CN115838679A - 一种高产甾药前体的基因工程菌及其应用 - Google Patents

一种高产甾药前体的基因工程菌及其应用 Download PDF

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申雁冰
王敏
尉健
邓金娜
张振建
骆健美
夏梦雷
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Abstract

本发明属于生物催化技术领域，具体地涉及一种联合降低甾药前体生产菌胞内丙酰辅酶A高产甾药前体的方法。本发明是通过单一或组合增强甾药前体生产菌株中Acc家族AccA1、AccD1基因、转录调节因子AraC基因及其调控的Nat基因实现甾药前体的高产。所获得的基因工程菌在底物转化期间，其胞内的底物代谢副产物丙酰辅酶A较原始菌含量明显降低，AD的转化效率明显提高，并且菌株对环境的耐受性，特别是对产物的耐受性，为工业生产提供新思路。

Description

一种高产甾药前体的基因工程菌及其应用
技术领域：
本发明属于生物催化技术领域，更具体地涉及一种联合降低丙酰辅酶A高产甾药前体的菌株及其应用。
背景技术：
甾体化合物对生物体的正常运转必不可少，当机体自身生产不足时，需主动摄入这类甾体化合物以补充机体的正常需要。目前市场上销售的甾体类药物已多达上百种，其作为利尿药、抗炎药、类固醇类激素免疫抗原和心血管药物被广泛应用于临床，这导致该类药物的前体物质需求旺盛。
甾药前体的工业化生产主要利用微生物转化法，将廉价、易取的植物甾醇、β谷甾醇、麦角甾醇、胆固醇等原料，通过微生物代谢，分离提纯，得到多功能高价值的甾药前体。以植物甾醇为原料，可生产的甾药前体主要有C19-甾体(AD、ADD、9-OHAD)和C22-甾体(20-羧基-孕甾-4-烯-3-酮、4-BNC、20-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮、4-BNA)两大类。其中，雄甾-4-烯-3，17-二酮(Androstenedione，AD)可用来生产雄激素、蛋白同化激素、螺内酯等药物；由AD经C1,2位脱氢生成的雄甾-1，4-二稀-3，17-二酮(Androsta-diene-dione，ADD)可用来合成19-去甲甾体系列雌激素，如雌酮(Estrone)，炔诺酮(Norethisterone)和黄体酮(Progestin)等。除了合成性激素外，还可在AD的酮基上引入皮质激素侧链使之能够应用于皮质激素的生产，或通过在不同位点上进行羟基化，生产更多类型的甾药中间体，如9α-OH-AD、5α-OH-AD、11α-OH-AD等。由此可见，AD几乎可以合成所有的甾体药物，因此其在市场上极为畅销，目前甾药前体的市场规模位列药物市场第二位。
在甾醇代谢生成AD过程中，微生物可将一分子的β谷甾醇经初步氧化、侧链降解，生成一分子的AD，一分子的乙酰辅酶A和三分子的丙酰辅酶A。为了提高单位时间内甾醇向AD的转化率，通常采用基因工程、诱变等手段，强化微生物的甾醇代谢通路，这使得副产物丙酰辅酶A在胞内过量积累，它的积累会严重抑制丙酮酸脱氢酶等一些与生命相关的关键代谢酶活性，影响菌株活力，从而限制AD的产率，提高了工业化生产成本。
发明内容：
本发明的目的是提供一种降低甾药前体生产菌胞内丙酰辅酶A的方法，并利用该方法构建基因工程菌，从而解决微生物法甾药前体生产过程中，菌株积累丙酰辅酶A导致单位时间内甾醇转化率不高，继而导致甾药前体价格高昂的问题。为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的技术方案之一，是一种高产甾药前体的基因工程菌，是通过在宿主菌中，单一过表达或组合加强AccA1、AccD1、AraC、Nat基因的表达来构建的，通过强化上述基因在甾药前体生产菌中对丙酰辅酶A的代谢能力，进而提高甾醇转化率和生产效率；
所述基因工程菌的宿主菌为具有甾药前体生产能力的细菌或真菌；
所述的具有甾药前体生产能力的细菌或真菌可以是分枝杆菌属微生物或红球菌属微生物；
进一步地，所述分枝杆菌属微生物选自分枝杆菌(Mycobacterium sp.)NRRLB-3683、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)NRRLB-3805、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatism)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)、草分枝杆菌(Mycobacterium Phlei)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)等；
