根据文献调研，发现来自小鼠中的5α-还原酶基因成功表达于酿酒酵母细胞，并表现出相应的活性；但将其优化后的序列表达于分枝杆菌中，并没有表达出5α-还原酶活性。分析原因可能是由于表达宿主分枝杆菌属于细菌，而来自于动物细胞的5α-还原酶可能在表达过程中需要有分子伴侣帮助折叠成正确的构象才会有活性；而且原核细胞中缺乏高尔基体等细胞器，无法将多肽变成具有一定空间结构的蛋白质。
本发明通过质粒pMV261，在分枝杆菌中成功实现了齿垢密螺旋体的5α-还原酶和其自身的葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的串联表达，赋予分枝杆菌5α-还原能力，实现了从PS到5α-AD的一步生物转化。齿垢密螺旋体的5α-还原酶在分枝杆菌中表达及全细胞转化植物甾醇均为首次报道，且重组子表达的酶活及植物甾醇的摩尔转化率均较高。分枝杆菌作为安全稳定的生产菌株，具有较厚的分枝菌酸，能够耐受一定浓度的甾体底物和产物，成为微生物甾醇发酵工业潜在的生产菌株。该方法可替代现有技术中通过化学法将AD转化为5α-AD的生产方式，不仅原料价格低廉，而且制备方法清洁环保、生产效率较高。
同时，类固醇5α-还原酶是靶细胞内的膜蛋白，主要定位于微粒体膜和核膜，其以还原型辅酶II(NADPH)为供氢体，可以催化一系列类固醇底物的△4,5双键还原，并使C-5位上的氢加成在α位上成为相应的5α-羟化产物。5α-还原酶在雄激素的生成、代谢和转化方面尤为重要，其可以将睾酮不可逆地还原为活性更强的双氢睾酮。对5α-还原酶的深入研究对整个甾体药物行业的发展行业意义深远。生产更高附加值的5α-AD最经济环保的方法就是以植物甾醇(PS)为底物，通过微生物一步转化。本发明将葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6PDH)与5α-还原酶串联表达，解决了5α-还原反应中的辅酶不足问题。最终5α-AD在辅酶再生体系中的摩尔转化率达到了86.41％，较单表达5α-还原酶体系中67.8％的摩尔转化率相比，提高了近20％。
附图说明：
图1：基因工程菌MNR M3△ksdD/261-G6PDH菌液PCR验证图，其中，M：DL5000 DNAMarker；1-3：基因工程菌MNR M3△ksdD/261-G6PDH菌液PCR扩增条带。
图2：基因工程菌MNR M3△ksdD/261-G6PDH双酶切验证图，其中，M：DL5000 DNAMarker；1-3：基因工程菌MNRM3△ksdD/261-G6PDH的质粒双酶切条带。
图3：基因工程菌MNRM3△ksdD/261-5α-G6PDH菌液PCR验证图，其中，M：DL5000 DNAMarker；1，2：基因工程菌MNRM3△ksdD/261-5α-G6PDH菌液PCR扩增条带。
图4：基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH单酶切验证图，其中，M：DL5000 DNAMarker；1，2：基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH的质粒单酶切条带。
图5：纯化产物核磁的13C谱图与1H谱图，其中图(a)为1H谱图，图(b)为13C谱图。
图6：宿主菌MNR M3△ksdD、工程菌MNR M3△ksdD/261-5α以及工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH的比生长速率(实心图标)和葡萄糖消耗(空心图标)情况图。
图7：工程菌MNR M3△ksdD/261-5α和MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH胞内的NADPH(实心图标)以及NADP+(空心图标)浓度情况。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
以下实施例中主要试剂：PS购自中粮集团科技生物工程有限公司，标准品5α-AD购自湖北万得化工有限公司。
实施例1目的基因5α-还原酶基因的获得
根据文献调研，来自小鼠中的5α-还原酶已成功表达于酿酒酵母细胞，并展现出相应的活性；结合NCBI序列查找及比对分析，发现来自齿垢密螺旋体的5α-还原酶与小鼠中的5α-还原酶同源性较高，并且其属于细菌来源。因此选择齿垢密螺旋体中的原始5α-还原酶基因(即SEQ ID NO.1)作为本次发明的原始基因。
将来自齿垢密螺旋体的5α-还原酶原始基因序列送至金唯智公司，合成符合分枝杆菌密码子偏好性的5α-还原酶基因。
以合成好的含有5α-还原酶基因序列的质粒pUC57-5α为模板，以及pMV261质粒上的酶切位点设计5α-还原酶基因引物，通过PCR扩增并纯化获得密码子优化后的5α-还原酶基因序列(即SEQ ID NO.2)；
PCR反应体系：5×Trans pfu Buffer 10μL，2.5mMdNTPS 4μL，模板DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，Trans FastpfuDNAploy 1μL，ddH2O补齐至总体积50μL。
PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，63℃30s，72℃1min，循环30次，72℃10min，10℃保持。
对比例1基因工程菌MNRM3△ksdD/261-5α的构建
1、构建pMV261-5α质粒，其过程包括：
将由实施例1获得的目的片段5α-还原酶基因按一定的比例与穿梭质粒pMV261分别用BamH I和HindIII双酶切并纯化，然后16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用卡那霉素平板筛选基因工程菌，挑取转化子进行PCR、双酶切验证，即重组质粒经BamHI和Hind III双酶切后，释放出大小约为4.5kb和0.8kb的基因片段，将PCR、双酶切验证正确的质粒送至金唯智公司测序，测序正确的质粒即为重组质粒pMV261-5α。
