CN115011626B

CN115011626B - 一种产甾药前体的基因工程菌及其用途

Info

Publication number: CN115011626B
Application number: CN202210730036.XA
Authority: CN
Inventors: 张保国; 袁辰阳; 刘相岑; 张静娴; 杜桂林; 韩苏皖; 史吉平
Original assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Current assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Priority date: 2022-06-24
Filing date: 2022-06-24
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2042-06-24
Also published as: CN115011626A

Abstract

本发明公开了一种产甾药前体的基因工程菌和用途。基因的缺失在调控分枝杆菌产甾药前体的产量或改造产甾药前体的分枝杆菌中的用途，所述基因包括编码烯酰辅酶A水合酶的基因和/或3‑甾酮‑Δ¹‑脱氢酶的基因。本发明3‑甾酮‑Δ¹‑脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶在分枝杆菌转化甾醇过程中具有重要的调控作用。同时本发明还构建了一种产甾药前体的基因工程菌，将基因工程菌接种到以甾醇为底物的培养基中发酵，能得到纯度高、产量高的甾药前体9‑OH‑PDCE，其能作为原料合成氢化可的松、地塞米松和倍他米松等甾体药物，因此在工业上具有潜在而广泛的应用价值。

Description

一种产甾药前体的基因工程菌及其用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产甾药前体的基因工程菌及其用途。

背景技术

甾体药物目前被广泛应用于治消炎、抗过敏等多种医疗应用。甾体药物已成为仅次于抗生素的第二大类药物。甾体药物的工业化合成主要有两条技术路线，一条是从黄姜中提取薯蕷皂素，随后经过化学合成，生成双烯中间体，再经化学反应和微生物转化反应，生成诸如黄体酮、氢化可的松等甾体药物。该路线以化学合成为主，其缺点在于线路长、收率低，污染环境和生产成本高。另一条路线是利用微生物直接将植物甾醇转化成不同的甾药前体，例如雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和9α羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)等甾药前体，再经过化学合成制备成目标甾体药物。微生物转化植物甾醇路线因原料来源稳定、反应路线短、收率高、生产成本低且更环保等显著优势，逐渐成为生产甾药前体的主流工艺。

分枝杆菌等微生物具有代谢甾醇等天然固醇的能力，因此通过控制微生物降解甾醇类物质过程中的各种酶的活性，可以获得多种重要的甾药前体。但是，由于甾醇降解是多酶参与的多步反应过程，加之对侧链代谢分子机制的不甚了解，目前也仅有可生产AD、ADD、9α-OH-AD、4-HP和睾酮等少数几个甾药前体的工程菌株被构建，远不能满足行业的需求。

9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯，英文名为9-hydroxy-3-oxo-4,17-pregadiene-20-carboxylic acid methyl ester(简称9-OH-PDCE)，是一种新型的C22类甾药前体。由于9-OH-PDCE的第9位存在羟基基团，C17和C20位间存在双键，并且C17侧链保留了类似皮质类激素的侧链结构，因此，和传统C19类甾药前体(AD和9α-OH-AD等)相比，9-OH-PDCE更适合作为甾药前体用于合成氢化可的松、地塞米松、倍他米松等皮质类激素甾体药物。因此，9-OH-PDCE菌种的开发对促进传统甾药生产体系的革新具有重要意义。但是，目前并没有专门生产9-OH-PDCE的相关菌株，其仅作为微生物甾体发酵过程中的副产物被报道(参见Peng等Angew Chem Int Ed Engl，60(10)(2021)5414-5420；Li等Steroids，132(2018)40-45)。

因此，如何获得高效、专一的可转化甾醇生产9-OH-PDCE的优良菌种成为甾体医药行业的迫切需求。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种产甾药前体的基因工程菌和用途，以期解决现有技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。

本发明的第一方面保护，基因在调控分枝杆菌产甾药前体的产量或改造产甾药前体的分枝杆菌中的用途，所述基因包括编码烯酰辅酶A水合酶的基因和/或3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因。敲除编码烯酰辅酶A水合酶的基因和/或3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因能提高分枝杆菌产甾药前体的产量。

根据本发明的技术方案，所述编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因为如下A1)-A4)中的至少一项；

A1)所述基因为kstd1；所述kstd1的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列；

A2)所述基因为kstd2；所述kstd2的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示序列；

A3)所述基因为kstd3；所述kstd3的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示序列；

A4)与所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的核苷酸。

根据本发明的技术方案，所述编码烯酰辅酶A水合酶的基因为如下B1)或B2)；

B1)所述基因为chsH2；所述chsH2的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.4所示序列；

B2)与所述SEQ ID NO.4所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述烯酰辅酶A水合酶的核苷酸。

根据本发明的技术方案，所述基因还包括编码17β-羟甾脱氢酶和/或酰基辅酶A脱氢酶的基因。过表达编码烯酰辅酶A水合酶的基因和/或3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因能提高分枝杆菌产甾药前体的产量。

优选地，所述编码17β-羟甾脱氢酶的基因为如下C1)或C2)；

C1)所述编码基因为hsd4a；所述hsd4a的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.5所示序列；

C2)与所述SEQ ID NO.5所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述17β-羟甾脱氢酶的核苷酸。

优选地，所述17β-羟甾脱氢酶来源于放线菌。

更优选地，所述放线菌选自红球菌、诺卡氏菌和分枝杆菌中的一种或多种。在某个优选的实施方式中，所述17β-羟甾脱氢酶来源于新金分枝杆菌M.neoaurum DSM 44074。

优选地，所述编码酰基辅酶A脱氢酶的基因为如下D1)-D3)中的至少一项；

D1)所述编码基因为chsE1；所述chsE1的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.6所示序列；

D2)所述编码基因为chsE2；所述chsE2的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.7所示序列；

D3)与所述SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述酰基辅酶A脱氢酶的核苷酸。

优选地，所述酰基辅酶A脱氢酶来源于放线菌。

更优选地，所述放线菌选自红球菌、诺卡氏菌和分枝杆菌中的一种或多种。在某个优选的实施方式中，所述酰基辅酶A脱氢酶来源于新金分枝杆菌Mycobacterium.neoaurumDSM44074。

根据本发明的技术方案，所述甾药前体选自9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯、9-羟基-3-酮-4,17-二烯20-羧基孕甾、9-羟基-3-酮-4烯孕甾-20-羧酸甲酯、9α,21-二羟基-20α-甲基-孕甾-4-烯-3酮和9-羟基-3-酮-4烯20-羧基孕甾中的一种或多种。

优选地，所述甾药前体为9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯。

根据本发明的技术方案，所述分枝杆菌为新金色分枝杆菌。具体为Mycobacterium.neoaurum DSM 44074。

本发明发现敲除分枝杆菌中编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因后，能将植物甾醇代谢为9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)以及9α,21-二羟基-20α-甲基-孕甾-4-烯-3酮(9-OH-4-HP)，但不产生9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯(9-OH-PDCE)；而继续敲除编码烯酰辅酶A水合酶的基因后，能将植物甾醇代谢为9-羟基-3-酮-4,17-二烯20-羧基孕甾(9-OH-PDCA)、9-OH-PECA、9α,21-二羟基-20α-甲基-孕甾-4-烯-3酮(9-OH-4-HP)和9-羟基-3-酮-4烯20-羧基孕甾(9-OH-PECE)，且9-OH-PDCE的产量可达0.60g/L；通过将烯酰辅酶A水合酶回补到敲除烯酰辅酶A水合酶和3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的分枝杆菌中进行回补功能验证，发现烯酰辅酶A水合酶的回补能将植物甾醇代谢为9α-OH-AD以及9-OH-4-HP，而不产生9-OH-PDCE；综合说明，3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶在分枝杆菌转化甾醇过程中具有重要的调控作用，3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶为分枝杆菌产生甾药前体，特别是9-OH-PDCE的关键基因。进一步，本申请发现在敲除烯酰辅酶A水合酶和3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的分枝杆菌中过表达17β-羟甾脱氢酶和/或酰基辅酶A脱氢酶的基因能进一步提高9-OH-PDCE的产量，同时抑制9α,21-二羟基-20α-甲基-孕甾-4-烯-3酮(9-OH-4-HP)和9-羟基-3-酮-4烯20-羧基孕甾(9-OH-PECE)的产生。

本发明的第二方面保护，与如上文所述的用途中的基因相关的生物材料，包括如下中的任一种：

a)多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列中的一种或多种；

b)含有a)所述的核苷酸序列的重组表达载体；

c)含有a)所述的核苷酸序列的工程菌，或含有b)所述的重组表达载体的工程菌；

d)由a)所述的核苷酸序列编码的蛋白质。

本发明的第三方面保护，一种产甾药前体的基因工程菌，所述基因工程菌通过敲除分枝杆菌中编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和/或烯酰辅酶A水合酶的基因获得。

根据本发明的技术方案，所述基因工程菌还包括过表达编码17β-羟甾脱氢酶的基因。

优选地，所述编码17β-羟甾脱氢酶的基因为如下C1)或C2)；

优选地，所述17β-羟甾脱氢酶来源于放线菌。

优选地，所述过表达17β-羟甾脱氢酶是通过将编码17β-羟甾脱氢酶的基因插入质粒甲中，然后导入所述基因工程菌中。

更优选地，所述质粒甲选自pMV306hsp。

根据本发明的技术方案，所述基因工程菌还包括过表达编码酰基辅酶A脱氢酶的基因。

优选地，所述酰基辅酶A脱氢酶来源于放线菌。

优选地，所述过表达酰基辅酶A脱氢酶是通过将编码所述酰基辅酶A脱氢酶的基因插入到质粒乙中，然后导入所述基因工程菌中。

更优选地，所述质粒乙选自pMV306hsp。

根据本发明的技术方案，所述基因工程菌还包括过表达编码17β-羟甾脱氢酶和酰基辅酶A脱氢酶的基因。

本发明的第四方面保护，如上文所述的基因工程菌在制备9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯中的用途。

本发明的第五方面保护，一种9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯的制备方法，包括如下步骤：采用如上文所述的基因工程菌将甾醇转化为9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯。

根据本发明的技术方案，如上文所述的基因工程菌发酵含有甾醇的培养基，得到所述的9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯。

优选地，所述甾醇选自胆固醇或植物甾醇中的一种或两种。

优选地，所述发酵的温度为25～40℃。

更优选地，所述发酵的温度可以为25～32℃，也可以为29～37℃，也可以为36～40℃。在某个优选的实施方式中，为30℃。

优选地，所述发酵的pH为6～8。

更优选地，所述发酵的pH可以为6～7.1，也可以为6.8～7.5，也可以为7.4～8。在某个优选的实施方式中，为7.5。

优选地，所述含有甾醇的发酵培养基包括5～25g/L碳源、5～20g/L氮源、0～1g/L硫酸镁、0～1g/L硝酸铵、0～5g/L柠檬酸、0～5ml/L乳化剂和1～10g/L甾醇。

更优选地，所述乳化剂包括吐温-80和羟丙基β-环糊精。

进一步优选地，所述吐温-80和和甾醇的体积质量比为(1～3)mL：1g。在某个优选的实施方式中为2mL：1g。

进一步优选地，所述羟丙基β-环糊精和甾醇的质量比为(0.5～2)：1。在某个优选的实施方式中为15：1。

优选地，以含有甾醇的培养基的总体积为基准计，所述基因工程菌的接种量为0.05～0.15v/v％。

优选地，所述接种量可以为0.05～0.09v/v％，也可以为0.08～0.12v/v％，也可以为0.09～0.15v/v％。在某个优选的实施方式中，为0.10v/v％。