优选地，所述分枝杆菌属微生物为分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3△KsdD(以下简称MNR)。
所述的甾药前体，包括但并不限于雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-dione，AD)、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(Androst-1,4-diene-3,17-dione，ADD)、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione，9α-OH-AD)等羟基化衍生物以及A环降解物等；
进一步地，上述涉及代谢丙酰辅酶A的基因，包括编码丙酰辅酶A羧化酶的AccA1、AccD1基因以及负责调控酰基转移酶表达的转录调控因子AraC基因以及由其调控的编码丙酰辅酶A转移酶的Nat基因：
所述的AccA1、AccD1、AraC、Nat基因均来源于快速生长型新金分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3，编号CICC 21097；
所述AccA1基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
所述AccD1基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
所述AraC基因具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
所述Nat基因具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
优选地，在宿主分枝杆菌MNR中对AccA1和AraC基因进行串联表达，获得高产甾药前体的基因工程菌。
本发明提供的技术方案之二，是技术方案一所述基因工程菌在生产甾体药物前体中的应用；
进一步地，采用所述菌株发酵生产AD的方法如下：
将上述基因工程菌株的种子液按1％-10％的接种量转接于发酵培养基中，在25-37℃，100-200rpm条件下培养24-168h，可获得60％-99％的甾醇摩尔转化率；
进一步地，所述发酵培养基组成为：(NH4)2HPO4 0.1-4g/L，K2HPO4 0.1-3g/L，MgSO40.1-3g/L，柠檬酸铁铵0.01-0.2g/L，柠檬酸1-5g/L，还原糖5-50g/L，甾醇1-50g/L，其余为水，pH 6.0-7.5，高压蒸汽灭菌后使用。
有益效果：
本发明通过在甾药前体生产菌MNR中单独过表达AccA1基因获得菌株MNR M3△KsdD-AccA1(以下简称MNR-A)，在发酵过程中，其最高AD转化率达92.58％，比同期下出发菌株MNR的AD转化率提高了9.62％；通过在MNR中单独过表达AccD1基因获得菌株MNR M3△KsdD-AccD1(以下简称MNR-D)，在发酵过程中，其最高AD转化率达89.18％，比同期下出发菌株MNR的AD转化率提高了6.23％；通过在甾药前体生产菌MNR中单独过表达AraC基因获得菌株MNR M3△KsdD-AraC(以下简称MNR-C)，在发酵过程中，其最高AD转化率达90.68％，比同期下出发菌株MNR的AD转化率提高了7.73％；通过在甾药前体生产菌MNR中单独过表达Nat基因获得菌株MNR M3△KsdD-Nat(以下简称MNR-N)，在发酵过程中，其最高AD转化率达89.25％，比同期下出发菌株MNR的AD转化率提高了6.30％。
同时还发现，MNR-C在抗生素环境中，即使携带外源质粒，其生长效率也可与原始菌株保持一致，而MNR-A虽然具有良好的甾醇转化能力，但其生长效率较慢。综合两者的优势，构建了AccA1-AraC串联基因过表达菌株MNR M3△KsdD-AccA1-AraC(以下简称MNR-AC)，MNR-AC菌株在发酵前期能抵抗AccA1基因过表达对菌株造成的生长负载，并与出发菌株MNR生长效率保持在近似水平。发酵过程中，串联菌株MNR-AC的最高AD转化率可达94.11％，在发酵144h时，其AD产量达到最高，与同期下MNR、MNR-A和MNR-C的AD产量相比，存在显著差异，同时可以达到MNR-A和MNR-C在168h时的产量。综上所述，MNR-AC较其他几株菌高相比，不但提高了其转化速率，且缩短了发酵周期。该效果也说明AraC基因可以与其他过表达基因进行串联表达，降低外源质粒对菌株生长造成的负载，提高菌株活力。这一串联表达系统具有广泛的应用价值，为甾药前体生产成本的降低提供了新方法。