2、构建基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α：
(1)新金分枝杆菌MNRM3△ksdD感受态细胞制备：选择新金分枝杆菌MNRM3△ksdD作为宿主细胞，将该菌的一级种子培养至OD600为1.0左右,按10％接种量转接到种子培养基中进行二级种子培养；24h后加入2％甘氨酸继续培养24h。离心收集菌体，分四次用10％预冷甘油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入甘油悬浮菌体，并分装保存；
种子培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，其余为水，pH7.2；
(2)电转化：10μL步骤1所得重组质粒pMV261-5α加入100μL分枝MNR M3△ksdD感受态菌体中放置10min，电击条件如下：1.5KV条件下电转两次，每次4-5ms；
(3)重组子筛选与验证：电转产物加入种子培养基复苏培养3-5h后，涂布于含有卡那霉素(50mg/L)种子培养基平板上，30℃静置培养3-5d，挑取单菌落至液体种子培养基培养3d左右，进行菌液PCR以及质粒双酶切验证，验证正确的阳性转化子即为基因工程菌MNRM3△ksdD/261-5α。
实施例2串联表达菌株MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH的构建
1、构建pMV261-5α-G6PDH质粒，其过程包括：
(1)构建pMV261-G6PDH重组质粒
根据NCBI序列查找，发现分枝杆菌自身存在葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶基因(G6PDH)，参照NCBI公布的Mycobacterium neoaurum1815D的G6PDH基因序列，故本发明选用分枝杆菌自身的G6PDH作为目的基因(即SEQ ID NO.3)。
以pMV261上的酶切位点设计G6PDH基因引物，以分枝杆菌基因组为模板，以G6PDH-F、G6PDH-R为引物，通过PCR扩增出G6PDH基因序列。
将获得的目的片段G6PDH以及穿梭质粒pMV261分别用EcoRI和HindIII双酶切并纯化，然后16℃过夜连接，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用卡那霉素平板筛选基因工程菌，挑取转化子进行菌液PCR和质粒经EcoR I和Hind III双酶切验证(参照图1和图2)，释放出大小约为4.5kb和1.6kb的基因片段，将PCR、双酶切验证正确的质粒送至金唯智公司测序，测序正确的质粒即为重组质粒pMV261-G6PDH；
(2)构建pMV261-5α-G6PDH重组质粒
以构建好的重组质粒pMV261-G6PDH为模板，设计引物G6PDH+SD-F、G6PDH+SD-R，通过PCR扩增得到含有质粒pMV261核糖体结合位点的G6PDH基因，对纯化后的G6PDH及例1中的重组质粒pMV261-5α进行Hind III单酶切处理，16℃过夜连接后，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用卡那霉素平板筛选基因工程菌，挑取转化子进行菌液PCR及质粒单酶切验证(参照图3和图4)，酶切后释放出大小约为5.3kb和1.6kb的基因片段，将PCR、单酶切验证正确的质粒送至金唯智公司测序，测序正确的质粒即为重组质粒pMV261-5α-G6PDH；
2、构建基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH：
(1)新金分枝杆菌MNRM3△ksdD感受态细胞制备：选择新金分枝杆菌MNRM3△ksdD作为宿主细胞，按照对比例1步骤2的(1)的方法制备感受态细胞；
(2)电转化：取10μL步骤1所得重组质粒pMV261-5α-G6PDH加入100μL新金分枝杆菌MNR M3△ksdD感受态菌体冰上放置10min，电击条件如下：1.5KV条件下电转两次，每次4-5ms；
(3)重组子筛选与验证：电转产物加入种子培养基复苏培养3-5h后，涂布于含有卡那霉素(50mg/L)种子培养基平板上，30℃静置培养3-5d，挑取单菌落至液体种子培养基培养3d左右，进行菌液PCR及质粒单酶切验证，验证正确的阳性转化子即为基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH。
实施例3 MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH菌株转化PS生产5α-AD的方法与产物鉴定
1、菌种活化培养:
将基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH转接于新鲜斜面培养基上，30℃培养3d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种，混合均匀得洗脱液，吸取1mL洗脱液加入到30mL种子培养基中，在30℃，200r/min条件下摇床培养36h得种子培养液；
斜面培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.2；
种子培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，其余为水，pH7.2。
2、植物甾醇微生物转化：
将步骤1中活化的种子培养液按8％的接种量转接于装有发酵培养基的250mL挡板瓶中，在30℃，140r/min条件下摇床培养5-8d；
发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇3g/L，其余为水，pH 7.2。
