CN109706107A - 一种高效发酵生产甾药前体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种提高甾药生产菌株活力高效发酵生产甾药前体的方法。本发明将通过过表达Ⅱ型NADH脱氢酶基因提高甾药生产菌株活力高效发酵生产甾药前体，以解决微生物法甾药前体生产时存在的发酵周期长、生产效率低的问题，为甾药前体生产成本的降低提供新方法。

Description

一种高效发酵生产甾药前体的方法

技术领域：

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种提高甾药生产菌株活力高效发酵生产甾药前体的方法。

背景技术：

甾体药物简称甾药是制药工业中主要销售的产品并在临床上被广泛用。已知植物甾醇可被许多微生物分解代谢为一系列甾药前体。其中，4-雄甾烯-3,17-二酮(AD)和1,4-雄甾烯-3,17-二酮(ADD)是合成类固醇药物如孕激素，避孕药和雌激素的主要前体。据报道，快速生长的土壤分枝杆菌具有较强的降解植物甾醇侧链积累AD和ADD的能力。作为化学合成的替代，生物转化已成为制药工业中生产甾药前体的主要生产方法。但无论是原始菌株还是工程菌株均具有较长的转化周期(≥5天)，且在转化中后期(3天之后)菌株的活力明显下降，并伴随转化效率的急剧降低。这也是造成甾药前体生产成本高昂的原因之一。

发明内容：

针对上述问题，本发明将通过提高甾药生产菌株活力高效发酵生产甾药前体，以解决微生物法甾药前体生产时存在的发酵周期长、生产效率低的问题，为甾药前体生产成本的降低提供新方法。

本发明实现上述目的的技术方案之一，是通过构建Ⅱ型NADH脱氢酶加强的甾药前体基因工程生产菌株，从而提高菌株细胞活力，高效发酵生产甾药前体；

所述基因工程生产菌株是以分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3为宿主细胞，以pMV261质粒为表达载体，过表达Ⅱ型NADH脱氢酶基因获得的；

所述Ⅱ型NADH脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示，来源于快速生长型分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3,保藏编号CICC 21097；

本发明所提供的技术方案之二，是上述基因工程生产菌株的应用；

进一步的，上述基因工程生产菌株应用于普通发酵生产AD的方法如下：

将上述基因工程生产菌株的种子液按2-10％(种子液与废弃油+发酵培养基的体积比)的接种量转接于含5-20％(体积比)废弃油的发酵培养基中，在25-35℃，50-200rpm条件下培养24-168h，AD产量达到0.5-25g/L，摩尔转化率可以达到50％-99％；

进一步的，上述基因工程生产菌株应用于分批发酵生产AD的方法如下：

将上述基因工程生产菌株的种子培养液以2-20％的接种量转接于含5-20％(体积比)废弃油的发酵培养基中，在25-35℃，50-200rpm条件下培养5天(首批次)；

首批次发酵结束后进行重复分批发酵，在每批发酵结束时取出50-90％的培养物并补充等量的新鲜高压灭菌发酵培养基和废弃油，取出部分用于产物提取；除首批次外，剩余批次发酵时间为3天，所有培养批次在相同的培养条件下进行，共进行五批发酵，五批发酵后AD产量达到0.5-25g/L，摩尔转化率可以达到50％-99％；

所述的废弃油包括但并不限于过期的动植物油商品，食品、餐饮行业煎炸使用后废弃的动植物油以及地沟油处理后的上清油。

所述发酵培养基组成：K₂HPO₄ 0.1-3g/L，MgSO₄ 0.1-3g/L，柠檬酸铁铵0.01-0.2g/L，柠檬酸1-5g/L，磷酸氢二铵1-10g/L，葡萄糖5-50g/L，植物甾醇1-50g/L，其余为水，pH6.0-7.5。

有益效果：

本发明通过构建Ⅱ型NADH脱氢酶加强的甾药前体生产基因工程菌，使分枝杆菌的细胞活力提高了32％。意外的发现该酶加强的基因工程菌胞内活性氧的释放减少42.32％，在提高AD产量方面48-168小时的各取样点摩尔转化率均提高1.19倍以上，最高1.62倍。在基因工程菌重复批次发酵过程中，没有明显的生长延滞期，菌体可迅速进入指数期。在基因工程菌重复批次发酵生产AD过程中，第一批次AD的生产速率为0.65g/(L·d)；第二到第五批次AD的生产速率平均值为1.03g/(L·d)。无论是第二到第五批次每批次的AD的生产速率还是其平均值均比第一批次至少高40％以上。AD的生产效率得到大幅度提高。

