CN111621539A - 一种通过加强胞内代谢提高甾醇转化的方法 - Google Patents
一种通过加强胞内代谢提高甾醇转化的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111621539A CN111621539A CN202010611959.4A CN202010611959A CN111621539A CN 111621539 A CN111621539 A CN 111621539A CN 202010611959 A CN202010611959 A CN 202010611959A CN 111621539 A CN111621539 A CN 111621539A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hydrolysate
- cane molasses
- fermentation
- culture medium
- steroid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/06—Hydroxylating
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/12—Acting on D ring
- C12P33/16—Acting at 17 position
- C12P33/18—Hydroxylating at 17 position
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物催化技术领域,具体涉及一种加强胞内代谢提高甾醇转化能力高效生产甾药前体的方法。本发明是通过向甾药前体生产菌株发酵培养基中添加甘蔗糖蜜和废菌体水解液,来提高甾药前体生产菌株胞内NAD+和辅酶A的水平,增强代谢丙酰辅酶A的甲基丙二酰途径中各关键酶的转录水平,从而提高菌株代谢丙酰辅酶A的能力,高效发酵生产甾药前体。
Description
技术领域:
本发明属于生物催化技术领域,具体涉及一种加强胞内代谢提高甾醇转化能力高效生产甾药前体的方法。
背景技术:
甾体药物简称甾药,现已在临床上广泛应用,作为仅次于抗生素的第二大类药物是制药工业中重要的生产产品。目前制药企业主要采用微生物发酵转化的方法以植物甾醇为原料生产甾药的多种核心前体,如4-雄甾烯-3,17-二酮(AD)、1,4-雄甾烯-3,17-二酮(ADD)、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)等。通过这些核心前体可以合成绝大部分的甾药。目前,用于甾药前体生产的主要是快速生长的土壤分枝杆菌、简单节杆菌以及红球菌等微生物。作为化学合成的替代,生物转化已成为制药工业中生产甾药前体的主要生产方法。但无论是原始菌株还是工程菌株均具有较长的转化周期(≥120小时),且在转化中后期菌株的转化效率的急剧降低并伴随产物降解,这也是造成甾药前体生产成本高昂的原因之一。
以甾醇为底物生物转化生产甾药核心前体时,甾醇在微生物的作用下会发生侧链的降解。在该过程中需要NAD+和辅酶A等辅因子,以产生大量的NADH、乙酰辅酶A和丙酰辅酶A。NAD+和辅酶A的胞内水平的提高有助于甾醇侧链的降解。甾醇侧链降解产生的丙酰辅酶A可经甲基丙二酰途径进入三羧酸循环。在该途径中丙酰辅酶A被生物素依赖的丙酰辅酶A羧化酶(PCC)催化丙酰辅酶A羧合成(S)-甲基丙二酰辅酶A,随后甲基丙二酰辅酶A差向异构酶(MCEE)又将其消旋化为(R)-型对映体,(R)-甲基丙二酰辅酶A最后被甲基丙二酰辅酶A变位酶异构化为琥珀酰辅酶A进入三羧酸循环,氰钴胺(维生素B12)则是甲基丙二酰辅酶A变位酶的辅酶。当有丙酰辅酶A大量产生超出甲基丙二酰途径代谢能力或甲基丙二酰途径中的各酶发生变异导致该代谢途径代谢能力减弱或阻断时就会发生丙酰辅酶A的过量积累。大量的丙酰辅酶A会对细胞产生毒害作用,甚至会致死。甾药前体生产菌株的生产能力越强所产生的丙酰辅酶A就会越多,丙酰辅酶A的积累是影响菌体活力,降低转化效率,延长转化周期的主要原因之一。
目前,提高甾药前体生产菌株生产能力的方法多是针对甾醇代谢途径中关键酶的改造,这些方法往往只关注单酶或少数几个酶的功能加强,忽视了对代谢通路全局的把握。这些方法的缺陷是引发甾醇代谢过程中辅因子的供应不足和有毒中间产物的积累。因此需要一种能够提高胞内辅因子水平、减少中间代谢产物积累的方法以提高甾药前体生产菌株的甾醇转化能力。
发明内容:
针对上述问题,本发明将利用甘蔗糖蜜和废菌体水解液提高胞内辅酶I(NADH和NAD+)的水平,加强甾醇侧链的降解,加强丙酰辅酶A的甲基丙二酰代谢途径,减轻因丙酰辅酶A过程积累对菌株造成的毒害作用,以解决微生物法甾药前体生产时存在的发酵周期长、生产效率低的问题,为甾药前体生产成本的降低提供新方法。
本发明实现上述目的的技术方案,是通过向甾药前体生产菌株发酵培养基中添加甘蔗糖蜜和废菌体水解液,来提高甾药前体生产菌株胞内胞内辅酶I的水平,增强代谢丙酰辅酶A的甲基丙二酰途径中各关键酶的转录水平,从而提高菌株代谢丙酰辅酶A的能力,高效发酵生产甾药前体;
所述的甾药前体,包括但并不限于雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-dione,AD)、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione,9α-OH-AD)、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(Androst-1,4-diene-3,17-dione,ADD)、A环降解物等;
进一步地,所述甘蔗糖蜜中的还原糖在发酵培养基中的含量为2-20g/L;
优选地,所述甘蔗糖蜜用双蒸水稀释至还原糖含量为20%后115℃灭菌后添加入培养基中;