3、5α-AD分离及鉴定：
产物分离纯化步骤如下：将发酵8d左右的发酵液用2倍体积的乙酸乙酯萃取，旋蒸得到浓缩后的发酵产物；加入少量硅胶研磨，得到粉末状浓缩产物；导入装有硅胶的硅胶柱中，用石油醚：乙酸乙酯(3:1)去分离得到液体的纯化产物；继续旋蒸至一定体积后室温干燥，得到固体纯化产物约1.5g，摩尔转化率约65％。
产物结构鉴定步骤如下：对得到的固体纯化产物进行核磁(NMR)(图5)分析。1H谱数据为2.25-2.44(m,4H)，2.06-2.13(m,3H)，1.95-2.04(m,1H)，1.82-1.86(m,2H),1.68-1.69(m,1H)，1.53-1.61(m,3H)，1.27-1.43(m,6H)，1.00-1.04(s,4H)，0.81-0.89(s,3H)，0.80-0.81(m,1H)。13C谱数据为220.99,211.67,77.45,77.14,76.82,54.00,51.35,47.83,46.71,44.69,38.55,38.17,35.92，35.90，35.07,31.60,30.64,28.73,21.89,20.82,13.91,11.56。1H和13C谱数据显示，其化学迁移与标品5α-AD保持一致。
需要说明书的是，由以下实施例4-11构建的基因工程菌在进行产物结构的核磁分析鉴定结果均与实施例3的基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH的鉴定结果一致，实施例4-11的工程菌所产5α-AD的1H和13C谱数据显示，其化学迁移均与标品5α-AD保持一致。
实施例4基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法
1、基因工程菌的构建：
(1)构建pMV261-5α-G6PDH质粒：方法同实施例2步骤1；
(2)构建基因工程菌株：选择将分枝杆菌NRRLB-3683作为宿主细胞，在感受态细胞制备、电转化以及重组子筛选与验证方法同实施例2的步骤2，以此获得基因工程菌。
2、基因工程菌转化PS生产5α-AD的方法：
将构建的基因工程菌按照实施例3的菌种活化培养以及植物甾醇微生物转化方法发酵生产5α-AD。
实施例5基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法
基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为分枝杆菌NRRLB-3805。
实施例6基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法
基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为耻垢分枝杆菌。
实施例7基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法
基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为偶发分枝杆菌。
实施例8基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法
基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为微黄分枝杆菌。
实施例9基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法
基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为新金分枝杆菌。
实施例10基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法
基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为草分枝杆菌。
实施例11基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法
基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为鸟分枝杆菌。
实施例12基因工程菌与原始菌株性能比较
将菌株分为三组，分别进行以下菌株性能的测定。分组如下：
实验组：本发明实施例2构建的基因工程菌：MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH；
对照组1：新金分枝杆菌对照菌株MNR M3△ksdD/261
对照组2：本发明对比例1构建的基因工程菌：MNRM3△ksdD/261-5α。
所述对照菌MNR M3△ksdD/261的构建方法：是将质粒pMV261直接导入宿主菌MNRM3△ksdD中，具体导入方法同对比例1步骤2，唯一区别是质粒不同(即(1)感受态细胞制备(2)电转化：(3)重组子筛选与验证)，以下所述新金分枝杆菌对照菌株MNR M3△ksdD/261均为该菌。
1、3株菌株生长性能比较
将三株菌分别转接于新鲜斜面培养基上，30℃培养3d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种，混合均匀得洗脱液，吸取1mL洗脱液加入到30mL种子培养基中，在30℃，200r/min条件下摇床培养36h得种子培养液，当菌株生长到对数生长期时，按8％的接种量转接至装有50mL不含3g/L植物甾醇的发酵培养基中，每隔12h取样测定吸光度600nm处的吸光值，绘制生长曲线。
斜面培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.2；
种子培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，其余为水，pH7.2。