本发明的第六方面保护，9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯作为原料在制备甾药中的用途。

根据本发明的技术方案，所述甾药选自氢化可的松、地塞米松和倍他米松中的一种或多种。

采用本发明的基因工程菌发酵甾醇，能选择性地降解甾醇的侧链，减少了副产物如9-羟基-3-酮-4,17-二烯20-羧基孕甾(9-OH-PDCA)、9-羟基-3-酮-4烯孕甾-20-羧酸甲酯(9-OH-PECE)、9α,21-二羟基-20α-甲基-孕甾-4-烯-3酮(9-OH-4-HP)和9-羟基-3-酮-4烯20-羧基孕甾(9-OH-PECE)的生成，提高9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯(9-OH-PDCE)的生产效率和品质，且产物易于分离纯化。本发明的基因工程菌发酵甾醇获得的9-OH-PDCE能作为原料来制备氢化可的松、地塞米松、倍他米松等皮质类激素甾体药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明的基因工程菌能够发酵甾醇，抑制副产物9α,21-二羟基-20α-甲基-孕甾-4-烯-3酮(9-OH-4-HP)、9-羟基-3-酮-4-烯-孕甾-20-羧酸甲酯(9-OH-PECE)的产生，促进9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯(9-OH-PDCE)的产生。

2)采用本发明的基因工程菌发酵甾醇，获得的9-OH-PDCE的转化率达到86％以上，纯度达到95％以上。

附图说明

图1显示为本发明的基因工程菌发酵植物甾醇产9-OH-PDCE的示意图。

图2显示为本发明中实施例1至3得到的基因工程菌分别发酵植物甾醇得到的9α-OH-AD产量随时间变化的曲线图。

图3显示为本发明中实施例1至3得到的基因工程菌分别发酵植物甾醇得到的9-OH-4-HP产量随时间变化的曲线图。

图4显示为本发明中实施例2、实施例4、实施例5和实施例6得到的基因工程菌分别发酵植物甾醇得到的9-OH-PDCE产量随时间变化的曲线图。

图5显示为本发明中实施例2、实施例4、实施例5和实施例6得到的基因工程菌分别发酵植物甾醇得到的9-OH-4-HP产量随时间变化的曲线图。

图6显示为本发明中实施例2、实施例4、实施例5和实施例6得到的基因工程菌分别发酵植物甾醇得到的9-OH-PECE产量随时间变化的曲线图。

图7显示为本发明中野生型新金色分枝杆菌、实施例1、实施例2和实施例3得到的基因工程菌分别发酵植物甾醇得到发酵液的液相色谱分析图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

目前，甾体药物行业利用微生物转化的甾药前体大多是C19类甾体，C22类甾体的开发较少，限制了甾体药物行业的发展。本发明提出了一种C22类甾体药物的前体9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯(9-OH-PDCE)的制备方法，采用本发明的基因工程菌，发酵植物甾醇生成9-OH-PDCE，植物甾醇转化为9-OH-PDCE的转化率高达86％以上，9-OH-PDCE的纯度高达90％以上。9-OH-PDCE能作为原料制备氢化可的松、地塞米松、倍他米松等皮质类激素甾体药物。

本发明在研究中意外发现，敲除分枝杆菌中编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因后，能将植物甾醇代谢为9α-OH-AD以及9-OH-4-HP，但不产生9-OH-PDCE；而继续敲除分枝杆菌中编码烯酰辅酶A水合酶的基因后，能将植物甾醇代谢为9-OH-PDCA同时能抑制9-OH-4-HP的产生；通过将烯酰辅酶A水合酶回补到敲除烯酰辅酶A水合酶和3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的分枝杆菌中进行功能验证，发现烯酰辅酶A水合酶的回补能再次将植物甾醇代谢为9α-OH-AD以及9-OH-4-HP，而不产生9-OH-PDCE；说明3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶在分枝杆菌转化甾醇过程中具有重要的调控作用，3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶为分枝杆菌产生甾药前体，特别是9-OH-PDCE的关键基因。进一步，本申请发现在敲除烯酰辅酶A水合酶和3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的分枝杆菌中过表达17β-羟甾脱氢酶和/或酰基辅酶A脱氢酶的基因能进一步提高9-OH-PDCE的产量，同时抑制9-羟基-3-酮-4,17-二烯20-羧基孕甾(9-OH-PDCA)、9-OH-PECA、9α,21-二羟基-20α-甲基-孕甾-4-烯-3酮(9-OH-4-HP)和9-羟基-3-酮-4烯20-羧基孕甾(9-OH-PECE)的产生。

本发明的第一方面，提供了基因在调控分枝杆菌产甾药前体的产量或改造产甾药前体的分枝杆菌中的用途，所述基因为编码烯酰辅酶A水合酶的基因和/或3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因。

作为优选实施方案，所述分枝杆菌为新金色枝杆菌。具体地，为Mycobacterium.neoaurum DSM 44074。本发明中只要具有甾醇代谢途径的分枝杆菌都能作为宿主细胞，不局限于本申请限定的Mycobacterium.neoaurum DSM 44074。

作为优选实施方案，所述甾药前体选自9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯、9-羟基-3-酮-4,17-二烯20-羧基孕甾、9-羟基-3-酮-4烯孕甾-20-羧酸甲酯、9α,21-二羟基-20α-甲基-孕甾-4-烯-3酮和9-羟基-3-酮-4烯20-羧基孕甾中的一种或多种。优选地，所述甾药前体为9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯。

作为优选实施方案，所述编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因的编码基因为kstd1；所述kstd1的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列，或与所述SEQ ID NO.1所示序列具有60％或60％以上同源性，且编码所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的核苷酸。SEQ ID NO.1所示序列如下：

GTGTTCTACATGACTGAACAGGACTACAGTGTCTTTGACGTAGTAGTGGTAGGGAGCGGTGCTGCCGGCATGGTCGCCGCCCTCACCGCCGCTCACCAGGGACTCTCGACAGTAGTCGTTGAGAAGGCTCCGCACTATGGCGGTTCCACGGCGCGATCCGGCGGTGGCGTGTGGATTCCCAACAACGAGGTTCTTCAGCGTGACGGGGTCAAAGACACCGCCGCGGAGGCACGGAAGTACCTGCACGCCATCATCGGCGATGTGGTGCCTGCCGAGAAGATCGACACCTACCTGGACCGCAGTCCGGAGATGTTGTCGTTCGTGCTGAAGAACTCGCCGCTGAAGCTGTGCTGGGTTCCCGGCTACTCCGACTACTACCCGGAGACGCCGGGCGGTAAGGCCACCGGCCGCTCGGTCGAGCCGAAGCCGTTCAACGCCAAGAAGCTCGGTCCCGACGAGAAGGGGCTCGAACCGCCGTACGGCAAGGTGCCGCTGAACATGGTGGTACTGCAACAGGACTATGTCCGGCTCAACCAGCTCAAGCGTCACCCGCGCGGCGTGCTACGCAGCATCAAGGTGGGTGTGCGATCGGTGTGGGCCAACGCCACCGGCAAGAACCTGGTCGGCATGGGCCGGGCGCTCATCGCGCCGCTGCGCATCGGTCTGCAGAAGGCCGGGGTGCCGGTGCTGCTGAACACCGCGCTGACCGACCTGTACATCGAGGACGGGGTGGTGCGCGGAATCTACGTTCGCGAGGCCGGTGCCCCCGAGTCTGCCGAGCCGAAGCTGATCCGGGCCCGCAGGGGCGTGATCCTCGGTTCGGGCGGTTTCGAACACAACCAGGAGATGCGCACCAAGTACCAGCGCCAGCCCATCACCACCGAGTGGACCGTCGGTGCCGTCGCCAACACCGGTGACGGCATCCTGGCAGCCGAAAAGCTGGGTGCGGCACTGGAACTCATGGAGGACGCGTGGTGGGGTCCGACCGTCCCGCTGGAGGGCGCCCCGTGGTTCGCCCTTTCCGAGCGCAACTCCCCCGGGTCGATCATCGTCAACATGAACGGTAAGCGGTTCATGAACGAATCGATGCCCTACGTGGAGGCCTGCCACCACATGTACGGCGGTCAGTACGGCCAGGGCGCCGGGCCGGGCGAGAACGTGCCCGCCTGGATGATCTTCGACCAGCAGTACCGCGATCGCTATATCTTTGCGGGATTGCAACCCGGACAACGCATCCCGAAGAAGTGGATGGAATCGGGCATCATCGTCAAGGCCGATAGCCTGGCCGAGCTGGCCGAGAAGACCGGTGTGGCCGCCGACGCGCTGAAGGCCACCATCGAACGGTTCAACGGTTTCGCACGGTCCGGCGTCGACGAGGACTTCCACCGCGGCGAGAGCGCCTACGACCGCTACTACGGTGATCCGACGAACAAGCCGAACCCGAACCTCGGCGAGATCAAACACGGCCCGTTCTACGCCGCGAAGATGGTGCCCGGTGACCTGGGCACCAAGGGTGGCATCCGCACCGACGTGCACGGCCGGGCGCTGCGCGATGACAATTCGGTGATCGAAGGCCTCTATGCGGCAGGCAATGTCAGCTCGCCGGTGATGGGTCACACCTATCCCGGCCCGGGTGGCACAATCGGGCCCGCCATGACCTTCGGCTACCTCGCCGCATTGCATCTCGCTGGAAAGGCCTGA

作为优选实施方案，所述编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因的编码基因为kstd2；所述kstd2的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示序列，或与所述SEQ ID NO.2所示序列具有60％或60％以上同源性，且编码所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的核苷酸。SEQ ID NO.2所示序列如下：

GTGACCGACCAGAAGAACATCGCCGTCGATCTGCTCGTCGTCGGCTCAGGGACAGGCATGTCGGCGGCACTTGCTGCCCACGAACTGGGGCTCTCGACGTTGATCGTGGAAAAGACCCGGTACGTGGGTGGTTCGACGGCCCGTTCGGGCGGAGCCTTCTGGCTGCCCGGCAGTTCCATCCTCAAGGACAACGGTTCGGCGGACACCGCGGACAGGGCGCGCATCTATCTTGAGGCCCTGGTCGGTGCCGACGCCGCACCCGAACGGTCGCGCACCTTCGTCGACCATATCCCGGCCACCATCGAGATGCTCCGCCGCACGACGCCGTTGAAATTCATGTGGGCCAAGGGTTATTCGGACTATCACCCGGAGCAACCAGGTGGCAGCGCAGTCGGACGTACCTGTGAGTGCCGACCATTCGACACTGCTGTCCTGGGCCCCGAGCTGGCCCGTCTGCGCCCCGGCGTGATGAAGTCATCGTTCCCGATGCCTGTCACCGGCGCCGATTACCGTTGGCTGAACCTGATGGCGCGTACGCCACGCAAGTCCTGGCCGCGGATCATGCTGCGGGCCATGCAGGGTATCGGCGGCTTGGCCCTGCGGCGCCGGTATGCCGCAGGTGGCCAGGCTTTGGCGGCCGGGATGTTCGCCGGCGTGCTGCAGGCCGGGATTCCGGTGTGGACCGACTCGCCGGTGGCCGAGTTGACATACGACGGTGAGCGGGTGACCGGTGCGCTGGTAGAGCGTGAAGGCACCACGGTGACCGTCTCGGCGCGACGCGGCGTGGTCCTCGCCACCGGCGGCTTCGATCATCTGATGAGCTGGCGACACAAGTTTCAGTCGGAGCGCCTCGGCGGGCACTACAGCCTCGGGGCGGAAGGAAACACTGGCGACGGTATCCGACTGGCCCAGAATCTGGGGGCAGGCATCGGGCTGATGGATCAGGCGTGGTGGTTCCCGGCATTCGCGCCGCTGCCCGGGGGCGATCCCGTGGTCATGCTGGCCGAACGTTCATTGCCCGGTTGTCTGTTGGTGGACCAAGACGGCAGACGGTTCATCAATGAGGCCACCGACTACATGTCTTTCGGCCAGCGGGTGCTGCGACGCGAGCAGGCTGGAGACCCCATCGACACGATGTGGATGGTTTTCGATCAGCGCTATCGCAACAGCTACCTGATGGCCGCCGAACTGTTTCCACGGATGCCGATTCCGCAGAGCTGGTACGACGCCGGGATCGCCTACCGCGGCGCCGATCTGGAAGAACTCGCTCGTCAGATCGGGTTGGACTCGGCCACGTTCACCGAAACCATGCACCGATTCAACGGGTTCGCCGACGCCGGTGTGGACACCGACTTCCAGCGCGGGGCCAGTGCGTATGACCGCTACTACGGCGACCCGACGATCATGCCCAATCCGAACCTGCGTCCCCTGGACTCCGGGCCGTTCTACGCGGTCAAGGTAGTTCTGAGTGATCTCGGCACCTGCGGCGGTGTGCAAGCAGACGTCCACGGACAGGTGGTTCGCGAGGACGGCTCGACCATCACAGGCCTCTATGCCATCGGTAATACCGCGGTCAACACGTTCGGTAAGACGTATCCGGGTGCAGGCGCGACCATCGCACAGGGCTTGGTGTACGGCCATATCGCGGCTCACCACGCCGCGGGTCGCTCGGCTTGA