进一步地,所述废菌体水解液是将上轮次新金分枝杆菌以植物甾醇为底物生产雄甾-4-烯-3,17-二酮发酵结束后的发酵液离心收集菌体,用水洗涤两次后,调节菌体浓度为20-200g/L,用NaOH调节pH至6.8后煮沸10-30分钟即为菌体水解液;
优选地,培养基中菌体水解液的添加量为20-100%(体积比;v/v);
进一步的,上述提高甾药前体生产的方法如下:
将甾体药物前体生产菌株的种子液按2-10%(种子液与发酵培养基的体积比)的接种量转接于发酵培养基中,发酵培养基中添加甘蔗糖蜜(甘蔗糖蜜中的还原糖在发酵培养基中的含量为2-20g/L),和20-100%的废菌体水解液,在25-35℃,50-200rpm条件下培养24-168h;
优选地,当生产菌株为新金分枝杆菌,底物植物甾醇投加量为1-50g/L时,使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基,发酵结束后AD产量达到0.35-34g/L,摩尔转化率可以达到50%-99%;较未添加甘蔗糖蜜和废菌体水解液的培养基转化率和产量提高10-35%;
优选地,当生产菌株为偶发分枝杆菌,底物植物甾醇投加量为1-50g/L时,发酵结束后9α-OH-AD产量达到0.45-36g/L,摩尔转化率可以达到60%-99%;较未添加甘蔗糖蜜和废菌体水解液的培养基产量和转化率提高5-16%;
所述发酵培养基组成:K2HPO4 0.1-3g/L,MgSO4 0.1-3g/L,柠檬酸铁铵0.01-0.2g/L,柠檬酸1-5g/L,磷酸氢二铵1-10g/L,植物甾醇1-50g/L,环糊精1-30mM,其余为水,pH6.0-7.5。
有益效果:
本发明在不对生产菌株进行任何基因工程改造的情况下,使用含有甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基发酵144小时使胞内辅酶I水平提高98%;意外发现使用含有甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基能够促进甲基丙二酰途径中丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A差向异构酶及甲基丙二酰辅酶A变位酶的转录水平,发酵60小时,三种酶转录水平分别是葡萄糖培养基的4.58倍、2.19倍和1.74倍;同时甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基的使用使新金分枝杆菌雄甾-4-烯-3,17-二酮的产量提高26%,使偶发分枝杆菌9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的转化率提高18%;同时兼具降低生产成本的优势。该发明具有性能稳定、工艺操作简便等优势,可有效用于其他甾体药物前体生产菌株丙酰辅酶A代谢的加强,具有广泛的应用价值,为甾体药物前体生产成本的降低提供了新方法。
附图说明:
图1使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液胞内辅酶I水平变化;
图2使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液后丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A差向异构酶及甲基丙二酰辅酶A变位酶的转录水平变化;
图3使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液生产雄甾-4-烯-3,17-二酮过程图;
图4使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮过程图。
具体实施方式:
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本专利进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利,并不用于限定本发明。
实施例1甘蔗糖蜜和废菌体水解液对新金分枝杆菌胞内辅酶I水平的影响
1.甘蔗糖蜜和废菌体水解液制备
将甘蔗糖蜜用双蒸水稀释至还原糖含量为20%后115℃灭菌后备用。
收集上轮次新金分枝杆菌以植物甾醇为底物生产雄甾-4-烯-3,17-二酮发酵结束后的发酵液,8000rpm离心15分钟收集菌体,用双蒸水洗涤两次后,用双蒸水调节菌体浓度为100g/L,用NaOH调节pH至6.8后煮沸20分钟即为菌体水解液。
2.菌株活化及种子制备
将快速生长型新金分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3(该菌株已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心,保藏编号CICC NO.21097)接种于新鲜LB培养基上,30℃培养2-4d,用20mL 0.5%的Tween 80无菌水溶液洗菌,吸取lmL洗脱液加入到50mL种子培养基中,在30℃,200rpm条件下摇床培养36h得种子液;
种子培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,硝酸铵2g/L,甘油20g/L,葡萄糖5g/L,CaCO3 1g/L,其余为水,pH 7.2。
3.雄甾-4-烯-3,17-二酮生产
将种子液以5%的接种量接种于50mL含有甘蔗糖蜜和废菌体水解液发酵培养基的250mL挡板瓶中,在30℃,150rpm条件下摇床培养168h,进行雄甾-4-烯-3,17-二酮生产。使用含葡萄糖发酵培养基、含甘蔗糖蜜发酵培养基及含废菌体水解液培养基作为对照。
含甘蔗糖蜜和废菌体水解液发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,甘蔗糖蜜(甘蔗糖蜜中的还原糖在发酵培养基中的含量为20g/L),废菌体水解液50%(体积比),羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇5g/L,其余为水,pH 7.2。