发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇3g/L，其余为水，pH 7.2。
所述宿主菌MNRM3△ksdD为敲除了3-甾酮-Δ1-脱氢酶(ksdD)的分枝杆菌，ksdD催化AD生成ADD，其敲除可以阻断AD的降解，达到积累AD的目的。
2、基因工程菌葡萄糖消耗情况比较
对分枝杆菌进行活化及种子培养，当菌株生长到对数生长期时，按8％的接种量转接至装有50mL含3g/L植物甾醇的发酵培养基(步骤1所述)中，每隔12h取样测发酵液中葡萄糖含量。
3、基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α和MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH中NADPH/NADP+比例比较
对分枝杆菌进行活化及种子培养，当菌株生长到对数生长期时，按8％的接种量转接至装有50mL含3g/L植物甾醇的发酵培养基(步骤1所述)中，每隔24h取样测发酵液中辅酶II(NADPH/NADP+)含量变化。
①辅因子的提取：
NADPH的提取：取0.8mL发酵液，加入0.9mL预冷的碱性提取液，超声波破碎1min(强度20％或200W，超声2s，停1s)，煮沸5min(盖紧，以防水分散失)，冰浴中冷却后，10000rpm，4℃离心10min，取上清至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，冰上保存待测。
NADP+的提取：取0.8mL发酵液，加入0.9mL预冷的酸性提取液，超声波破碎1min(强度20％或200W，超声2s，停1s)，煮沸5min(盖紧，以防水分散失)，冰浴中冷却后，10000rpm，4℃离心10min，取上清至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，冰上保存待测。
②NADPH/NADP+测定：
本发明测定NADPH/NADP+是基于分光光度法，NADPH经PMS的递氢作用，氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒，在570nm下检测吸光值，从而测定NADPH含量；再利用葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶还原NADP+为NADPH，从而检测NADP+含量。
4、基因工程菌与原始菌株酶活比较
收集发酵液菌体细胞进行超声破碎，4℃，12000r/min离心30min，取上清液即为粗酶液。
(1)5α-还原酶酶活测定：
酶促反应体系：50mMTris-HCL缓冲液(pH 7.2)，0.6Mm AD溶于甲醇中，适量的粗酶液，加入0.2mM NADPH去启动反应。
酶活单位定义：在37℃，PH7.2条件下，一分钟转化1μmolAD生成5α-AD所需的酶量。
(2)葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶酶活测定：
酶促反应体系：70mMTris-HCL缓冲液(pH 7.5)，12mM MgCL2,1mM NADP+,20mM 6-磷酸-葡萄糖，适量的粗酶液。
酶活单位定义：在37℃，PH7.2条件下，一分钟生成1μM NADPH所需的酶量。
5、结果比较
如图6所示，基因工程菌MNRM3△ksdD/261-5α与MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH相比，起初生长速率要快，但在3d之后，基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH与MNR M3△ksdD/261-5α的生长速率以及葡萄糖消耗接近一致，并且串联了G6PDH之后对5α-还原酶酶活没有太大影响(表1)。
如表1所示，基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α和MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH与对照菌株MNR M3△ksdD/261相比都具有了5α-还原的能力，并且两株基因工程菌的5α-还原酶酶活基本相同；而基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH与MNR M3△ksdD/261-5α相比，由于串联了葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶，其G6PDH酶活得到了较大提升，并且其胞内的NADPH/NADP+比例维持在一个相对稳定的水平(图7)。
表1株菌5α-还原酶和葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶酶活测定
Figure BDA0001962311030000131
需要说明书的是，由实施例4-11构建的基因工程菌在进行实施例12的菌种性能测定中，菌株生长性能、菌葡萄糖消耗、NADPH/NADP+比例以及酶活方面均得到与实施例12的基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH相近的技术效果。
实施例13基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α和MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH转化PS生产5α-AD比较
将工程菌分组进行由PS生产5α-AD转化性能的比较，具体分组为：
对照组：对比例1构建的基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α；
实验组：实施例2构建的基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH；