附图说明：

图1为Ⅱ型NADH脱氢酶基因的扩增产物核酸电泳图

其中泳道M是DNA标准marker，泳道1-2是Ⅱ型NADH脱氢酶基因扩增条带；

图2为pMV261-ndh载体构建过程的酶切验证图谱

其中泳道M是DNA标准marker，泳道1是pMV261-ndh经BamHⅠ单酶切结果，泳道2是pMV261-ndh经BamHⅠ、HindⅢ双酶切结果；

图3为原始菌株MNR及重组菌株NdhN转化过程中菌株活力随时间的变过程；

图4为原始菌株MNR及重组菌株NdhN生成AD过程图；

图5为原始菌株MNR及重组菌株NdhN转化过程中活性氧生成量随时间的变过程；

图6利用NdhN在煎炸废弃油重复分批发酵生产AD的情况。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

实施例1 Ⅱ型NADH脱氢酶基因(ndh)的获得

将保藏编号为CICC 21097的菌株(以下简称MNR)接种于含有植物甾醇的基础培养基中(葡萄糖10g/L,MgSO₄ 0.5g/L,K₂HPO₄ 0.5g/L,(NH₄)₂HPO₄ 3.5g/L,柠檬酸2g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L，植物甾醇5g/L)培养60小时以获得样品用于转录组测序。将获得的基因转录本序列在NCBI的非冗余蛋白质序列数据库和KEGG的蛋白数据库中进行比对，以获得与每基因转录本序列具有最高序列相似性的蛋白。该蛋白的信息即为每个基因转录本序列对应的蛋白的功能注释信息。从注释信息中搜索NADH dehydrogenase所得到的基因转录本序列即为Ⅱ型NADH脱氢酶基因。以该序列为模板设计引物ndh-F和ndh-R，其序列分别如下：

ndh-F：5’-CGCGGATCCAATGAGCCATCCCGGAGCT-3’(SEQ ID NO.2)

ndh-R：5'-CCCAAGCTTCTAGGACGCGGCCTTCTC-3'(SEQ ID NO.3)

以MNR菌株总DAN为模板，以引物ndh-F和ndh-R为引物对，进行PCR扩增以获得MNR的Ⅱ型NADH脱氢酶基因(SEQ ID NO.1所示)。扩增产物经核酸电泳检测(图1)。

实施例2构建用于Ⅱ型NADH脱氢酶基因自身过表达基因工程表达载体

构建用于Ⅱ型NADH脱氢酶基因自身过表达基因工程表达载体，其过程包括：将实施例1中获得的Ⅱ型NADH脱氢酶基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后胶回收，与经同样酶切的pMV261质粒在T4DNA连接酶的作用下16℃连接过夜，连接产物经化学转化的方法转入Escherichia coli DH5α，经卡那霉素筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆中的质粒经酶切验证(图2)和测序后得到构建成功的用于Ⅱ型NADH脱氢酶基因自身过表达基因工程表达载体pMV261-ndh。

实施例3构建Ⅱ型NADH脱氢酶基因自身过表达菌株NdhN

分枝杆菌MNR感受态细胞制备：将MNR菌株接种到LB培养基中，30℃培养至OD₆₀₀为1.0左右，按10％接种量转接到种子培养基中进行二级种子培养；24h后加入2％甘氨酸继续培养24h。离心收集菌体，分别用1倍、3/4倍、1/2倍和1/4倍发酵液体积的10％预冷甘油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入1/25倍的10％甘油悬浮菌体，并分装保存；

电转化：取10μL实施例2获得的pMV261-ndh基因工程表达载体，加入到100μL感受态菌体中放置30分钟后转入电转杯进行点击。电击条件2kV/cm，25μF,720Ω条件下电转3-6ms后冰上放置5min后转入新灭菌1.5mL离心并加入500μL新鲜灭菌LB培养基，30℃200rpm进行复苏。

重组子筛选与验证：将复苏后的培养物，涂布于含有卡那霉素(50mg/L)LB培养基平板上，30℃静置培养4-7d，挑取单菌落至LB培养基培养2-3d后，提取质粒进行双酶切及测序验证。验证正确的阳性转化子命名为重组菌NdhN。

实施例4 MNR和NdhN菌株用于AD生产

1.菌株活化及种子制备

将重组菌NdhN及原始菌MNR分别转接于新鲜LB培养基上，30℃培养2-4d，用20mL0.5％的Tween 80无菌水溶液洗菌，吸取lmL洗脱液加入到50mL种子培养基中，在30℃，200rpm条件下摇床培养36h得种子液；