含葡萄糖发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,葡萄糖10g/L,羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇5g/L,其余为水,pH 7.2。
含甘蔗糖蜜发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,甘蔗糖蜜(甘蔗糖蜜中的还原糖在发酵培养基中的含量为20g/L),羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇5g/L,其余为水,pH 7.2。
含废菌体水解液发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,葡萄糖10g/L,废菌体水解液50%(体积比),羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇5g/L,其余为水,pH 7.2。
4.胞内辅酶I提取检测
在雄甾-4-烯-3,17-二酮生产过程中从48小时到144小时每隔48h,无菌条件下取样1mL进行菌株NADH、NAD+含量检测。NADH、NAD+含量检测:经酸或碱处理后,细胞中只剩下一种形式的辅酶I(NADH被酸破坏,NAD+被碱破坏)进入循环反应,循环反应中生成的甲肷生成率与辅酶I的含量成正比。甲肷在570nm处有最高吸收峰,因此可用分光光度法测定吸光值,根据标准曲线来定量细胞中NADH及NAD+含量。将NADH及NAD+含量相加即为胞内辅酶I水平。
5.结果对比
新金分枝杆菌分别使用含有甘蔗糖蜜和废菌体水解液发酵培养基、含葡萄糖发酵培养基、含甘蔗糖蜜发酵培养基和含废菌体水解液发酵培养基进行雄甾-4-烯-3,17-二酮生产过程中NADH、NAD+含量的检测结果如图1所示。与其他培养基相比含有甘蔗糖蜜和废菌体水解液发酵培养基能够提高菌株胞内辅酶I水平。在各取样点使用含有甘蔗糖蜜和废菌体水解液发酵培养基胞内辅酶I水平>甘蔗糖蜜培养基>废菌体水解液培养基>葡萄糖培养基。在96小时使用含有甘蔗糖蜜和废菌体水解液发酵培养基胞内辅酶I水平为1.09μmol/gDCW,分别是以甘蔗糖蜜培养基、废菌体水解液培养基和葡萄糖培养基的1.17倍、1.35倍和1.4倍。在144小时使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液发酵培养基胞内辅酶I水平为1.17μmol/gDCW,是使用葡萄糖培养基的1.98倍。
因此,使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液能够提高胞内辅酶I的水平。
实施例2含有甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基对甲基丙二酰途径中丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A差向异构酶及甲基丙二酰辅酶A变位酶转录水平影响
按照实施例1的方法制备甘蔗糖蜜和废菌体水解液。按照实施例1的方法利用新金分枝杆菌以含有甘蔗糖蜜和废菌体水解液发酵培养基生产雄甾-4-烯-3,17-二酮,以葡萄糖发酵培养基做对照。
含甘蔗糖蜜和废菌体水解液发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,甘蔗糖蜜(甘蔗糖蜜中的还原糖在发酵培养基中的含量为20g/L),废菌体水解液40%(体积比),羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇5g/L,其余为水,pH 7.2。
含葡萄糖发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,葡萄糖10g/L,羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇5g/L,其余为水,pH 7.2。
在发酵生产48小时和60小时分别收集10mL菌液,10000rpm离心2分钟获得菌体。菌体总RAN采用试剂盒(Super Total RNA Extraction Kit,LS1040,Promega)进行提取,提取方法按照产品说明书进行。向1μg总RNA中加入1μL gDNA Eraser及2μL 5×gDNAEraser Buffer用RNase Free ddH2O补齐至10μL,42℃反应2min后进行反转录。反转录使用试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser,RR047,Takara)完成,反转录反应体系为PrimerScriptRT Enzyme Mix I 1μL,RT Primer Mix 1μL,5×PrimerScriptBuffer 2 4μL用RNase Free ddH2O补齐至20μL,37℃反转录反应15min;85℃热处理5s。
根据甲基丙二酰途径中丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A差向异构酶及甲基丙二酰辅酶A变位酶的序列分别设计实时荧光定量PCR用引物,引物如下。
PC-f-RT/PC-r-RT:CAGAACATCATCGTCGGCTA/GATCGGGATGTTGAAGCAGT
MC-f-RT/MC-r-RT:CTGGACGAGAAGTCCACGAT/CTTGGGGTGGATGAAGTTGA
MU-f-RT/MU-r-RT:GGTCCGCAACACCTACATCT/GTGGTAACCCGAGATCGAGA
16s-f-RT/16s-r-RT:ACCAGCGTCCTGTGCATGTC/AGTACGGCCGCAAGGCTAAAAC