作为优选实施方案，所述编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因的编码基因为kstd3；所述kstd3的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示序列，或与所述SEQ ID NO.3所示序列具有60％或60％以上同源性，且编码所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的核苷酸。SEQ ID NO.3所示序列如下：

ATGTCTGATTCAGATCTCGAGTTCGATGTCATCGTCGCCGGGTCCGGTGGCGGACTTGCCGGCGCCTACACCGCTGCCCGCGAGAATCTTTCGGTGTTGCTCGTGGAGGCCACCGATCTGTTCGGCGGCACCACGTCGTTCTCCGGCGGGGGCGGCATGTGGTTTCCCTGCAACCCCGTGCTCCAGCGCGCAGGCACCGATGACACCATCGACAAGGCGTTGACATATTTTCACGCTGTCGTGGGTGAGCGCACTCCGCGCGAACTCCAAGACGCCTACGTCCGCGGCGGCGCCAAGCTCATCGAGTATCTGGAACAGGATCCGGCCTTCGAGTTCACAGCGCTCCCGTGGCCGGATTACTACGGCACGGCTCCCGAAGCCCGTACCGACGGCTACCGGCACACGATCCCGCTTCCCGTTCCCGATGCGGCCCTCGGCAAGTACGCAGGCCTGGTGCGCGGACCGCTGGACACCGAGCGGCTCGGCGCCGAAGCGCCCGATCTTCTCGTCGGAGGGCGCGCGCTCGTCGGCCGGTTCCTGGCTGCACTGGACAAGCTACCCACCGTCACCTGCTGGTTGAACGCGCCGCTGGTGGACCTGATCACCGAGAACGGACGCGTCGTCGGCGCGGTGATCGAGCGCGACGGCGCTCCGGTGCGGGTCACGACACGTCGCGGCGTGCTCCTGGCCAGCGGTGGATTCGAACAGAACGCCGAGATGCGCGCCGAATACGGCGTACCCGGCCACGCCACGGACTCCATGGGCGGTCCCGGTAGCACCGGCCGCGCGCACCGCGCAGCCATCGCCGTCGGCGCCGATGTCGATCTGATGGACCAGGCCTGGTGGTCACCGGGGATGACCCATCCCGACGGCCGGTCCGCCTTCGCGCTGTGGTTCACCGGCGGCATCTTCGTCAACCAGCAGGGCCGCCGGTTCGTCAACGAATCCGCACCCTACGACCGCATCGGCCGCGACATCATCGATCAGATGCAGAACGGTTCCACCAGATTGCCGTTCTGGATGATCTACGACAACCGCGACGGCGACATTCCCCCCGTCAAAGCCACCAACGTGTCCATGGTCGAGCCCGAGAAATACCGCACGGCAGGTCTGTGGCACAGCGCCGATACGCTGGCCGAGCTCGCCGGGGCAATCGGTGTCCCCGCCGCCGAACTGGAAGCCACCGTGGCGAGATACAACGAACTTGCCGCCACGGGCATCGACGACGACTTCGGCCGCGGCGGCGAGGCGTACGACCGCGCGTTCAGCGGGGGCGAGTCACCGATGGTCCCACTGGACACCCCGCCCTATCACGCGGCGGTCTTCGGGCTGTCCGATCTGGGCACCAAAGGTGGGCTGCGCACCGATACCCACGCCCGGGTGCTCGACGCCGACGGCGCGGCCATCCCCGGTCTGTACGCCGCGGGCAACACGATGGCGGCAGTGTCGGGCACCACCTACCCCGGTGGCGGCAACCCCATCGGCGCGTCGATGTTGTTCAGCCACCTGGCGGCACTGGACATGGCGACACAGAGCTCAGCGGAATGA

作为优选实施方案，所述编码烯酰辅酶A水合酶的基因为chsH2；所述chsH2的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.4所示序列，或与所述SEQ ID NO.4所示序列具有60％或60％以上同源性，且编码所述烯酰辅酶A水合酶的核苷酸。SEQ ID NO.4所示序列如下：

GTGAGCGAACTGCAGGCGGGTATCGAGGCGGTCCTCGCGGCGGGCAGCAGTAGTCCGACCGTGGCGCGCGACCCGGTGAACCAACCCATGATCCATCACTGGGTCGATGCGATCGGGGACAAGAACCCGATCTACGTCGACGCCGAGGCGGCCCGTGCCGCAGGTCATCCGGGTATCGTCGCCCCGCCGGCGATGATCCAGGTGTGGACCATGATGGGGCTGGGGCGTTCCCGCTCCGATGATGATCCGCTCGCCCGCGCCATGAAGCTTTTCGATGACGCCGGTTATGTCGGCGTCGTCGCCACCAACTGCGACCAGACCTATCACCGCTACCTGCAGCCGGGGGAGCAGGTGGCGATGAGTGCGGAGATCGTCGGCATCGTCGGTCCCAAACAGACCGCGCTCGGTGAGGGTTACTTCATCAACCAGAAGATCAGCTGGCATACCGTCGGGGCCGGCGCGGAGGAACTGGTCGCCGAGATGGACTGGCGCATCATGAAGTTCCTGCCGGCAGCCAACGCGGCCAAGACCGAAACGGCCGCGATTCCCGAGGATCTCGATCCCGACAAACTGATGCGGCCGTCCTCGTCGCGTGACACCAAGTTCTTCTGGGATGGCGTCAACGCACACGAACTGCGTATCCAGCGCCGCCCGGACGGGACGCTGCAGCACCCACCGGTCCCCGCGATGTGGGCCGACAAAGACGCACCCGCCGATTATGTCGTCTCCTCCGGGAGGGGCACGGTGTTCAGCTATGTCGTCCACCATGCACCGAAGGTGCCCGGCCGCACGCTGCCCTTCGTGATCGCCCTCGTCGAACTCGAGGAGGGCGTTCGGATGCTCGGCGAGCTGCGTGGGGTGGATCCCGAGCAGGTGAAGATCGGAATGCCGGTCACCGCAACCTATATCGACTTCCCCGACAGTGAGGTCAGCCCGGCCTGGACGTTGTATGCATGGGAGCCGCAAGCATGA

作为优选实施方案，所述基因还包括编码17β-羟甾脱氢酶和/或酰基辅酶A脱氢酶的基因。过表达编码17β-羟甾脱氢酶和/或酰基辅酶A脱氢酶的基因能提高分枝杆菌产甾药前体的产量。

优选地，所述编码17β-羟甾脱氢酶的基因为如下C1)或C2)；

C2)与所述SEQ ID NO.5所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述17β-羟甾脱氢酶的核苷酸。SEQ ID NO.5所示序列如下：

ATGAACGACAACCCGATCGACCTGTCCGGAAAGGTTGCCGTCGTCACCGGCGCGGCCGCCGGCCTGGGCCGGGCCGAGGCGATAGGCCTGGCGCGGGCCGGCGCGACGGTCGTGGTCAACGACATGGCCGGCGCGCTGGACAACTCCGACGTGCTGGCCGAGATCGAAGCGGTCGGGTCCAAGGGCGTCGCGGTCGCCGGTGATATCAGCGCGCGCAGCACCGCCGACGAACTCGTCGAGACAGCCGACCGGCTCGGGGGACTGGGCATCGTGGTGAACAACGCCGGCATCACCCGGGACAAGATGCTGTTCAACATGTCCGACGAGGACTGGGACGCGGTGATCGCCGTGCATCTGCGCGGACACTTCCTGTTGACGCGCAATGCTGCGGCGTACTGGAAGGCGAAGGCCAAGGAGACCGCCGACGGACGGGTGTACGGACGGATCGTCAACACCTCCTCGGAGGCCGGGATCGCCGGACCGGTGGGTCAAGCCAATTACGGTGCCGCCAAGGCCGGTATCACGGCGTTGACGCTGTCGGCGGCGCGCGGGTTGAGCAGGTACGGGGTGCGGGCCAATGCCATCGCACCGCGGGCCCGCACCGCCATGACCGCCGGCGTGTTCGGTGATGCACCGGAGCTGGCGGACGGACAGGTCGATGCCCTCTCGCCGGAGCATGTCGTCACGCTCGTCACCTACCTGTCCTCCCCGGCGTCCGAGGATGTCAACGGGCAGCTGTTCATCGTGTACGGACCGACGGTCACCCTGGTTGCGGCGCCGGTTGCCGCCCACCGGTTCGATGCCGCCGGTGATGCCTGGGACCCCGCGGCGTTGAGCGACACGCTCGGTGACTTCTTTGCTAAAAGGGATCCGAATATTGGGTTCTCCGCAACTGAGCTCATGGGTTCTTGA

优选地，所述17β-羟甾脱氢酶来源于放线菌。更优选地，所述放线菌选自红球菌、诺卡氏菌和分枝杆菌中的一种或多种。在某个优选的实施方式中，所述17β-羟甾脱氢酶来源于新金分枝杆菌M.neoaurum DSM 44074。

D1)所述编码基因为chsE1；所述chsE1的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.6所示序列；D2)所述编码基因为chsE2；所述chsE2的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.7所示序列；

SEQ ID NO.6所示序列如下：

GTGGACTTCACGCCGAAGCCCGAACAGCAGGCCGTCGCCGATGTGGTGACCTCGGTGCTGGAACGGGACAACAGCTGGGACGCACTGGTATCCGGTGGGGTGGCGGCGCTGGCGGTGCCCGAGCGCCTCGGTGGTGACGGGCTCGGACTGCCCGAGATCGCCACCGCGCTCACCGAGATCGGCAGGCGCGGTACGACCGGTGCGGCACTGGCCACGCTGGGTCTCGGGTTGCTGCCGCTGCTGGAGGTGGCCACCGATACCGAACAGGACCGCTATCTCGACGGGGTCGCCGGCGGGGCCGTGTTGTCGGCGGCGCTCAACGAGCCCGGAGTCTCGCTTCCCGAGCGCCCCTCGGTGACCCTGACCGACGGGAAGCTCACCGGAACCAAGATCGGTGTGCCCTATGCCGGCACCGCGCGATGGCTGTTGGTCACCGCGGACGGTGGGGTCGCGGTGATCGCTCCGACCGCGAGTGGGGTGACGCTGACCAAGACGCCGACCTCCAACGGCACCGACGAGTACGTGGTGGTCTTCGACGGCGCCGAGGTGGACGGAGTGCTCGCCAACGCCACGACCCGCCGAGTCAACCAGTTGGTGCTGGCCGCCACCGGAGCCTTCGCCGCGGGCCTGGTCGCCGGCGCGCTGCGACTTACCGCCGATTACGTGGCCACTCGCGAACAGTTCGGGCGTCCGCTGTCGACCTTCCAGACCGTCGCCGCGCAGCTCTCGGATGTCTATATCGCCTCGCGGACAATCGATCTCGCGGCCACGTCGGTGATCTACCGGTTGTCCGAGGGCCTCGATGCCGACGACGATCTGGCGCTGCTGGGCTATTGGATCACCTCGCAGGCGCCGCCGGCGATGCGGTTGTGTCATCATCTGCACGGCGGCATGGGAATGGATATCACCTATCCGATGGATCGGTATTTCTCCTCCATCAAGGACCTCACCCGCTTGCTGGGCGGGCCTGCGTATCGACTGGATCTGGTGGGAGCGTAA