同时本发明以外的发现，串联过表达AccA1-AraC时，能够增强菌株对环境的耐受性，特别是对产物的耐受性，经过试验在不同AD浓度下对菌株MNR-AC的生长进行了测量，发现MNR-AC的生物量在高浓度的甾醇中生物量反而升高，受AD浓度的影响较小，对产物的耐受性比出发菌株MNR有所提高。
附图说明：
图1单基因过表达pMV-261-AccA1质粒模式图及电泳图；
图2单基因过表达pMV-261-AccD1质粒模式图及电泳图；
图3单基因过表达pMV-261-AraC质粒模式图及电泳图；
图4单基因过表达pMV-261-NAT质粒模式图及电泳图；
图5单基因过表达菌株在AD转化过程中胞内丙酰辅酶A含量变化；
图6单基因过表达菌株生长曲线；
图7单基因过表达菌株AD摩尔转化率；
图8串联基因过表达质粒电泳图；
图9串联基因过表达菌株生长曲线；
图10串联基因过表达菌株AD摩尔转化率及产量；
图11过表达菌株和原始菌株耐受性比较。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
本发明所使用的宿主分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3△KsdD，是在新金分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3(编号CICC 21097)的基础上敲除KsdD基因所得。具体菌株构建过程已公开在Rili Xie,Yanbing Shen,Ning Qin,Yibo Wang,Liqiu Su,MinWang.Genetic differences in ksdD influence on the ADD/AD ratio ofMycobacteriumNeoaurum.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2015,42:507-513。其中，菌株MNR M3在该文章中的代号为TCCC 11028M3，与本文中所述的(Mycobacterium sp.)MNR M3，编号CICC 21097为同一株菌。
以下将通过具体实施方式对本发明做进一步地解释说明。
实施例1以AccA1基因为例，详述过表达菌株MNR-A的构建
构建新金分枝杆菌基因过表达质粒，将其电转化入MNR感受态中，利用卡那霉素进行抗性筛选。挑取阳性菌株提取质粒，做单酶切、双酶切、测序验证。序列比对正确的菌即为MNR-A。
具体步骤如下：
1.过表达质粒构建：根据SEQ ID No:1所述AccA1基因序列信息，以(Mycobacterium sp.)MNR M3(编号CICC 21097)基因组为模板，设计AccA1基因PCR引物：
AccA1-f：GCGGATCCAGCTGCAGAATTCATGGTCAA-CGAACTCTTCCACAC；
AccA1-r：TACGTCGACATCGATAAGCTTTCATCGT-TGGGACTCCTTGC。
将目的基因AccA1的PCR产物经纯化试剂盒回收后，与经EcoR I和Hind III双酶切的pMV261线性化载体在体外进行无缝克隆连接，构建过表达质粒pMV261-AccA1。
2.MNR感受态制备：用接种环取一环MNR甘油菌在无抗LB平板上三区划线，30℃培养3d，挑取单菌落至无抗LB试管中，30℃200r/min培养2d，按10％接种量转接到种子培养基(不含碳酸钙)中进行二级种子培养；36h后加入10％甘氨酸(20％)继续培养24h。冰浴预冷，4℃离心收集菌体，分别用1倍、3/4倍、1/2倍和1/4倍发酵液体积的10％预冷甘油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入1/25倍的10％甘油悬浮菌体，并分装保存；
3.电转化：取10μL构建好的AccA1基因过表达质粒pMV261-AccA1，加入到100μL感受态菌体中放置30min后转入电转杯进行电击。电击条件2kV/cm，25μF，720Ω条件下电转4-6ms后冰上放置5min。向电转杯中加入700μL新鲜灭菌LB培养基，混匀，转移至1.5mL灭菌EP管，30℃200rpm进行4h复苏。