使用Applied Biosystems StepOneTM Real-Time PCR System扩增仪,以各菌株反转录DAN为模板,按照试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM GC,RR071,Takara)说明书配制PCR反应体系。采用两步法PCR扩增标准程序。第一步是预变性:95℃,30s;第二步是PCR反应:95℃变性5s,60℃反应30s,进行40个循环。溶解曲线温度范围是60-95℃。实验结果采用2-ΔΔCt算法进行数据计算,分析各基因的相对表达量(图2)。
实验结果表明使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基,新金分枝杆菌中丙酰辅酶A的甲基丙二酰代谢途径的丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A差向异构酶及甲基丙二酰辅酶A变位酶的转录水平均有所提高。使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基在48小时,丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A差向异构酶及甲基丙二酰辅酶A变位酶的转录水平分别是葡萄糖培养基的7.32倍、4.53倍和3.75倍。在60小时使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基,丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A差向异构酶及甲基丙二酰辅酶A变位酶的转录水平分别是葡萄糖培养基的4.58倍、2.19倍和1.74倍。
因此使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基能够增强代谢丙酰辅酶A的甲基丙二酰途径中各关键酶的转录水平,从而加强菌株代谢丙酰辅酶A的能力,提高甾醇侧链降解速度。
实施例3甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基对甾醇转化生产雄甾-4-烯-3,17-二酮的影响
按照实施例1的方法制备甘蔗糖蜜和废菌体水解液。
按照实施例1的方法利用新金分枝杆菌以含有甘蔗糖蜜和废菌体水解液发酵培养基生产雄甾-4-烯-3,17-二酮。使用含葡萄糖发酵培养基、含甘蔗糖蜜发酵培养基及含废菌体水解液培养基作为对照。
含甘蔗糖蜜和废菌体水解液发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,甘蔗糖蜜(甘蔗糖蜜中的还原糖在发酵培养基中的含量为20g/L),废菌体水解液60%(体积比),羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇5g/L,其余为水,pH 7.2。
含葡萄糖发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,葡萄糖10g/L,羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇5g/L,其余为水,pH 7.2。
含甘蔗糖蜜发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,甘蔗糖蜜(甘蔗糖蜜中的还原糖在发酵培养基中的含量为20g/L),羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇5g/L,其余为水,pH 7.2。
含废菌体水解液发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,葡萄糖10g/L,废菌体水解液60%(体积比),羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇5g/L,其余为水,pH 7.2。
在30℃,150rpm条件下摇床培养168h。每隔24小时取样检测雄甾-4-烯-3,17-二酮的生成量。
雄甾-4-烯-3,17-二酮生成量的检测:用等体积的乙酸乙酯超声萃取样液,10000×g离心10min,取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL管中,自然风干后加l mL的流动相溶解,过0.22μm膜后进行高效液相色谱分析。色谱条件:C18柱,流动相为甲醇:水(4:1),流速为l mL/min,柱温为30℃,检测波长为254nm。
甘蔗糖蜜和废菌体水解液对甾醇转化生产雄甾-4-烯-3,17-二酮的影响如图3所示。图3结果表明含有甘蔗糖蜜和废菌体水解液的培养基系统有利于雄甾-4-烯-3,17-二酮转化率的提高,在整个发酵周期内使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液获得的转化率始终高于含葡萄糖发酵培养基、含甘蔗糖蜜发酵培养基和含废菌体水解液发酵培养基获得的转化率。含甘蔗糖蜜发酵培养基获得的转化率高于含废菌体水解液发酵培养基获得的转化率。含废菌体水解液发酵培养基获得的转化率高于含葡萄糖发酵培养基获得的转化率。
使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基获得的最高雄甾-4-烯-3,17-二酮转化率为92.52%,分别是含葡萄糖发酵培养基、含甘蔗糖蜜发酵培养基和含废菌体水解液发酵培养基获得转化率的1.26倍、1.2倍和1.07倍。相应的,使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基获得的雄甾-4-烯-3,17-二酮产量为3.19g/L,含葡萄糖发酵培养基、含甘蔗糖蜜发酵培养基和含废菌体水解液发酵培养基获得雄甾-4-烯-3,17-二酮产量分别为和2.54g/L、2.67g/L和3g/L。使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基获得的雄甾-4-烯-3,17-二酮产量比含葡萄糖发酵培养基提高26%。