SEQ ID NO.7所示序列如下：

ATGTACATCGAACTGACGCCGGAACAGCGCAAGCTGCAAGACGAATTCCGCGAGTACTTCTCGACGCTCATCACGCCGGAGGAAGCCGCGGCGATGGAGTCCGATCGCCACAACGAGGCCTATCGCGCGGTGATCAAGCGGATGGGCTCGGACGGCAAGCTGGGTGTGGGCTGGCCCAAGGAGTACGGCGGGCTCGGCTTCGGGCCGATCGAGCAGCAGATCTTCATCAACGAGGCCAACCGCGCCGATATCCCGCTGCCGATGGTCACGCTGCAGACGGTGGGCCCCACCCTGCAGGTGCACGGGACCGAACTGCAGAAGAAGAAGTTCCTGCCCGGGATCCTCGCCGGCGAGGTGCATTTCGCGATCGGTTACTCCGAGCCGGAGGCGGGCACCGATCTCGCCTCGCTGCGGACCACCGCGGTGCGCCACGGCGACGAGTACATCGTCAACGGCCAGAAGATGTGGACCACCGGCGCCCACGACGCCGACTACATCTGGCTGGCCTGCCGCACCGATCCGGAAGCCGCCAAGCACAAGGGCATTTCGATCCTGATCGTCGATACCAAGGATCCCGGCTACTCCTGGACGCCGATCATCCTCAGCGATGGGGCACACCACACCAACGCGTCGTATTACAACGACGTCCGGGTGCCCGCCGACATGCTGGTCGGCGAGGAACACGGCGGCTGGAAGCTCATCACGACCCAGCTCAACCACGAGCGCGTCGGGCTTGGCCCGGCCGGACGCATCGCCGGGATCTACGACGAGGTCCACGAGTGGGCGTGCATGCCCGGATCCGATGGTGTCGTGCCGATCGAACAGGACGACGCGCGTCGACTGCTGGCCCAGATCAAATCGATCTGGCGGATCAACGAGTTGCTGAACTGGCAGGTGGCCGCCTCGGGCGAGACCATCGCGGTGGCCGATGCGGCGGCGACGAAGGTCTTCTCCACCGAGCGCATCCAAGAGGTCGGCCGGCTGGCCGAAGAGGTCGTCGGCCGCTACGGCAACCCCGCCGATGCCCACACCGGCAGGCTGCTGGACTGGTTGGACAAGATGACCAAACGCAATCTGGTGATCACCTTCGGTGGCGGCGTCAACGAGGTCATGCGCGAAATGATCGCCGCGTCGGGGTTGAAGGTGCCGAGGGTGACCCGGTGA

优选地，所述酰基辅酶A脱氢酶来源于放线菌。更优选地，所述放线菌选自红球菌、诺卡氏菌和分枝杆菌中的一种或多种。在某个优选的实施方式中，所述酰基辅酶A脱氢酶来源于新金分枝杆菌Mycobacterium.neoaurum DSM 44074。

本发明的另一方面，还提供了与如上文所述的用途中的基因相关的生物材料，包括如下中的任一种：

b)含有a)所述的核苷酸序列的重组表达载体；

d)由a)所述的核苷酸序列编码的蛋白质。

本发明的另一方面，还提供了一种产甾药前体的基因工程菌，所述基因工程菌通过敲除分枝杆菌中编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和/或烯酰辅酶A水合酶的基因获得。

作为优选实施方案，所述基因工程菌还包括过表达编码17β-羟甾脱氢酶的基因。

优选地，所述编码17β-羟甾脱氢酶的基因为hsd4a；所述hsd4a的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.5所示序列，或与所述SEQ ID NO.5所示序列具有60％或60％以上同源性，且编码所述17β-羟甾脱氢酶的核苷酸。

优选地，所述17β-羟甾脱氢酶来源于放线菌。更优选地，所述放线菌选自红球菌、诺卡氏菌和分枝杆菌中的一种或多种。更佳地，所述17β-羟甾脱氢酶来源于新金分枝杆菌Mycobacterium.neoaurum DSM 44074。

更优选地，所述质粒甲选自pMV306hsp。

作为优选实施方案，所述基因工程菌还包括过表达编码酰基辅酶A脱氢酶的基因。

优选地，所述编码酰基辅酶A脱氢酶的基因为chsE1；所述chsE1的核苷酸序列分别包括如SEQ ID NO.6所示序列，或与所述SEQ ID NO.6所示序列具有60％或60％以上同源性，且编码所述酰基辅酶A脱氢酶的核苷酸。

优选地，所述编码酰基辅酶A脱氢酶的基因为chsE2；所述chsE2的核苷酸序列分别包括如SEQ ID NO.7所示序列，或与所述SEQ ID NO.7所示序列具有60％或60％以上同源性，且编码所述酰基辅酶A脱氢酶的核苷酸。

优选地，所述酰基辅酶A脱氢酶来源于放线菌。更优选地，所述放线菌选自红球菌、诺卡氏菌和分枝杆菌中的一种或多种。更佳地，所述酰基辅酶A脱氢酶来源于新金分枝杆菌Mycobacterium.neoaurum DSM 44074。

更优选地，所述质粒乙选自pMV306hsp。

作为更优选实施方案，所述基因工程菌通过敲除编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的3个基因kstd1、kstd2和kstd3和编码烯酰辅酶A水合酶的基因chsH2获得。

作为更优选实施方案，所述基因工程菌通过敲除编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的3个基因kstd1、kstd2和kstd3和编码烯酰辅酶A水合酶的基因chsH2同时过表达编码17β-羟甾脱氢酶的基因hsd4a获得。

作为更优选实施方案，所述基因工程菌通过敲除编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的3个基因kstd1、kstd2和kstd3和编码烯酰辅酶A水合酶的基因chsH2同时过表达编码酰基辅酶A脱氢酶的基因chsE2、chsE2获得。

作为更优选实施方案，所述基因工程菌通过编码敲除3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的3个基因kstd1、kstd2和kstd3和编码烯酰辅酶A水合酶的基因chsH2同时过表达编码17β-羟甾脱氢酶的基因hsd4a和编码酰基辅酶A脱氢酶的基因chsE2、chsE2获得。

本发明的另一方面，还提供了如上文所述的基因工程菌在9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯中的用途。

本发明的另一方面，还提供了一种9-羟基-3-酮-4，17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯的制备方法，包括如下步骤：采用如上文所述的基因工程菌将甾醇转化为9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯。

作为优选实施方案，如上文所述的基因工程菌发酵含有甾醇的培养基，得到所述的9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯。

优选地，所述甾醇选自胆固醇或植物甾醇中的一种或两种。

更优选地，所述甾醇为植物甾醇。所述植物甾醇选自β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇一种或多种。较佳地，所述植物甾醇为β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇的混合物。具体地，所述β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇的质量比为45：37：18。

优选地，所述发酵的温度为25～40℃。更优选地，为30～37℃。在某个优选的实施方式中，为30℃。

优选地，所述发酵的时间为70～200h。更优选地，为120～200h。在某个优选的实施方式中，为168h。

优选地，所述发酵的pH优选为6～8。更优选地，为7～8。在某个优选的实施方式中，为7.5。

优选地，先将所述基因工程菌接入种子培养基中培养，得到种子培养液；然后将所述种子培养液接种至含有甾醇的培养基中发酵，得到所述的9-羟基-3-酮-4，17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯。

更优选地，所述种子培养基包括0.6g/L磷酸氢二钾、5.4g/L硝酸钠、6g/L葡萄糖和15g/L酵母提取物；所述种子培养基的pH值为7.5。

进一步优选地，所述培养的温度为30℃。

进一步优选地，所述培养的时间为48h。

更优选地，所述含有甾醇的发酵培养基包括5～25g/L碳源、5～20g/L氮源、0～1g/L硫酸镁、0～1g/L硝酸铵、0～5g/L柠檬酸、0～5ml/L乳化剂和1～10g/L甾醇。

进一步优选地，所述乳化剂包括吐温-80和羟丙基β-环糊精。

更进一步优选地，所述吐温-80和和甾醇的体积质量比为(1～3)mL：1g。在某个优选的实施方式中为2mL：1g。

更进一步优选地，所述羟丙基β-环糊精和甾醇的质量比为(0.5～2)：1。在某个优选的实施方式中为15：1。

进一步优选地，所述发酵的温度为30℃。

进一步优选地，所述培养的时间为168h。

进一步优选地，所述碳源选自葡萄糖、甘油和柠檬酸中的一种或多种。

进一步优选地，所述氮源选自玉米浆、酵母膏和磷酸氢二铵中的一种或多种。

进一步优选地，所述乳化剂选自吐温-80和羟丙基β-环糊精中的一种或两种。

优选地，所述发酵培养基为20g/L葡萄糖、12g/L磷酸氢二铵、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.5g/L、硝酸钠0.5g/L、柠檬酸3g/L、吐温-80 2mL/L、1.5g/L羟丙基-β-环糊精和1g/L植物甾醇；所述发酵培养基的pH值为7.5。

本发明的另一方面，还提供9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯作为原料在制备甾药中的用途。

作为优选实施方案，所述甾药选自氢化可的松、地塞米松和倍他米松中的一种或多种。

本发明所提供的基因工程菌株能选择性地将植物甾醇转化为9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯(9-OH-PDCE)，并能减少了副产物如9-羟基-3-酮-4,17-二烯20-羧基孕甾(9-OH-PDCA)、9-羟基-3-酮-4烯孕甾-20-羧酸甲酯(9-OH-PECE)、9α,21-二羟基-20α-甲基-孕甾-4-烯-3酮(9-OH-4-HP)和9-羟基-3-酮-4烯20-羧基孕甾(9-OH-PECE)的产生，9-OH-PDCE的产量可达到0.78g/L植物甾醇。采用本发明的基因工程菌提高了9-OH-PDCE的生产效率和纯度，且易于分离纯化。

下述实施例中的野生型新金色分枝杆菌Mycobacterium.neoaurum DSM 44074记载于文献“A new species of rapidly growing,scotochromogenic mycobacteria,Mycobacterium neoaurum Tsukamura n.sp.(Japanese)，M Tsukamura，1972”中，是一株非病原菌，遗传背景清楚，传代时间短，容易培养且培养基原料低廉。公众可从德国微生物菌种保藏中心DSMZ获得(DSM No.：44074，Type strain)，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pCR-Hyg质粒购买于Addgene公司(#158708)。

pMV306-hsp质粒购买于Addgene公司(#26155)。

pSBY1_FnCpf1cg质粒购买于Addgene公司(#104622)。

实施例1

本实施例中，以野生型新金色分枝杆菌Mycobacterium.neoaurum DSM 44074(简记为DSM 44074)为出发菌株，对其采用CRISPR-Cas12a基因编辑技术，敲除出发菌株中编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因kstd1、kstd2和kstd3，使得3-甾酮-Δ¹-脱氢酶失活，得到基因工程菌Δkstd。编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因kstd1、kstd2和kstd3的核苷酸序列分别如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