4.筛选与验证：将复苏后的菌液浓缩后涂布在含有KanR 20μg/mL的LB固体培养基上培养5d，挑取单菌落，提取质粒后，单酶切、双酶切、测序验证，序列比对完全一致或无意突变的即为获得正确表达AccA1的MNR M3△KsdD-AccA1菌株，以下简称MNR-A菌株。
其他三种单基因过表达菌株的构建方法与AccA1基因过表达菌株的构建方法相同，四种单基因过表达质粒的模式图及电泳图如图1、图2、图3、图4所示，分别在MNR菌株中过表达AccA1、AccD1、AraC、Nat基因，获得菌株MNR M3△KsdD-AccA1(简称MNR-A菌株)、MNRM3△KsdD-AccD1(简称MNR-D菌株)、MNR M3△KsdD-AraC(简称MNR-C菌株)、MNR M3△KsdD-Nat(简称MNR-N菌株)。以CICC 21097基因组为模板，通过PCR获得AccD1、AraC、Nat基因后，构建过表达质粒，并在MNR中表达。构建过程中涉及的相关引物如下：
根据SEQ ID No:2所示AccD1基因序列信息设计AccD1基因PCR引物：
AccD1-f：GCGGATCCAGCTGCAGAATTCATGACGCATCGTGAAGCGC；
ACCD1-R：TACGTCGACATCGATAAGCTTTCA-CATCCTGAAGACGCCGT。
根据SEQ ID No:3所示AraC基因序列信息设计AraC基因PCR引物：
AraC-f：GCGGATCCAGCTGCAGAATTCATGACGCATCGTGAAGCGC；
AraC-R：TACGTCGACATCGATAAGCTTTCA-CATCCTGAAGACGCCGT。
根据SEQ ID No:4所示Nat基因序列信息设计Nat基因PCR引物：
Nat-f：GCGGATCCAGCTGCAG-AATTCATGACCGTCGATGTGGCCG；
Nat-R：TACGTCGACATCGATAAG-CTTTCAGTTCCCCAGCACGCG。
实施例2原始菌MNR与过表达菌株MNR-A/MNR-D/MNR-C/MNR-N在AD转化过程中不同时期胞内丙酰辅酶A含量变化比较
使用高效液相色谱的方法检测胞内丙酰辅酶A含量的变化。原始菌MNR与四种单基因过表达菌株分别接种于发酵培养基中，在发酵培养基生长168h时，每24h取样一次，取1mL发酵液，4℃离心收集菌体，菌体用PBS(pH 8.0)缓冲液洗涤2次，后用细菌裂解液(10％三氯乙酸2mM DTT)重悬，在液氮-冰水中反复冻融4次，使用超声波细胞破碎仪进行破碎(处理总时长5min工作5s停止5s)，破碎后的细胞混合物进行4℃离心，将上清液转移至C18固相萃取柱中，先使用除杂液(1％三氟乙酸)清洗萃取柱，后用洗脱液(1％三氟乙酸，40％乙腈)将柱内的丙酰辅酶A洗脱并收集，收集的液体经过冻干处理后待测。
冻干样品使用100mM乙酸铵和纯乙腈混合物(49:1V/V)复溶，溶解混匀后，离心吸取上清待测。
HPLC条件：使用C18反相色谱柱(4.6×250mm)，柱温25℃，检测样品在260nm处的吸收峰。检测过程使用两种流动相梯度洗脱，即2-12％A(0-5min)，12-38％A(5-15min)，38％A(15-17min)，38-2％A(17-19min)，其中A为乙腈，B为100mM乙酸铵，流速800μL/min，30min停止数据采集。
所述发酵培养基组成为：：(NH4)2HPO4 3.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.4g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇5g/L，其余为水，pH6.8-7.2。
结果如图5所示，发酵周期内，MNR-C菌株胞内丙酰辅酶A含量较MNR具有明显下降，其中96h时差异最明显，较MNR降低了38.6％，同时，其他三种单基因过表达菌株，在甾醇代谢过程中，胞内的丙酰辅酶A含量也有所下降，AraC基因对胞内丙酰辅酶A的降解能力最强。
实施例3单基因过表达菌株的菌株活力及AD转化能力比较
菌株活化及种子制备：将原始菌MNR及四种单基因过表达菌株分别转接于新鲜LB培养基上，30℃培养2d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗菌，吸取lmL洗脱液加入到50mL种子培养基中，在30℃，200rpm条件下摇床培养36h得种子液；