种子培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO₃ 1g/L，其余为水，pH 7.2。

2.AD生产过程

将步骤1中获得的种子培养液分别以7％的接种量转接于装有含12％煎炸废弃油的发酵培养基的250mL挡板瓶中，在30℃，150rpm条件下摇床培养168h；

发酵培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇5g/L，其余为水，pH 7.2。

实施例5 MNR和NdhN菌株AD生产过程中菌株活力检测

1.菌株活力检测

按照实施例4的方法利用MNR和NdhN菌株进行AD的生成，在生产过程中每隔24h，无菌条件下取样1mL进行菌株活力检测。菌株活力检测采用改进的CCK-8法，检测方法如下：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8)在电子载体存在的情况下能够被细菌的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的Formazan，其生成量和菌株活性呈正相关。Formazan在450nm处有最大吸收峰，可通过检测450nm下的吸光值(A450)反映菌体活力。取样液用pH7.2Tris-HCl缓冲液将OD ₆₀₀值调为1后，取190μL加入到96孔板中，每孔中分别加入WST-8 10μL，30℃孵育1小时后使用Infinite M200Pro检测450nm的吸收值。

2.结果比较

原始菌株MNR和Ⅱ型NADH脱氢酶基因的加强菌株NdhN，在AD生产过程中菌株活力的变化情况如图3所示，在整个生产过程中菌株MNR和NdhN的菌株活力均呈现先上升后下降的趋势，菌株NdhN的菌株活力始终大于菌株MNR的菌株活力。特别是在120h，菌株NdhN的菌株活力比菌株MNR的活力提高了32％。结合实施例7分析，Ⅱ型NADH脱氢酶基因的加强能够有效减少菌株内产生的活性氧，而活性氧的减少使菌株的活力得到提高。

实施例6 MNR和NdhN菌株AD生产性能比较

按照实施例4的方法利用MNR和NdhN菌株进行AD的生成，在生产过程中每隔24h，无菌条件下取样1mL进行AD生成率的检测。AD生成率的检测检测方法如下：用等体积的乙酸乙酯超声萃取样液，10000×g离心10min，取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL管中，自然风干后加lmL的流动相溶解，过0.22μm膜后进行高效液相色谱分析。色谱条件：C18柱，流动相为甲醇：水(4：1)，流速为l mL/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。

MNR和NdhN菌株AD生产性能比较如图4所示，Ⅱ型NADH脱氢酶基因的加强菌株NdhN的AD产量始终高于原始菌株MNR。在48h，菌株NdhN的AD生成量为0.66g/L，是原始菌株的1.43倍；在72h，菌株NdhN的AD生成量为1.59g/L，是原始菌株的1.62倍；在96h，菌株NdhN的AD生成量为2.46g/L，是原始菌株的1.47倍；在120h，菌株NdhN的AD生成量为2.95g/L，是原始菌株的1.19倍；在144h，菌株NdhN菌株AD生成量为3.14g/L，是原始菌株的1.18倍；在168h，菌株NdhN的AD生成量为3.11g/L，是原始菌株的1.19倍。

实施例7 MNR和NdhN菌株AD生产过程中活性氧生成检测

1.活性氧生成检测

按照实施例4的方法利用MNR和NdhN菌株进行AD的生成，在生产过程中每隔24h，无菌条件下取样1mL进行菌株胞内活性氧水平检测。检测方法如下：取1mL样液8000×g 4℃下离心2分钟收集菌体。菌体用50mM磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.0)洗涤3次后重悬于1mL PBS中。向重悬液中加入1mL10μM 2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)，在30℃下孵育30分钟后8000×g 4℃下离心2分钟收集菌体，PBS洗涤2次，重悬于1mLPBS中，使用Infinite M200Pro在激发波长488nm，发射波长525nm的条件下定量DCFH荧光强度。荧光强度与活性氧水平呈正相关。

2.结果比较

为方便比较，以MNR 24h的荧光强度值为标准，其余样品的荧光强度值均换算成其倍数。MNR和NdhN菌株AD生产过程中活性氧生成检测结果如图5所示，原始菌株MNR和Ⅱ型NADH脱氢酶基因的加强菌株NdhN在AD生产过程中活性氧的水平随时间的延长出现上升的趋势。菌株NdhN在72h之前产生的活性氧稍高于原始菌株MNR。在72h之后菌株MNR产生的活性氧明显增多，菌株NdhN的活性氧增加逐渐减缓，在144h菌株NdhN活性氧水平仅为菌株MNR的一半，活性氧释放减少42.32％。结合实施例5分析，Ⅱ型NADH脱氢酶基因的加强能够有效减少菌株内产生的活性氧，而活性氧的减少使菌株的活力得到提高。