1、基因工程菌转化植物甾醇实验方法如下：
按照实施例3中菌种活化培养方法，分别将两组菌株经相同的方法活化后，将活化的种子培养液以8％的接种量转接于含有发酵培养基的250mL挡板瓶中，在30℃，140r/min条件下摇床培养5-8d；
发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇3g/L，其余为水，pH 7.2。
2、5α-AD摩尔生成率的检测：
用乙酸乙酯超声萃取发酵液，离心，取乙酸乙酯相0.2mL于1.5mL管中,自然风干后加1mL的流动相，超声溶解，离心后进行HPLC分析。色谱条件：C18柱,流动相为甲醇：水(3：1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为290nm。
3、结果比较：
如表2所示，生物转化4d时，工程菌株MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH的5α-AD生成量为0.76g/L，与单表达菌株MNR M3△ksdD/261-5α相比提高46.2％；5d时，工程菌株MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH的5α-AD的生成量为0.91g/L，与单表达菌株MNR M3△ksdD/261-5α相比提高24.7％；6d时，工程菌株MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH的5α-AD生成量为1.35g/L，与单表达菌株MNR M3△ksdD/261-5α相比提高40.6％；7d后，工程菌株MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH的5α-AD生成量为1.85g/L，与单表达菌株MNR M3△ksdD/261-5α相比提高27.6％；表明，在植物甾醇转化过程中，含pMV261-5α-G6PDH重组载体的工程分枝杆菌的转化效率及转化率优于单表达菌株MNR M3△ksdD/261-5α。
采用ksdD(C1,2位脱氢酶)基因敲除的新金分枝杆菌作为宿主，植物甾醇侧链降解时不会将生成的AD转化成ADD等C1,2位脱氢产物，提高AD的积累量，最终可协同异源表达的5α-还原酶共同提高目标产物5α-AD的产量。
表2重组分枝杆菌转化过程中5α-AD产量(g/L)
Figure BDA0001962311030000141
Figure BDA0001962311030000151
需要说明书的是，由实施例4-11构建的基因工程菌在进行实施例13转化PS生产5α-AD的5α-AD产量以及摩尔转化率中，均能获得与实施例13的基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH相近的技术效果。
实施例14基因工程菌MNR M3△ksdd/261-5α-G6PDH转化不同浓度PS生产5α-AD性能比较
(1)菌种培养：将基因工程菌MNR M3△ksdd/261-5α-G6PDH按照实施例3步骤1：菌种活化培养。
(2)转化实验：将活化好的种子液转接至分枝发酵培养基中，每天在固定的取样。
发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇1g/L，其余为水，pH 7.2。
(3)5α-AD的检测分析：
用乙酸乙酯超声萃取发酵液，离心，取乙酸乙酯相0.2mL于1.5mL管中,自然风干后加1mL的流动相，超声溶解，离心后进行HPLC分析。色谱条件：C18柱,流动相为甲醇：水(3：1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为290nm。
(4)结果比较：
对工程菌株MNR M3△ksdd/261-5α-G6PDH转化PS结果分析发现，当PS浓度为1g/L时，5α-AD的摩尔转化率达93％。
实施例15基因工程菌MNR M3△ksdd/261-5α-G6PDH转化不同浓度PS生产5α-AD性能比较
基因工程菌MNR M3△ksdd/261-5α-G6PDH转化PS生产5α-AD的方法同实施例14，唯一不同是植物甾醇为30g/L，对转化结果分析发现，当底物浓度为30g/L时，5α-AD的摩尔转化率约49％。
需要说明书的是，由实施例4-11构建的基因工程菌在进行实施例14、15转化PS生产5α-AD的5α-AD产量以及摩尔转化率中，均能获得与实施例14、15的基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH相近的技术效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种高效产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用
<130> 2019
<141> 2019-01-29
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 774
<212> DNA
<213> 齿垢密螺旋体()
<400> 1
atggaaagac tgatatttat atttaatatt acgcagattg tcttattcgg cgtaggctta 60
atttgttttg tagtattgtt ttttgttccg gccggatacg gtaagatgat aaataaaaaa 120
tggggatttt cttttaacaa taaaattgcg tggtttttaa tggaagttcc tacacttatc 180
actatgattg tcctaatgtg tgtatgggct aaacctgaaa attttgtgag aattataata 240
ggcctttttt ttgtgctgca ttatgctcaa agagttttta tatttccttt tttacttaag 300