AD生产过程：将步骤1中获得的种子液按5％的接种量分别转接于发酵培养基中，在30℃，140rpm条件下生物转化168h。
所述种子培养基组成：K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 1g/L，其余为水，pH 7.2。
所述发酵培养基组成为：(NH4)2HPO4 3.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.4g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇5g/L，其余为水，pH6.8-7.2。
样品检测：每24h取样一次，取发酵液1mL，加入等体积乙酸乙酯，超声30min。14,000rpm离心10min，吸取100μL上清液，室温干燥后，用80％甲醇重悬样品，超声30min，14,000rpm离心10min，吸取上清，进行HPLC分析。
Agilent l200型色谱仪各项参数设定为：C18(4.6×250mm)色谱柱，柱温30℃；流动相甲醇/水(8:2,V/V)，流速1mL/min，检测波长254nm，进样量10μL，每个样品运行8min。按标准曲线计算AD产量及转化率。
每12h取样一次，取发酵液1mL，检测其在600nM处的吸光度，以此来判断各菌株的生长状况。
结果分析：根据图6结果可知，MNR-C在带有质粒负载的情况下，生长状态与原始菌株MNR相似，这种快速生长能力，对工业生产十分有帮助，发酵初期，菌株生物量越高，对环境中底物甾醇的摄取速度就越快。与其他菌株相比，MNR-A的生长速度却很缓慢，且菌体量很少。
根据图7结果分析，MNR-A的AD摩尔转化率在发酵168h可达92.58％，比同期下出发菌株MNR的AD转化率提高了9.62％，AccA1基因的过表达对菌株转化AD具有促进作用。但在发酵前期，MNR-A菌株几乎无AD生成；MNR-C的AD摩尔转化率始终保持较高水平，在168h时，AD的最高摩尔转化率可达90.67％，较MNR同时期的AD转化率提高了7.73％，而且MNR-C在发酵120h时其AD转化率即可达到MNR在168h的AD转化率，明显缩短发酵周期。
实施例4AccA1-AraC串联基因过表达菌株MNR-AC的构建
构建AccA1-AraC串联基因过表达质粒，将其电转化入MNR感受态中，利用卡那霉素进行抗性筛选。挑取阳性菌株提取质粒，做单酶切、双酶切、测序验证。序列比对正确的菌即为MNR-AC。
具体步骤如下：串联基因过表达质粒构建：根据SEQ ID NO:1所述AccA1基因序列信息设计AccA1基因PCR引物，根据SEQ ID NO:3基因序列信息设计AraC基因PCR引物：
AccA1-f’：GCGGATCCAGCTGCAGAATTCATGGT-CAACGAACTCTTCCACAC；
AccA1-r’：ACCTCTTTTCATCGTTGGGACTCC-TTGC；
AraC-f’：CCCAACGATGAAAAGAGGTGACAGTGAATGCCC；
AraC-r’：TACGTCGACATCGATAAGCTTTCAGTTACCTCTCATCCATTCCAG。
AccA1和AraC的PCR产物经纯化试剂盒回收后，与经EcoR I和Hind III双酶切的pMV261线性化载体在体外进行无缝克隆连接，构建串联基因过表达质粒pMV261-AccA1-AraC。
串联基因过表达菌株的方法同实施例1，构建的AccA1-AraC串联基因过表达质粒电泳图如图8。在MNR中进行AccA1-AraC串联基因过表达后获得的菌株命名为MNR M3△KsdD-AccA1-AraC(简称MNR-AC菌株)。
实施例5AccA1-AraC串联基因过表达菌株MNR-AC菌株活力及AD转化能力比较
菌株活化、种子制备、AD转化过程、样品检测的方法同实施例3。
根据图9、图10结果分析，MNR-AC对改善质粒负载造成的菌株生长缓慢问题具有促进作用。MNR-AC菌株生长能力较MNR-A具有明显提升，菌体量的提升加速了菌株对甾醇的转化，在整个发酵过程中，MNR-AC甾醇转化能力始终优于MNR-A，并且其最高AD转化率可达94.11％，比同期MNR提高了11.16％，在发酵144h时，MNR-AC的AD产量达到最高，与同期下MNR、MNR-A和MNR-C的AD产量相比，存在显著差异，同时可以达到MNR-A和MNR-C在168h时的产量，说明在构建好的基因工程菌中继续串联AraC基因可以达到提高菌株的生长活力的目的，并有机会进一步提高菌株的AD转化能力，缩短转化周期。