以出发菌株Mycobacterium.neoaurum DSM 44074的基因组为模板进行PCR扩增，按照以下构建方法，对kstd1、kstd2、kstd3进行连续组合敲除得到基因工程菌Δkstd。下面以kstd1为例子构建获得改造菌株Δkstd1，包括如下步骤：

1.1挑取Mycobacterium.neoaurum DSM 44074单克隆细胞接种于10mL培养基中，30℃培养48小时后，取1mL种子接种于50mL培养基中30℃培养6h。4℃，7000rp m离心7min收集菌体细胞，用10％的甘油重悬菌体细胞，于4℃和7000rpm离心7mi n清洗菌体细胞，重复三次后，用2mL 10％的甘油重悬经清洗后的菌体细胞，得到Mycobacterium.neoaurum DSM44074感受态细胞。

1.2将pSBY1_FnCpf1cg质粒转入步骤1.1中的Mycobacterium.neoaurum DSM44074感受态细胞中于30℃培养4h，在卡那霉素抗性平板(50μg/mL)上涂布，培养72h后，挑取单克隆，获得表达dCas12a的Mycobacterium.neoaurum DSM 44074感受态细胞。

1.3在kstd1基因上选取TTTN下游25个碱基作为crRNA(详见SEQ ID No.8)，以pCR-Hyg质粒为模板，用K1-Pam-F/R引物(详见SEQ ID No.9和10)扩增，得到扩增片段，将扩增片段经同源重组连接后转入E.coli DH5α感受态细胞中，37℃下培养1h后涂布于潮霉素抗性LB平板，24h后挑取单克隆。

1.4对步骤1.3的单克隆用pCR-Hyg-F/R引物(详见SEQ ID No.11和12)扩增，得到的片段送测序。经测序正确的单克隆，转入3mL LB培养基中培养24h并抽提质粒，得到重组质粒pCR-Hyg-KstD1。

1.5然后将步骤1.4得到的100ng重组质粒pCR-Hyg-KstD1，转入步骤1.2的表达dCas12a的Mycobacterium.neoaurum DSM 44074感受态细胞中，30℃培养4h，在卡那霉素(50μg/mL)、潮霉素抗性平板(100μg/mL)上涂布，培养72h后，用K1-F/R(详见SEQ ID No.13和14)引物扩增，得到与野生型kstd1大小不一致的片段送测序，确认片段缺失后，获得了kstd1失活菌株。

1.6将步骤1.5得到的kstd1失活菌株在37℃下培养并传代，得到无抗性质粒的改造菌株Δkstd1。

1.7依次以kstd2、kstd3为模板，参考步骤1.1中感受态细胞的制作方法，重复2)至6)的步骤，在步骤1.6的改造菌株Δkstd1上对kstd2、kstd3进行连续敲除，得到基因工程菌，命名为Δkstd。

对于kstd1：

crRNA-kstd1：5’CGGGATTGCAACCCGGACAACGCAT 3’(SEQ ID No.8)

K1-Pam-F：5’CGGGATTGCAACCCGGACAACGCATGTCTAAGAACTTTAAATAATTTCTACTGTTGTAGATATCGACTGCCAGGCATCAAA 3’(SEQ ID No.9)

K1-Pam-R：5’ATGCGTTGTCCGGGTTGCAATCCCGATCTACAACAGTAGAAATTATTTAAAGTTCTTAGACCCGTTTTTGCCTAAATCAGC 3’(SEQ ID No.10)

pCR-Hyg-F：5’CGCCAGCAACGCGGCCTTTT 3’(SEQ ID No.11)

pCR-Hyg-R：5’GACCTCTATTCACAGGGTACGGG 3’(SEQ ID No.12)

K1-F：5’TAGTAGTGGTAGGGAGCGGT 3’(SEQ ID No.13)

K1-R：5’TCAGGCCTTTCCAGCGAGAT 3’(SEQ ID No.14)

对于kstd2：

crRNA-kstd2：5’GCGGCCGGGATGTTCGCCGGCGTGC 3’(SEQ ID No.15)

K2-Pam-F：5’GCGGCCGGGATGTTCGCCGGCGTGCGTCTAAGAACTTTAAATAATTTCTACTGTTGTAGATATCGACTGCCAGGCATCAAA 3’(SEQ ID No.16)

K2-Pam-R：5’GCACGCCGGCGAACATCCCGGCCGCATCTACAACAGTAGAAATTATTTAAAGTTCTTAGACCCGTTTTTGCCTAAATCAGC 3’(SEQ ID No.17)

pCR-Hyg-F：5’CGCCAGCAACGCGGCCTTTT 3’(SEQ ID No.11)

pCR-Hyg-R：5’GACCTCTATTCACAGGGTACGGG 3’(SEQ ID No.12)

K2-F：5’CGACCAGAAGAACATCGCCG 3’(SEQ ID No.18)

K2-R：5’GGCGTGGTGAGCCGCGATAT 3’(SEQ ID No.19)

对于kstd3：

crRNA-kstd3：5’ACGGGGGGAATGTCGCCGTCGCGGT 3’(SEQ ID No.20)

K3-Pam-F：5’ACGGGGGGAATGTCGCCGTCGCGGTGTCTAAGAACTTTAAATAATTTCTACTGTTGTAGATATCGACTGCCAGGCATCAAA 3’(SEQ ID No.21)

K3-Pam-R：5’ACCGCGACGGCGACATTCCCCCCGTATCTACAACAGTAGAAATTATTTAAAGTTCTTAGACCCGTTTTTGCCTAAATCAGC 3’(SEQ ID No.22)

pCR-Hyg-F：5’CGCCAGCAACGCGGCCTTTT 3’(SEQ ID No.11)

pCR-Hyg-R：5’GACCTCTATTCACAGGGTACGGG 3’(SEQ ID No.12)

K3-F：5’GAGTTCGATGTCATCGTCGC 3’(SEQ ID No.23)

K3-R：5’TCATTCCGCTGAGCTCTGTG 3’(SEQ ID No.24)

实施例2

本实施例中，以野生型新金色分枝杆菌Mycobacterium.neoaurum DSM 44074为出发菌株，对其进行采用CRISPR-Cas12a基因编辑技术，敲除出发菌株中烯酰辅酶A水合酶β亚基的编码基因chsH2，使得烯酰辅酶A水合酶失活，得到基因工程菌ΔkstDΔchsH2。包括如下步骤：

烯酰辅酶A水合酶β亚基的编码基因chsH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

以出发菌株Mycobacterium.neoaurum DSM 44074的基因组为模板进行PCR扩增，按照以下方法构建失活chsH2的菌株，得到基因工程菌ΔkstDΔchsH2。包括如下步骤：

2.1将pSBY1_FnCpf1cg质粒转入实施例1构建获得的基因工程菌Δkstd中，于30℃培养4h，在卡那霉素抗性平板(50μg/mL)上涂布，培养72h后，挑取单克隆，获得表达dCas12a的Δkstd。

2.2在chsH2基因上选取TTTN下游25个碱基作为crRNA(SEQ ID NO.25)，以pCR-Hyg质粒为模板，用ChsH2-Pam-F/R引物(详见SEQ ID No.26和27)扩增，得到的扩增片段经同源重组连接后转入E.coli DH5α感受态细胞中，37℃下培养1h后，涂布于潮霉素抗性平板，24h后挑取单克隆。

2.3用pCR-Hyg-F/R引物(详见SEQ ID No.11和12)扩增，得到的片段送测序。测序正确的单克隆，转入3mL LB培养基中培养24h并抽提质粒，得到重组质粒pCR-Hyg-ChsH2。

2.4然后将本实施例中步骤2.3的100ng重组质粒pCR-Hyg-ChsH2转入本实施例中步骤2.1中表达dCas12a的Δkstd中，30℃培养4h，在卡那霉素、潮霉素抗性平板上涂布，培养72h后，用ChsH2-F/R引物(详见SEQ ID No.28和29)扩增，得到与野生型chsH2大小不一致的片段送测序，确认片段缺失后，获得了chsH2失活的菌株。

2.5将本实施例步骤2.4得到的chsH2失活的菌株在37℃下培养并传代，可得到无抗性质粒的基因工程菌，命名为ΔkstdΔchsH2。

对于chsH2：

crRNA-chsH2：5’TCGGGATCGAGATCCTCGGGAATCG 3’(SEQ ID NO.25)

ChsH2-Pam-F：5’TCGGGATCGAGATCCTCGGGAATCGGTCTAAGAACTTTAAATAATTTCTACTGTTGTAGATATCGACTGCCAGGCATCAAA 3’(SEQ ID No.26)

ChsH2-Pam-R：5’CGATTCCCGAGGATCTCGATCCCGAATCTACAACAGTAGAAATTATTTAAAGTTCTTAGACCCGTTTTTGCCTAAATCAGC 3’(SEQ ID No.27)

pCR-Hyg-F：5’CGCCAGCAACGCGGCCTTTT 3’(SEQ ID No.11)

pCR-Hyg-R：5’GACCTCTATTCACAGGGTACGGG 3’(SEQ ID No.12)

ChsH2-F：5’GTGAGCGAACTGCAGGCGGG 3’(SEQ ID No.28)

ChsH2-R：5’CATGGGAGCCGCAAGCATGA 3’(SEQ ID No.29)

实施例3

本实施例中，构建烯酰辅酶A水合酶β亚基过表达质粒，电转化至实施例2获得的ΔkstdΔchsH2菌株中获得3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶敲除并回补烯酰辅酶A水合酶β亚基的菌株，命名为基因工程菌ΔkstDΔchsH2+chsH2。

3.1构建烯酰辅酶A水合酶β亚基过表达质粒

烯酰辅酶A水合酶编码基因chsH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在pMV306hsp质粒上的NdeI限制性酶切位点上用特异性酶NdeI切开，将环状的质粒线性化，得到线性化pMV306hsp质粒。

以新金分枝杆菌Mycobacterium.neoaurum DSM 44074菌株为出发菌株，采用pMV306hsp-ChsH2-F/R引物(详见SEQ ID No.30和31)进行PCR扩增，获得目的基因片段chsH2。

根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒(商业产品)中的操作步骤，将扩增出的目的基因片段chsH2与线性化pMV306hsp质粒连接成环，得到重组产物。

将重组产物转入DH5α感受态细胞中，构建得到含有pMV306hsp-ChsH2质粒的DH5α细胞。

pMV306hsp-ChsH2-F：ATTAAGAAGGAGATATACATATGAGCGAACTGCAGGCGGG(SEQ IDNo.30)

pMV306hsp-ChsH2-R：CATGGGAGCCGCAAGCATGAGCTCAG(SEQ ID No.31)

3.2基因工程菌ΔkstDΔchsH2+chsH2的构建

按照质粒抽提试剂盒的方法将pMV306hsp-ChsH2质粒从含有pMV306hsp-ChsH2质粒的DH5α细胞中提取，然后电转入实施例2中ΔkstdΔchsH2菌株感受态细胞中(感受态细胞制作方法参考实施例1中步骤1.1)，获得3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶失活并回补烯酰辅酶A水合酶β亚基的基因工程菌，命名为ΔkstDΔchsH2+chsH2。

实施例4

本实施例中，构建17β-羟甾脱氢酶过表达质粒，电转化至实施例2获得的ΔkstdΔchsH2菌株中获得3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶敲除并17β-羟甾脱氢酶过表达的菌株，命名为基因工程菌ΔkstDΔchsH2-hsd4a。

4.1构建17β-羟甾脱氢酶过表达质粒

17β-羟甾脱氢酶的编码基因hsd4a的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

以新金分枝杆菌Mycobacterium.neoaurum DSM 44074菌株为模板，采用pMV306hsp-Hsd4A-F/R引物(详见SEQ ID No.32和33)进行PCR扩增，获得目的基因片段hsd4a。

根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒(商业产品)中的操作步骤，将扩增出的目的基因片段hsd4a与线性化pMV306hsp质粒连接成环，得到重组产物。