ggaaaaagta agatgcccat cctcatcgtt ttgatgggaa tcacatttaa tacgataaat 360
gcctttttaa taggtgcatg gcttttttac ctttccccca agaccatgta ccccatctcg 420
tggctttatg acccccgatt tataatcgga gctcttgttt ttttgctcgg aatggccata 480
aacatagact cggacaagta tatacgttcc ttacgaaagc cgggagacac ggcacactat 540
tttccgcata aacggatgta caaatatgta tccagcgcca attatttcgg tgaaatattg 600
gaatggttcg gctttgccct cctatcatgg agctttgtag gccttttgtt tgcattttgg 660
acctgtgcca accttgttcc gagggcctat actataaata aaagatacag ggaagaattt 720
cctgaagaat ttgcagcctt aaaacctaag agggtatttc cttttatatt ttaa 774
<210> 2
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atggagcggc tcatcttcat cttcaacatc acccagatcg tcctcttcgg cgtcggtctg 60
atctgctttg tggtgctgtt cttcgtcccg gcgggctacg gcaagatgat caacaagaag 120
tggggcttct cgttcaacaa caagatcgct tggtttttaa tggaggtgcc gactttaatc 180
accatgatcg ttttaatgtg cgtgtgggcc aagcccgaga acttcgtgcg gatcatcatc 240
ggtttattct tcgtgctgca ttacgcccag cgggtgttca tcttcccctt tttactgaag 300
ggcaagtcca agatgccgat tttaatcgtg ctgatgggca tcaccttcaa caccatcaac 360
gcctttttaa tcggtgcttg gctcttttat ttatcgccca agaccatgta cccgatctct 420
tggctgtacg acccgcgctt catcatcggt gccctcgtgt ttttactggg catggccatc 480
aacatcgact cggacaagta catccgctcg ctgcgcaagc cgggtgacac cgcccactac 540
ttcccccaca agcggatgta caagtacgtc tcctcggcca actacttcgg tgagatttta 600
gagtggttcg gcttcgcttt actgtcgtgg tcgttcgtcg gtctgctgtt tgccttctgg 660
acttgtgcca atttagtccc ccgggcctac acgatcaaca agcgctaccg cgaggagttc 720
ccggaggagt tcgccgcgct gaagccgaag cgcgtcttcc cgttcatttt ctga 774
<210> 3
<211> 1542
<212> DNA
<213> 分枝杆菌()
<400> 3
atgagcacag ccgaggcatc gacatggcac aacccgctgc gggacaagcg cgacaagcgc 60
atgccccgca tcgcggggcc gtgtgcggtg gtgatcttcg gggtcaccgg cgatctggcc 120
cgcaagaagc tgatgccggc gatctacgat ctggccaacc gcggactgtt gccgccgagc 180
ttcgccctcg tcggcttcgc gcggcgggac tgggccgacg aggatttcgg ccaggtcgtc 240
tacgacgcgg tcaagcagca cgcgcgtacc ccgttccggc aggaggtctg ggaccgcctg 300
gcggagggtt tccgattcgt ccagggcgca ttcgatgacg acgaggcctt cggacacttg 360
gccgagactt tgcacaccct cgacgtcgag cgcgggacca acggcaatca cgcgttctac 420
ctgtcgattc cgccgaaggc gttcccgcag gtactggagc agctgtcccg gtcgggcctg 480
gccgccaagg acggcgacag ctggagccgg gtggtcatcg agaagccgtt cggccacgac 540
ctgtccagcg ccgaggagct caacggcctg gtcaacagcg tgttcccgga gtcgtcggtg 600
ttccgcatcg accactatct gggcaaggag acggtgcaga acatcttggc gttgcgtttt 660
gccaacgaga tgttcgagcc gatctggaac gcccattacg tcgaccatgt ccagatcacc 720
atggccgagg acatcggtct gggcggtcgg ggcggctact acgacggtgt cggtgcggcc 780
cgcgatgtga tccagaacca tctgatccag ctgctggcgc tgacggcgat ggaggagccg 840