实施例6产物耐受性分析
菌株活化、种子制备、样品检测的方法同实施例3。
将原始菌及MNR-AC双基因过表达菌株分别转接于新鲜LB培养基上，30℃培养2d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗菌，吸取lmL洗脱液加入到50mL种子培养基中，在30℃，200rpm条件下摇床培养36h得种子液；
将获得的种子液按5％的接种量分别转接于不含甾醇的发酵培养基中，在30℃，140rpm条件下生物转化48h。
收集菌体，用不含甾醇的发酵培养稀释至OD600＝1，分别加入终浓度为0、3、5g/L的AD，观察其生长24h菌体量的变化。
所述种子培养基组成：K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 1g/L，其余为水，pH 7.2。
所述发酵培养基组成为：(NH4)2HPO4 3.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.4g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，葡萄糖10g/L，其余为水，pH6.8-7.2。
根据图11结果分析，在不同AD浓度下对菌株的生长进行了测量，发现MNR-AC的生物量在高浓度的甾醇中生物量反而升高，受AD浓度的影响较小，对AD的耐受性比出发菌株MNR有所提高，这些指标的变化是MNR-AC生物转化能力增强的原因之一。
综上所述，采用本发明构建的AccA1-AraC串联基因过表达菌株MNR-AC分枝杆菌基因工程菌，可以明显降低菌株胞内丙酰辅酶A水平，解除还原糖培养基中菌株的丙酰辅酶A毒性，提高细胞活力，增强菌株对产物耐受性，缩短工业生产的转化周期，大大提高甾药前体的生产效率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种高产甾药前体的基因工程菌，其特征在于，是通过在宿主菌中，单一过表达或组合加强AccA1、AccD1、AraC、Nat基因的表达来构建的。
2.如权利要求1所述的一种高产甾药前体的基因工程菌，其特征在于，宿主菌为具有甾药前体生产能力的细菌或真菌。
3.如权利要求2所述的一种高产甾药前体的基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌为分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3△KsdD。
4.如权利要求1所述的一种高产甾药前体的基因工程菌，其特征在于，是在宿主分枝杆菌MNR M3△KsdD中对AccA1和AraC基因进行串联表达，获得高产甾药前体的基因工程菌。
5.如权利要求1-4任一所述的高产甾药前体的基因工程菌，其特征在于，所述AccA1基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述AccD1基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述AraC基因具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；所述Nat基因具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
6.权利要求1-5任一所述的高产甾药前体的基因工程菌在生产甾药前体中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，采用所述菌株发酵生产AD的方法如下：
将所述基因工程菌株的种子液按1％-10％的接种量转接于发酵培养基中，在25-37℃，100-200rpm条件下培养24-168h。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成为：
(NH4)2HPO4 0.1-4g/L，K2HPO4 0.1-3g/L，MgSO4 0.1-3g/L，柠檬酸铁铵0.01-0.2g/L，柠檬酸1-5g/L，还原糖5-50g/L，甾醇1-50g/L，其余为水，pH 6.0-7.5，高压蒸汽灭菌后使用。
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