实施例8重组菌NdhN在生产AD中的应用

以重组菌NdhN为生产菌株，菌株活化及种子制备同实施例4；

将重组菌NdhN的种子液按2％的接种量转接于含有5％煎炸废弃油的发酵培养基中，在25℃，50rpm条件下摇床培养24h，AD产量达到0.68g/L，摩尔转化率可以达到98.5％；

所述发酵培养基组成：K₂HPO₄ 0.1g/L，MgSO₄ 0.1g/L，柠檬酸铁铵0.01g/L，柠檬酸1g/L，磷酸氢二铵1g/L，葡萄糖5g/L，植物甾醇1g/L，其余为水，pH 6.0。

实施例9重组菌NdhN在生产AD中的应用

以重组菌NdhN为生产菌株，菌株活化及种子制备同实施例4；

将重组菌NdhN的种子液按10％的接种量转接于含有20％煎炸废弃油的发酵培养基中，在35℃，200rpm条件下摇床培养168h，AD产量达到21.3g/L，摩尔转化率可以达到61.7％；

所述发酵培养基组成：K₂HPO₄ 3g/L，MgSO₄ 3g/L，柠檬酸铁铵0.2g/L，柠檬酸5g/L，磷酸氢二铵10g/L，葡萄糖50g/L，植物甾醇50g/L，其余为水，pH 7.5。

实施例10利用煎炸废弃油重复分批发酵生产AD1.收集食堂废弃的经过多次煎炸使用后的废弃大豆油，按照12％的添加量添加到分枝杆菌发酵培养基中；

发酵培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇5g/L，其余为水，pH 7.2。121℃灭菌20分钟备用。

2.将菌株NdhN转接于新鲜斜面培养基上，30℃培养2-4d，用20mL 0.5％的Tween80无菌水溶液洗菌，吸取lmL洗脱液加入到50mL种子培养基中，在30℃，200rpm条件下摇床培养36h得种子液；

斜面培养基组成：磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，丙三醇20g/L，葡萄糖5g/L，碳酸钙10g/L，琼脂20g/L；

种子培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO₃ 1g/L，其余为水，pH 7.2。

3.将步骤2中获得的种子培养液以7％的接种量转接于步骤1获得的装有含废弃油的发酵培养基的250mL挡板瓶中，在30℃，150rpm条件下摇床培养5天。首批次发酵结束后进行重复分批发酵，在每批发酵结束时取出90％的培养物并补充等量的新鲜高压灭菌发酵培养基和废弃油。除首批次外，剩余批次发酵时间为3天。所有培养批次在相同的培养条件下进行，共进行五批发酵。在生产过程中每隔24小时，无菌条件下取样1mL进行AD生成率的检测。AD生成率的按照实施例6中的方法进行检测。

4.利用煎炸废弃油重复分批发酵生产AD的结果如图6所示。新金分枝杆菌在含有煎炸废弃油的培养基中经过5个重复批次共计17天的发酵后，生物摩尔转化率仍保持在2.8g/L以上。批次的发酵时间也由第一批次的5天缩短至3天。五批最高的AD产量为3.3g/L。

此外重复分批发酵过程仅需要一次种子培养的过程，从新金分枝杆菌菌体生长曲线上可以看出，从第二批次起发酵过程没有明显的生长延滞期，菌体可迅速进入指数期，并观察到更快的AD生成速率。第一批次AD的生产速率为0.65g/(L·d)；第二到第五批次AD的生产速率分别为1.11g/(L·d)、1.09g/(L·d)、1.00g·g/(L·d)、0.92g/(L·d)，平均值为1.03g/(L·d)。无论是第二到第五批次每批次的AD的生产速率还是其平均值均比第一批次至少高40％以上。

结合以上实施例分析，Ⅱ型NADH脱氢酶基因的加强能够有效提高甾药前体生产菌株菌体活力，对提高分枝杆菌生产AD的能力具有明显的增强作用。同时意外的发现Ⅱ型NADH脱氢酶基因的加强能减少菌株内活性氧的产生和积累。重复批次发酵的操作能进一步提高甾药前体生产菌株的生产效率。

实施例11利用煎炸废弃油重复分批发酵生产AD

将发酵培养基中植物甾醇的浓度设置为50g/L，接种量设置为20％，废弃油的添加比例为20％，每批发酵结束时取出50％的培养物并补充等量的新鲜高压灭菌发酵培养基和废弃油，其余条件同实施例10，发酵结果如下：

批次	AD产量(g/L)	生产速率(g/(L·d))
			第一批	17.82	3.56
第二批	18.47	6.16
			第三批	18.58	6.19
第四批	18.16	6.05
			第五批	17.71	5.9

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种高效发酵生产甾药前体的方法

<130> 1

<141> 2019-01-29

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1386

<212> DNA

<213> 分枝杆菌(Mycobacterium sp.)