gtgagcttct cccccgccga actgcaggcc gagaagatca aggtgctggc cgccagccgg 900
ttggccgaac cgttggacca gaccacctcc cgcggccagt acgccgcggg ctggcagggc 960
ggtgagaagg tggtcgggct gctcgacgag gaggggttct cccagacctc gactacggag 1020
acgttcgccg cgatcaccgt cgatgtcgac acccgccgct gggccggtgt gccgttctat 1080
ctgcgcaccg gaaaacgctt gggccgcagg gtcaccgaga tcgcgctggt cttcaagcgg 1140
gcgccccatc tgccgttcga cgcgaccatg accgaggagc tgggcaagaa cgccctggtg 1200
atccgggtgc agcccgacga gggcatcacg ctgcggttcg gctcgaaggt accgggtaat 1260
gccatggagg tccgcgatgt cagcatggac ttctcctacg gttcggcgtt cgccgaggag 1320
tccccggagg cctacgagcg gctgatcctg gatgtgttgc tcggcgaacc atcgctgttt 1380
ccggtcaatg ccgaggtcga actgtcctgg aagatcctgg atcccgcgct ggagtactgg 1440
gcgtcacacg gcacacccga cagctacgag tccggtacct ggggcccgga gtcggcattc 1500
gagatgttgc gccgcgtcgg acgcgagtgg cggcggccgt ga 1542

Claims (8)

1.一株高效产5α-AD的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌是以主产AD的分枝杆菌为宿主细胞，异源表达5α-还原酶基因，并通过串联表达G6PDH基因所得。
2.如权利要求1所述一株高效产5α-AD的基因工程菌，其特征在于：所述5α-还原酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；所述G6PDH基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.3所示。
3.如权利要求1或2所述一株高效产5α-AD的基因工程菌，其特征在于：所述分枝杆菌为快速生长型分枝杆菌，包括分枝杆菌NRRLB-3683、分枝杆菌NRRLB-3805、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌、新金分枝杆菌、草分枝杆菌、鸟分枝杆菌。
4.如权利要求1或2所述一株高效产5α-AD的基因工程菌，其特征在于：所述分枝杆菌为新金分枝杆菌MNR M3△ksdD。
5.权利要求3所述一株高效产5α-AD的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将所述5α-还原酶基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-5α重组质粒；
(2)将所述G6PDH基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-G6PDH重组质粒；
(3)以所述重组质粒pMV261-G6PDH为模板，通过扩增得到带有质粒pMV261核糖体结合位点的G6PDH基因，将所述步骤(3)得到的G6PDH基因与重组质粒pMV261-5α通过酶切，连接，构建pMV261-5α-G6PDH重组质粒；
(4)将所述重组质粒pMV261-5α-G6PDH导入至所述分枝杆菌的感受态细胞中，构建获得高效产5α-AD的基因工程菌。
6.权利要求4所述一株高效产5α-AD的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将所述5α-还原酶基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-5α重组质粒；
(2)将所述G6PDH基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-G6PDH重组质粒；
(3)以所述重组质粒pMV261-G6PDH为模板，通过扩增得到带有质粒pMV261核糖体结合位点的G6PDH基因，将所述步骤(3)得到的G6PDH基因与重组质粒pMV261-5α通过酶切，连接，构建pMV261-5α-G6PDH重组质粒；
(4)将所述重组质粒pMV261-5α-G6PDH导入至新金分枝杆菌MNRM3△ksdD的感受态细胞中，构建获得基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH。
7.权利要求1-4任一所述高效产5α-AD的基因工程菌用于发酵制备5α-AD的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于：所述基因工程菌发酵制备5α-AD具体如下：
将所述高效产5α-AD的基因工程菌经种子培养后，按5-10％的接种量接种至发酵培养基中，28-32℃，130-200r/min，pH6.5-7.8条件下，发酵4-8d；
所述发酵培养基组成如下：K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇1-30g/L，余量为水，pH6.5-7.8。
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