将重组产物转入DH5α感受态细胞中，构建得到含有pMV306hsp-Hsd4A质粒的DH5α细胞。

pMV306hsp-Hsd4A-F：ATTAAGAAGGAGATATACATATGAACGACAACCCGATCGa(SEQ IDNo.32)

pMV306hsp-Hsd4A-R：TTATCGATGAATTCGGATCCTCAAGAACCCATGAGCTCAG(SEQ IDNo.33)

4.2基因工程菌ΔkstDΔchsH2-hsd4a的构建

按照质粒抽提试剂盒的方法将pMV306hsp-Hsd4A质粒从含有pMV306hsp-Hsd4A质粒的DH5α细胞中提取，然后电转入实施例2中ΔkstdΔchsH2菌株感受态细胞中(感受态细胞制作方法参考实施例1中步骤1.1)，获得3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶失活并17β-羟甾脱氢酶过表达的基因工程菌，命名为ΔkstDΔchsH2-hsd4a。

实施例5

本实施例中，构建酰基辅酶A脱氢酶过表达质粒，电转化至实施例2获得的基因工程菌ΔkstdΔchsH2中获得3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶敲除并酰基辅酶A脱氢酶过表达的菌株，命名为基因工程菌ΔkstDΔchsH2-chsE1-chsE2。

5.1构建酰基辅酶A脱氢酶过表达质粒

酰基辅酶A脱氢酶的编码基因chsE1和chsE2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQID NO.7所示。

以新金分枝杆菌Mycobacterium.neoaurum DSM 44074菌株为模板，以pMV306hsp-ChsE12-F/R引物(详见SEQ ID No.34和35)进行PCR扩增，获得目的基因片段chsE1、chsE2。

根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒(商业产品)中的操作步骤，将扩增出的目的基因片段chsE1、chsE2与线性化pMV306hsp质粒连接成环，得到重组产物。

将重组产物转入DH5α感受态细胞中，构建得到含有pMV306hsp-ChsE1-ChsE2质粒的DH5α细胞。

pMV306hsp-ChsE12-F：ATTAAGAAGGAGATATACATATGGACTTCACGCCGAAGCC(SEQ IDNo.34)

pMV306hsp-ChsE12-R：TTATCGATGAATTCGGATCCTCACCGGGTCACCCTCGGCA(SEQ IDNo.35)

5.2基因工程菌ΔkstDΔchsH2-chsE1-chsE2的构建

按照质粒抽提试剂盒的方法，将pMV306hsp-ChsE1-ChsE2质粒从含有pMV306hsp-ChsE1-ChsE2质粒的DH5α细胞中提取，然后电转入实施例2的基因工程菌ΔkstdΔchsH2中(感受态制作方法参考实施例1中步骤1.1)，获得的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶失活并酰基辅酶A脱氢酶过表达的菌株，命名为基因工程菌ΔkstDΔchsH2-chsE1-chsE2。

实施例6

本实施例中，构建17β-羟甾脱氢酶和酰基辅酶A脱氢酶过表达质粒，电转化至实施例2获得的基因工程菌ΔkstdΔchsH2中，得到3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶敲除并17β-羟甾脱氢酶和酰基辅酶A脱氢酶过表达的菌株，命名为基因工程菌Δkst DΔchsH2-hsd4a-chsE1-chsE2。

6.1构建17β-羟甾脱氢酶和酰基辅酶A脱氢酶过表达质粒

将实施例4得到的pMV306hsp-ChsE1-ChsE2质粒的HindⅢ限制性酶切位点上用特异性酶HindⅢ切开，得到线性化pMV306hsp-ChsE1-ChsE2质粒。

以实施例3得到的pMV306hsp-Hsd4A质粒为模板，采用pMV306hsp-Hsd4A-Chs E12-F/R引物(详见SEQ ID No.36和SEQ ID No.37)进行PCR扩增，获得目的基因片段hsd4a。

根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒(商业产品)中的操作步骤，将扩增出的目的基因片段hsd4a与线性化pMV306hsp-ChsE1-ChsE2质粒连接成环，得到重组产物。

将重组产物转入DH5α感受态细胞中，构建得到含有pMV306hsp-ChsE1-ChsE2-Hsd4A质粒的DH5α细胞。

pMV306hsp-Hsd4A-ChsE12-F：CCGAATTCATCGATAAGCTTGGATCGTCGGCACCGTCACG(SEQID No.36)

pMV306hsp-Hsd4A-ChsE12-R：GGTGCGAAGTGATTCCTCCGTCAAGAGCCCATGAGCTCGG(SEQID No.37)

6.2基因工程菌ΔkstDΔchsH2-hsd4a-chsE1-chsE2的构建

按照质粒抽提试剂盒的方法将pMV306hsp-ChsE1-ChsE2-Hsd4A质粒从含有pMV306hsp-ChsE1-ChsE2-Hsd4A质粒的DH5α细胞中提取，然后电转入实施例2中基因工程菌ΔkstDΔchsH2(感受态细胞的制作方法参考实施例1中步骤1.1)中，获得3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶失活并17β-羟甾脱氢酶和酰基辅酶A脱氢酶过表达的菌株，命名为基因工程菌ΔkstDΔchsH2-hsd4a-chsE1-chsE2。

应用例

利用野生型新金色分枝杆菌Mycobacterium.neoaurum DSM 44074、实施例1得到的基因工程菌Δkstd、实施例2得到的基因工程菌ΔkstDΔchsH2、实施例3得到的基因工程菌ΔkstDΔchsH2-hsd4a、实施例4得到的基因工程菌ΔkstDΔchsH2-chsE1-chsE2、实施例5得到的基因工程菌ΔkstDΔchsH2-hsd4a-chsE1-chsE2分别接种于含有植物甾醇的培养基中，进行发酵。包括如下：

1)接种和发酵

将实施例1-6中获得的基因工程菌取单克隆分别接种于10mL种子培养基中培养48h后，得到种子培养液；然后将种子培养液以10％接种量转接到250mL挡板锥形瓶于30℃恒温发酵培养168h，收集发酵液，锥形瓶转速200转每分钟，锥形瓶中含有30mL发酵培养基。

同时，设立对照组，对照组与实施例1-5不同点在于接种新金分枝杆菌DSM 44074而不接种基因工程菌，其余发酵条件、接种量、培养基均相同。

种子培养基组分为：磷酸氢二钾0.6g/L，硝酸钠5.4g/L，葡萄糖6g/L，酵母提取物15g/L，pH 7.5。

发酵培养基组分为：磷酸氢二铵12g/L,葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，硝酸钠0.5g/L，柠檬酸3g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，吐温-80 2ml/L，1g/L植物甾醇(包括45％β-谷甾醇、37％菜油甾醇、18％豆甾醇)，pH 7.5。

2)测定发酵液中组分

在发酵0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h时，各取2mL的发酵液，采用液相色谱法测定发酵液中各组分，并计算发酵液中各组分含量，并计算各物质的转化率。液相色谱法参考“Production of 9,21-dihydroxy-20-methylpregna-4-en-3-one fromphytosterols in Mycobacterium neoaurum by modifying multiple genes and improving the intracellular environment，Chen-YangYuan et al，Microbial CellFactories，202120:229”。

转化率＝实际收率/理论收率。

液相色谱法测定，采用安捷伦XDB-C18色谱柱对发酵液组分进行分离，利用紫外检测器检测。流动相75％甲醇水溶液，流速0.8mL/min。发酵液中各物质的液相色谱分析图见图7。

相关物质出峰时间如下：

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)的出峰时间为4.0min。

9-羟基-3-酮-4,17-二烯20-羧基孕甾(9-OH-PDCA)的出峰时间为4.2min；

9-羟基-3-酮-4-烯20-羧基孕甾(9-OH-PECA)的出峰时间为4.5min；

9α,21-二羟基-20α-甲基-孕甾-4-烯-3酮(9-OH-4-HP)的出峰时间为9.8min；

9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯(9-OH-PDCE)的出峰时间为13.2min；

9-羟基-3-酮-4烯孕甾-20-羧酸甲酯(9-OH-PECE)的出峰时间为14.1min；

新金分枝杆菌和实施例1-5的基因工程菌发酵植物甾醇的主产物9-OH-PDCE的纯度和转化率结果见表3。

新金分枝杆菌和实施例1-5的基因工程菌发酵植物甾醇的副产物产量结果见表4。

表3(1g/L植物甾醇)

表4(1g/L植物甾醇)

从表3和表4可知，野生型新金分枝杆菌Mycobacterium.neoaurum DSM 44074发酵植物甾醇不生产甾体代谢物，其将植物甾醇代谢为二氧化碳与水。

从表3和表4可知，采用实施例1得到的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶失活的基因工程菌Δkstd，则将植物甾醇代谢为9α-OH-AD以及9-OH-4-HP，9-OH-PDCE的产量为0。

从表3和表4可知，采用实施例2得到的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶失活的基因工程菌ΔkstDΔchsH2，则将植物甾醇代谢为9-OH-PDCA、9-OH-PECA、9-OH-4-HP、9-OH-PDCE以及9-OH-PECE；其中9-OH-PDCE为主要产物，其产量可达到0.60g/L；与实施例1得到基因工程菌Δkstd相比，其能提高9-OH-PDCE的产量同时抑制9α-OH-AD的产生。

从表3和表4可知，实施例3中将烯酰辅酶A水合酶β亚基回补已敲除3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶，则将植物甾醇代谢为9α-OH-AD以及9-OH-4-HP，而不产生9-OH-PDCE。

从表3表4可知，采用实施例4得到的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶失活同时17β-羟甾脱氢酶过表达的基因工程菌ΔkstDΔchsH2-hsd4a，则将植物甾醇代谢为9-OH-PDCA、9-OH-PECA、9-OH-4-HP、9-OH-PDCE以及9-OH-PECE；其中9-OH-PDCE为主要产物，其产量为0.67g/L；但仍有产生较多9-OH-PECE，产量为0.17g/L；与实施例3的基因工程菌相比，能显著降低副产物9-OH-4-HP的产生。

从表3和表4可知，采用实施例5得到的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶失活同时酰基辅酶A脱氢酶过表达的基因工程菌ΔkstDΔchsH2-chsE1-chsE2，则将植物甾醇代谢为9-OH-PDCA、9-OH-PECA、9-OH-4-HP、9-OH-PDCE以及9-OH-PECE；其中9-OH-PDCE为主要产物，其产量为0.72g/L；副产物9-OH-4-HP和9-OH-PECE的产量分别为0.08g/L和0.03g/L；与实施例4的基因工程菌相比，能显著降低副产物9-OH-PECE的产生，降低至产量为0.03g/L。

从表3和表4可知，采用实施例6得到的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶敲除并17β-羟甾脱氢酶和酰基辅酶A脱氢酶过表达的基因工程菌ΔkstdΔchsH2-hsd4a-chsE1-chsE2，则将植物甾醇代谢为9-OH-PDCA、9-OH-PECA、9-OH-4-HP、9-OH-PDCE以及9-OH-PECE；其中9-OH-PDCE为主要产物，其产量为0.78g/L；副产物9-OH-4-HP和9-OH-PECE的产量分别降低至0.04g/L和0.02g/L；与实施例2的基因工程菌相比，能进一步提高主产物9-OH-PDCE的产量(P＜0.05)，同时显著降低副产物9-OH-4-HP和9-OH-PECE的产生。