<400> 1

atgagccatc ccggagctac ggcatcggat cggcacaagg tcgtcatcat cgggtcgggt 60

ttcggtggtt tgaacgccgc gcaggcgctc aagcgcaccg atgtcgacat caagttgatt 120

gcgcgcacca cccatcacct gttccagccg ctgctgtacc aagtggccac gggcatcatc 180

tccgagggtg agatcgctcc gccgacgcgg ctcatcctgc gcaagcagcg caacgcgcag 240

gtcctcctgg gcgacgtcac ccacgtcaac ctggaaaaga agaccgtgga gtcggtgctg 300

cttgggcaca cctacagcac cccctacgac accctgatcc tggctgccgg tgccggtcag 360

tcctacttcg gcaatgacca cttcgcggag tgggcgccgg gtatgaagac catcgacgat 420

gcgctggaac ttcgtggacg catcctgggc gccttcgagc aggccgaacg ctccagcgac 480

cccgagcgcc gcaagaagct gctgacgttc gtggtcgtgg gcgccggtcc gaccggcgtc 540

gagatggccg gtcagatcca ggagctcgcc gatcagaccc tcaagggcag cttccgccac 600

atcgacccca ccgaggccca cgtcatcctg ctggatgccg caccggcggt gttgccgccg 660

atgggcgaga agctggggct caaagccaag gaacggctgg agaagatggg tgtcgagatc 720

cagctgaacg ccatggtcac cgacgtcgac cgcaacggga tcaccgtcaa ggactccgac 780

ggcacgctgc gccgcatcga gtcggcctgc aaggtgtggt cggcgggtgt ccaggccagc 840

ccgctgggca aggacctggc ggcacagtcg gagaccgaga tcgaccgcgc cggtcgcgtc 900

atcgtcaacc cggatctgtc gatcccggga cacccgaacg tgttcgtggt cggcgatatg 960

gccttcgtgc ccggcgtgcc cggcatggcg cagggtgcga tccagggtgg caagtacgtc 1020

gccgcgatcg tgaagaacga agcggcagcg cgcgcccacg gcaccaagcc caagccgcgg 1080

gtgccgttca agtacttcga caagggctcg atggccaccg tgtcgaagtg gaacgcggtg 1140

gccaaggtcg gcaagctgga gttcggcggt ttcatcgcct ggctcgcctg gctgggcctg 1200

cacctgatct atctggtcgg cttcaagacc aagatcgcta cgttgttgtc gtgggcggtc 1260

accttcctga gccgacagcg aggacagctg accatcaccg agcagcaggc ctacgcgcgg 1320

atcaggatcg aggaactcca ggagatcgcg gcctcggttc aggagagcga gaaagccgcc 1380

agctga 1386

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

cgcggatcca atgagccatc ccggagct 28

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cccaagcttc taggacgcgg ccttctc 27

Claims (6)

1.一种甾药前体基因工程生产菌株，其特征在于，所述基因工程生产菌株是以分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3为宿主细胞，以pMV261质粒为表达载体，过表达Ⅱ型NADH脱氢酶基因获得的；所述Ⅱ型NADH脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示。

2.权利要求1所述甾药前体基因工程生产菌株的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，采用普通发酵法生产AD的方法如下：

将上述基因工程生产菌株的种子液按2-10％的接种量转接于含5-20％废弃油的发酵培养基中，在25-35℃，50-200rpm条件下培养24-168h。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，采用分批发酵法生产AD的方法如下：

将上述基因工程生产菌株的种子培养液以2-20％的接种量转接于含5-20％废弃油的发酵培养基中，在25-35℃，50-200rpm条件下培养5天为首批次发酵；

首批次发酵结束后进行重复分批发酵，在每批发酵结束时取出50-90％的培养物并补充等量的新鲜高压灭菌发酵培养基和废弃油，取出部分用于产物提取；除首批次外，剩余批次发酵时间为3天，所有培养批次在相同的培养条件下进行，共进行五批发酵。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成：K₂HPO₄ 0.1-3g/L，MgSO₄ 0.1-3g/L，柠檬酸铁铵0.01-0.2g/L，柠檬酸1-5g/L，磷酸氢二铵1-10g/L，葡萄糖5-50g/L，植物甾醇1-50g/L，其余为水，pH 6.0-7.5。

6.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的废弃油为过期的动植物油商品，食品、餐饮行业煎炸使用后废弃的动植物油或地沟油处理后的上清油。