图2为本应用例中的实施例1、实施例2和实施例3得到的基因工程菌发酵植物甾醇得到的9α-OH-AD产量随时间变化的曲线图。

图3为本应用例中的实施例1、实施例2和实施例3得到的基因工程菌发酵植物甾醇得到的9-OH-4-HP产量随时间变化的曲线图。

从图2和图3可知，回补了烯酰辅酶A水合酶β亚基chsH2的菌株不再积累9-OH-PDCE，将甾醇转化为9α-OH-AD与9-OH-4-HP。

图4为本应用例中的实施例实施例2、实施例4、实施例5和实施例6得到的基因工程菌发酵植物甾醇得到的9-OH-PDCE产量随时间变化的曲线图。

图5为本应用例中的实施例2、实施例4、实施例5和实施例6得到的基因工程菌发酵植物甾醇得到的9-OH-4-HP产量随时间变化的曲线图。

图6为本应用例中的实施例2、实施例4、实施例5和实施例6得到的基因工程菌发酵植物甾醇得到的9-OH-PECE产量随时间变化的曲线图。

从图4、图5和图6可知，在48h时，实施例2、实施例4、实施例5和实施例6的基因工程菌产生9-OH-PDCE的产量开始显著增加；在96h至168h，9-OH-PDCE产量维持在0.5g/L至0.8g/L。

从图5可知，实施例5和实施例6的基因工程菌在整个发酵期间，副产物9-OH-4-HP的产量低于实施例2，在0.04g/L以下。

从图6可知，实施例5和实施例6的基因工程菌在整个发酵期间，副产物9-OH-PECE的产量都比较低且显著低于实施例2，在0.1g/L以下。

图7为野生型新金色分枝杆菌、实施例1、实施例2和实施例3得到的基因工程菌分别发酵植物甾醇得到发酵液的液相色谱分析图。

本发明发现敲除分枝杆菌中编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因后，能将植物甾醇代谢为9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)以及9α,21-二羟基-20α-甲基-孕甾-4-烯-3酮(9-OH-4-HP)，但不产生9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯(9-OH-PDCE)；而继续敲除编码烯酰辅酶A水合酶的基因后，能将植物甾醇代谢为9-羟基-3-酮-4,17-二烯20-羧基孕甾(9-OH-PDCA)、9-OH-PECA、9α,21-二羟基-20α-甲基-孕甾-4-烯-3酮(9-OH-4-HP)和9-羟基-3-酮-4烯20-羧基孕甾(9-OH-PECE)，且9-OH-PDCE的产量可达0.60g/L；通过将烯酰辅酶A水合酶回补到敲除烯酰辅酶A水合酶和3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的分枝杆菌中进行回补功能验证，发现烯酰辅酶A水合酶的回补能将植物甾醇代谢为9α-OH-AD以及9-OH-4-HP，而不产生9-OH-PDCE；综合说明，3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶在分枝杆菌转化甾醇过程中具有重要的调控作用，3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶为分枝杆菌产生甾药前体，特别是9-OH-PDCE的关键基因。

本发明所提供的基因工程菌选择性地降解甾醇的侧链。采用本发明的基因工程菌发酵甾醇，能减少了副产物如9-羟基-3-酮-4,17-二烯20-羧基孕甾(9-OH-PDCA)、9-羟基-3-酮-4烯孕甾-20-羧酸甲酯(9-OH-PECE)、9α,21-二羟基-20α-甲基-孕甾-4-烯-3酮(9-OH-4-HP)和9-羟基-3-酮-4烯20-羧基孕甾(9-OH-PECE)的生成，提高9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯(9-OH-PDCE)的生产效率和品质，且产物易于分离纯化。本发明的基因工程菌发酵甾醇获得的9-OH-PDCE能作为原料来制备氢化可的松、地塞米松、倍他米松等皮质类激素甾体药物。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 一种产甾药前体的基因工程菌及其用途

<160> 37

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1701

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgttctaca tgactgaaca ggactacagt gtctttgacg tagtagtggt agggagcggt 60

gctgccggca tggtcgccgc cctcaccgcc gctcaccagg gactctcgac agtagtcgtt 120

gagaaggctc cgcactatgg cggttccacg gcgcgatccg gcggtggcgt gtggattccc 180

aacaacgagg ttcttcagcg tgacggggtc aaagacaccg ccgcggaggc acggaagtac 240

ctgcacgcca tcatcggcga tgtggtgcct gccgagaaga tcgacaccta cctggaccgc 300

agtccggaga tgttgtcgtt cgtgctgaag aactcgccgc tgaagctgtg ctgggttccc 360

ggctactccg actactaccc ggagacgccg ggcggtaagg ccaccggccg ctcggtcgag 420

ccgaagccgt tcaacgccaa gaagctcggt cccgacgaga aggggctcga accgccgtac 480

ggcaaggtgc cgctgaacat ggtggtactg caacaggact atgtccggct caaccagctc 540

aagcgtcacc cgcgcggcgt gctacgcagc atcaaggtgg gtgtgcgatc ggtgtgggcc 600

aacgccaccg gcaagaacct ggtcggcatg ggccgggcgc tcatcgcgcc gctgcgcatc 660

ggtctgcaga aggccggggt gccggtgctg ctgaacaccg cgctgaccga cctgtacatc 720

gaggacgggg tggtgcgcgg aatctacgtt cgcgaggccg gtgcccccga gtctgccgag 780

ccgaagctga tccgggcccg caggggcgtg atcctcggtt cgggcggttt cgaacacaac 840

caggagatgc gcaccaagta ccagcgccag cccatcacca ccgagtggac cgtcggtgcc 900

gtcgccaaca ccggtgacgg catcctggca gccgaaaagc tgggtgcggc actggaactc 960

atggaggacg cgtggtgggg tccgaccgtc ccgctggagg gcgccccgtg gttcgccctt 1020

tccgagcgca actcccccgg gtcgatcatc gtcaacatga acggtaagcg gttcatgaac 1080

gaatcgatgc cctacgtgga ggcctgccac cacatgtacg gcggtcagta cggccagggc 1140

gccgggccgg gcgagaacgt gcccgcctgg atgatcttcg accagcagta ccgcgatcgc 1200

tatatctttg cgggattgca acccggacaa cgcatcccga agaagtggat ggaatcgggc 1260

atcatcgtca aggccgatag cctggccgag ctggccgaga agaccggtgt ggccgccgac 1320

gcgctgaagg ccaccatcga acggttcaac ggtttcgcac ggtccggcgt cgacgaggac 1380

ttccaccgcg gcgagagcgc ctacgaccgc tactacggtg atccgacgaa caagccgaac 1440

ccgaacctcg gcgagatcaa acacggcccg ttctacgccg cgaagatggt gcccggtgac 1500

ctgggcacca agggtggcat ccgcaccgac gtgcacggcc gggcgctgcg cgatgacaat 1560

tcggtgatcg aaggcctcta tgcggcaggc aatgtcagct cgccggtgat gggtcacacc 1620

tatcccggcc cgggtggcac aatcgggccc gccatgacct tcggctacct cgccgcattg 1680

catctcgctg gaaaggcctg a 1701

<210> 2

<211> 1677

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgaccgacc agaagaacat cgccgtcgat ctgctcgtcg tcggctcagg gacaggcatg 60

tcggcggcac ttgctgccca cgaactgggg ctctcgacgt tgatcgtgga aaagacccgg 120

tacgtgggtg gttcgacggc ccgttcgggc ggagccttct ggctgcccgg cagttccatc 180

ctcaaggaca acggttcggc ggacaccgcg gacagggcgc gcatctatct tgaggccctg 240

gtcggtgccg acgccgcacc cgaacggtcg cgcaccttcg tcgaccatat cccggccacc 300

atcgagatgc tccgccgcac gacgccgttg aaattcatgt gggccaaggg ttattcggac 360

tatcacccgg agcaaccagg tggcagcgca gtcggacgta cctgtgagtg ccgaccattc 420

gacactgctg tcctgggccc cgagctggcc cgtctgcgcc ccggcgtgat gaagtcatcg 480

ttcccgatgc ctgtcaccgg cgccgattac cgttggctga acctgatggc gcgtacgcca 540

cgcaagtcct ggccgcggat catgctgcgg gccatgcagg gtatcggcgg cttggccctg 600

cggcgccggt atgccgcagg tggccaggct ttggcggccg ggatgttcgc cggcgtgctg 660

caggccggga ttccggtgtg gaccgactcg ccggtggccg agttgacata cgacggtgag 720

cgggtgaccg gtgcgctggt agagcgtgaa ggcaccacgg tgaccgtctc ggcgcgacgc 780

ggcgtggtcc tcgccaccgg cggcttcgat catctgatga gctggcgaca caagtttcag 840

tcggagcgcc tcggcgggca ctacagcctc ggggcggaag gaaacactgg cgacggtatc 900

cgactggccc agaatctggg ggcaggcatc gggctgatgg atcaggcgtg gtggttcccg 960

gcattcgcgc cgctgcccgg gggcgatccc gtggtcatgc tggccgaacg ttcattgccc 1020

ggttgtctgt tggtggacca agacggcaga cggttcatca atgaggccac cgactacatg 1080

tctttcggcc agcgggtgct gcgacgcgag caggctggag accccatcga cacgatgtgg 1140

atggttttcg atcagcgcta tcgcaacagc tacctgatgg ccgccgaact gtttccacgg 1200

atgccgattc cgcagagctg gtacgacgcc gggatcgcct accgcggcgc cgatctggaa 1260

gaactcgctc gtcagatcgg gttggactcg gccacgttca ccgaaaccat gcaccgattc 1320

aacgggttcg ccgacgccgg tgtggacacc gacttccagc gcggggccag tgcgtatgac 1380

cgctactacg gcgacccgac gatcatgccc aatccgaacc tgcgtcccct ggactccggg 1440

ccgttctacg cggtcaaggt agttctgagt gatctcggca cctgcggcgg tgtgcaagca 1500

gacgtccacg gacaggtggt tcgcgaggac ggctcgacca tcacaggcct ctatgccatc 1560

ggtaataccg cggtcaacac gttcggtaag acgtatccgg gtgcaggcgc gaccatcgca 1620

cagggcttgg tgtacggcca tatcgcggct caccacgccg cgggtcgctc ggcttga 1677

<210> 3

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtctgatt cagatctcga gttcgatgtc atcgtcgccg ggtccggtgg cggacttgcc 60

ggcgcctaca ccgctgcccg cgagaatctt tcggtgttgc tcgtggaggc caccgatctg 120

ttcggcggca ccacgtcgtt ctccggcggg ggcggcatgt ggtttccctg caaccccgtg 180

ctccagcgcg caggcaccga tgacaccatc gacaaggcgt tgacatattt tcacgctgtc 240

gtgggtgagc gcactccgcg cgaactccaa gacgcctacg tccgcggcgg cgccaagctc 300

atcgagtatc tggaacagga tccggccttc gagttcacag cgctcccgtg gccggattac 360

tacggcacgg ctcccgaagc ccgtaccgac ggctaccggc acacgatccc gcttcccgtt 420

cccgatgcgg ccctcggcaa gtacgcaggc ctggtgcgcg gaccgctgga caccgagcgg 480

ctcggcgccg aagcgcccga tcttctcgtc ggagggcgcg cgctcgtcgg ccggttcctg 540

gctgcactgg acaagctacc caccgtcacc tgctggttga acgcgccgct ggtggacctg 600

atcaccgaga acggacgcgt cgtcggcgcg gtgatcgagc gcgacggcgc tccggtgcgg 660

gtcacgacac gtcgcggcgt gctcctggcc agcggtggat tcgaacagaa cgccgagatg 720

cgcgccgaat acggcgtacc cggccacgcc acggactcca tgggcggtcc cggtagcacc 780

ggccgcgcgc accgcgcagc catcgccgtc ggcgccgatg tcgatctgat ggaccaggcc 840

tggtggtcac cggggatgac ccatcccgac ggccggtccg ccttcgcgct gtggttcacc 900

ggcggcatct tcgtcaacca gcagggccgc cggttcgtca acgaatccgc accctacgac 960

cgcatcggcc gcgacatcat cgatcagatg cagaacggtt ccaccagatt gccgttctgg 1020

atgatctacg acaaccgcga cggcgacatt ccccccgtca aagccaccaa cgtgtccatg 1080

gtcgagcccg agaaataccg cacggcaggt ctgtggcaca gcgccgatac gctggccgag 1140

ctcgccgggg caatcggtgt ccccgccgcc gaactggaag ccaccgtggc gagatacaac 1200

gaacttgccg ccacgggcat cgacgacgac ttcggccgcg gcggcgaggc gtacgaccgc 1260

gcgttcagcg ggggcgagtc accgatggtc ccactggaca ccccgcccta tcacgcggcg 1320

gtcttcgggc tgtccgatct gggcaccaaa ggtgggctgc gcaccgatac ccacgcccgg 1380

gtgctcgacg ccgacggcgc ggccatcccc ggtctgtacg ccgcgggcaa cacgatggcg 1440

gcagtgtcgg gcaccaccta ccccggtggc ggcaacccca tcggcgcgtc gatgttgttc 1500

agccacctgg cggcactgga catggcgaca cagagctcag cggaatga 1548

<210> 4

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgagcgaac tgcaggcggg tatcgaggcg gtcctcgcgg cgggcagcag tagtccgacc 60

gtggcgcgcg acccggtgaa ccaacccatg atccatcact gggtcgatgc gatcggggac 120

aagaacccga tctacgtcga cgccgaggcg gcccgtgccg caggtcatcc gggtatcgtc 180

gccccgccgg cgatgatcca ggtgtggacc atgatggggc tggggcgttc ccgctccgat 240

gatgatccgc tcgcccgcgc catgaagctt ttcgatgacg ccggttatgt cggcgtcgtc 300

gccaccaact gcgaccagac ctatcaccgc tacctgcagc cgggggagca ggtggcgatg 360

agtgcggaga tcgtcggcat cgtcggtccc aaacagaccg cgctcggtga gggttacttc 420

atcaaccaga agatcagctg gcataccgtc ggggccggcg cggaggaact ggtcgccgag 480

atggactggc gcatcatgaa gttcctgccg gcagccaacg cggccaagac cgaaacggcc 540

gcgattcccg aggatctcga tcccgacaaa ctgatgcggc cgtcctcgtc gcgtgacacc 600

aagttcttct gggatggcgt caacgcacac gaactgcgta tccagcgccg cccggacggg 660

acgctgcagc acccaccggt ccccgcgatg tgggccgaca aagacgcacc cgccgattat 720

gtcgtctcct ccgggagggg cacggtgttc agctatgtcg tccaccatgc accgaaggtg 780

cccggccgca cgctgccctt cgtgatcgcc ctcgtcgaac tcgaggaggg cgttcggatg 840

ctcggcgagc tgcgtggggt ggatcccgag caggtgaaga tcggaatgcc ggtcaccgca 900

acctatatcg acttccccga cagtgaggtc agcccggcct ggacgttgta tgcatgggag 960

ccgcaagcat ga 972

<210> 5

<211> 912

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaacgaca acccgatcga cctgtccgga aaggttgccg tcgtcaccgg cgcggccgcc 60

ggcctgggcc gggccgaggc gataggcctg gcgcgggccg gcgcgacggt cgtggtcaac 120

gacatggccg gcgcgctgga caactccgac gtgctggccg agatcgaagc ggtcgggtcc 180

aagggcgtcg cggtcgccgg tgatatcagc gcgcgcagca ccgccgacga actcgtcgag 240

acagccgacc ggctcggggg actgggcatc gtggtgaaca acgccggcat cacccgggac 300

aagatgctgt tcaacatgtc cgacgaggac tgggacgcgg tgatcgccgt gcatctgcgc 360

ggacacttcc tgttgacgcg caatgctgcg gcgtactgga aggcgaaggc caaggagacc 420

gccgacggac gggtgtacgg acggatcgtc aacacctcct cggaggccgg gatcgccgga 480

ccggtgggtc aagccaatta cggtgccgcc aaggccggta tcacggcgtt gacgctgtcg 540

gcggcgcgcg ggttgagcag gtacggggtg cgggccaatg ccatcgcacc gcgggcccgc 600

accgccatga ccgccggcgt gttcggtgat gcaccggagc tggcggacgg acaggtcgat 660

gccctctcgc cggagcatgt cgtcacgctc gtcacctacc tgtcctcccc ggcgtccgag 720

gatgtcaacg ggcagctgtt catcgtgtac ggaccgacgg tcaccctggt tgcggcgccg 780

gttgccgccc accggttcga tgccgccggt gatgcctggg accccgcggc gttgagcgac 840

acgctcggtg acttctttgc taaaagggat ccgaatattg ggttctccgc aactgagctc 900

atgggttctt ga 912

<210> 6

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtggacttca cgccgaagcc cgaacagcag gccgtcgccg atgtggtgac ctcggtgctg 60

gaacgggaca acagctggga cgcactggta tccggtgggg tggcggcgct ggcggtgccc 120

gagcgcctcg gtggtgacgg gctcggactg cccgagatcg ccaccgcgct caccgagatc 180

ggcaggcgcg gtacgaccgg tgcggcactg gccacgctgg gtctcgggtt gctgccgctg 240

ctggaggtgg ccaccgatac cgaacaggac cgctatctcg acggggtcgc cggcggggcc 300

gtgttgtcgg cggcgctcaa cgagcccgga gtctcgcttc ccgagcgccc ctcggtgacc 360

ctgaccgacg ggaagctcac cggaaccaag atcggtgtgc cctatgccgg caccgcgcga 420

tggctgttgg tcaccgcgga cggtggggtc gcggtgatcg ctccgaccgc gagtggggtg 480

acgctgacca agacgccgac ctccaacggc accgacgagt acgtggtggt cttcgacggc 540

gccgaggtgg acggagtgct cgccaacgcc acgacccgcc gagtcaacca gttggtgctg 600

gccgccaccg gagccttcgc cgcgggcctg gtcgccggcg cgctgcgact taccgccgat 660

tacgtggcca ctcgcgaaca gttcgggcgt ccgctgtcga ccttccagac cgtcgccgcg 720

cagctctcgg atgtctatat cgcctcgcgg acaatcgatc tcgcggccac gtcggtgatc 780

taccggttgt ccgagggcct cgatgccgac gacgatctgg cgctgctggg ctattggatc 840

acctcgcagg cgccgccggc gatgcggttg tgtcatcatc tgcacggcgg catgggaatg 900

gatatcacct atccgatgga tcggtatttc tcctccatca aggacctcac ccgcttgctg 960

ggcgggcctg cgtatcgact ggatctggtg ggagcgtaa 999

<210> 7

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtacatcg aactgacgcc ggaacagcgc aagctgcaag acgaattccg cgagtacttc 60

tcgacgctca tcacgccgga ggaagccgcg gcgatggagt ccgatcgcca caacgaggcc 120

tatcgcgcgg tgatcaagcg gatgggctcg gacggcaagc tgggtgtggg ctggcccaag 180

gagtacggcg ggctcggctt cgggccgatc gagcagcaga tcttcatcaa cgaggccaac 240

cgcgccgata tcccgctgcc gatggtcacg ctgcagacgg tgggccccac cctgcaggtg 300

cacgggaccg aactgcagaa gaagaagttc ctgcccggga tcctcgccgg cgaggtgcat 360

ttcgcgatcg gttactccga gccggaggcg ggcaccgatc tcgcctcgct gcggaccacc 420

gcggtgcgcc acggcgacga gtacatcgtc aacggccaga agatgtggac caccggcgcc 480

cacgacgccg actacatctg gctggcctgc cgcaccgatc cggaagccgc caagcacaag 540

ggcatttcga tcctgatcgt cgataccaag gatcccggct actcctggac gccgatcatc 600

ctcagcgatg gggcacacca caccaacgcg tcgtattaca acgacgtccg ggtgcccgcc 660

gacatgctgg tcggcgagga acacggcggc tggaagctca tcacgaccca gctcaaccac 720

gagcgcgtcg ggcttggccc ggccggacgc atcgccggga tctacgacga ggtccacgag 780

tgggcgtgca tgcccggatc cgatggtgtc gtgccgatcg aacaggacga cgcgcgtcga 840

ctgctggccc agatcaaatc gatctggcgg atcaacgagt tgctgaactg gcaggtggcc 900

gcctcgggcg agaccatcgc ggtggccgat gcggcggcga cgaaggtctt ctccaccgag 960

cgcatccaag aggtcggccg gctggccgaa gaggtcgtcg gccgctacgg caaccccgcc 1020

gatgcccaca ccggcaggct gctggactgg ttggacaaga tgaccaaacg caatctggtg 1080

atcaccttcg gtggcggcgt caacgaggtc atgcgcgaaa tgatcgccgc gtcggggttg 1140

aaggtgccga gggtgacccg gtga 1164

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgggattgca acccggacaa cgcat 25

<210> 9

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgggattgca acccggacaa cgcatgtcta agaactttaa ataatttcta ctgttgtaga 60

tatcgactgc caggcatcaa a 81

<210> 10

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgcgttgtc cgggttgcaa tcccgatcta caacagtaga aattatttaa agttcttaga 60

cccgtttttg cctaaatcag c 81

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgccagcaac gcggcctttt 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacctctatt cacagggtac ggg 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tagtagtggt agggagcggt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcaggccttt ccagcgagat 20

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcggccggga tgttcgccgg cgtgc 25

<210> 16

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcggccggga tgttcgccgg cgtgcgtcta agaactttaa ataatttcta ctgttgtaga 60

tatcgactgc caggcatcaa a 81

<210> 17

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcacgccggc gaacatcccg gccgcatcta caacagtaga aattatttaa agttcttaga 60

cccgtttttg cctaaatcag c 81

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgaccagaag aacatcgccg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggcgtggtga gccgcgatat 20

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acggggggaa tgtcgccgtc gcggt 25

<210> 21

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

acggggggaa tgtcgccgtc gcggtgtcta agaactttaa ataatttcta ctgttgtaga 60

tatcgactgc caggcatcaa a 81

<210> 22

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

accgcgacgg cgacattccc cccgtatcta caacagtaga aattatttaa agttcttaga 60

cccgtttttg cctaaatcag c 81

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gagttcgatg tcatcgtcgc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcattccgct gagctctgtg 20

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tcgggatcga gatcctcggg aatcg 25

<210> 26

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tcgggatcga gatcctcggg aatcggtcta agaactttaa ataatttcta ctgttgtaga 60

tatcgactgc caggcatcaa a 81

<210> 27

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cgattcccga ggatctcgat cccgaatcta caacagtaga aattatttaa agttcttaga 60

cccgtttttg cctaaatcag c 81

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gtgagcgaac tgcaggcggg 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

catgggagcc gcaagcatga 20

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

attaagaagg agatatacat atgagcgaac tgcaggcggg 40

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

catgggagcc gcaagcatga gctcag 26

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

attaagaagg agatatacat atgaacgaca acccgatcga 40

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ttatcgatga attcggatcc tcaagaaccc atgagctcag 40

<210> 34

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

attaagaagg agatatacat atggacttca cgccgaagcc 40

<210> 35

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ttatcgatga attcggatcc tcaccgggtc accctcggca 40

<210> 36

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ccgaattcat cgataagctt ggatcgtcgg caccgtcacg 40

<210> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ggtgcgaagt gattcctccg tcaagagccc atgagctcgg 40

Claims

1.一种产甾药前体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过敲除分枝杆菌中编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶的基因获得，所述编码3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的基因为kstd1、kstd2和kstd3。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还包括过表达编码17β-羟甾脱氢酶和/或酰基辅酶A脱氢酶的基因。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，用于构建过表达编码17β-羟甾脱氢酶和/或酰基辅酶A脱氢酶的基因采用的穿梭质粒选自pMV306hsp质粒。

4.如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌在制备9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯的用途。

5.一种9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌将甾醇转化为9-羟基-3-酮-4,17-二烯孕甾-20-羧酸甲酯。