实施例4甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基对甾醇转化生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的影响
1.按照实施例1的方法制备甘蔗糖蜜和废菌体水解液。
2.菌株活化及种子制备
将快速生长型偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)ARL-91,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号CGMCC NO.16771,接种于新鲜LB培养基上,30℃培养2-4d,用20mL0.5%的Tween 80无菌水溶液洗菌,吸取lmL洗脱液加入到50mL种子培养基中,在30℃,200rpm条件下摇床培养36h得种子液;
种子培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,硝酸铵2g/L,甘油20g/L,葡萄糖5g/L,CaCO3 1g/L,其余为水,pH 7.2。
3.9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮生产过程
将步骤2中获得的种子培养液分别以7%的接种量分别接种于50mL含有甘蔗糖蜜和废菌体水解液发酵培养基的250mL挡板瓶中,在30℃,150rpm条件下摇床培养168h。使用含葡萄糖发酵培养基、含甘蔗糖蜜发酵培养基及含废菌体水解液培养基作为对照。
含甘蔗糖蜜和废菌体水解液发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,甘蔗糖蜜(甘蔗糖蜜中的还原糖在发酵培养基中的含量为20g/L),废菌体水解液60%(体积比),羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇10g/L,其余为水,pH 7.2。
含葡萄糖发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,葡萄糖15g/L,羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇10g/L,其余为水,pH 7.2。
含甘蔗糖蜜发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,甘蔗糖蜜(甘蔗糖蜜中的还原糖在发酵培养基中的含量为20g/L),羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇10g/L,其余为水,pH 7.2。
含废菌体水解液发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,柠檬酸2g/L,磷酸氢二铵3.5g/L,葡萄糖15g/L,废菌体水解液60%(体积比),羟丙基β-环糊精25mM,植物甾醇10g/L,其余为水,pH 7.2。
在30℃,150rpm条件下摇床培养168h。每隔24小时取样按照实施例3的方法检测9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的生成量。
甘蔗糖蜜和废菌体水解液对9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮生产的影响如图4所示。图4结果表明含有甘蔗糖蜜和废菌体水解液的培养基系统有利于9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮产量的提高,在整个发酵周期内使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液获得的产量始终高于含葡萄糖发酵培养基、含甘蔗糖蜜发酵培养基和含废菌体水解液发酵培养基获得的产量。含甘蔗糖蜜发酵培养基获得的产量高于含废菌体水解液发酵培养基获得的产量。含废菌体水解液发酵培养基获得的产量高于含葡萄糖发酵培养基获得的产量。
使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基获得的最高9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮产量为7.06g/L,分别是含葡萄糖发酵培养基、含甘蔗糖蜜发酵培养基和含废菌体水解液发酵培养基获得转化率的1.18倍、1.15倍和1.1倍。相应的,使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基获得的雄甾-4-烯-3,17-二酮转化率为96.81%,含葡萄糖发酵培养基、含甘蔗糖蜜发酵培养基和含废菌体水解液发酵培养基获得9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮转化率分别为82.38%、84.32%和87.98%。使用甘蔗糖蜜和废菌体水解液培养基获得的9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮转化率比含葡萄糖发酵培养基提高18%。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本专利构思的前提下,上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进,这些都属于本专利的保护范围。因此,本专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种甾药前体的生产方法,其特征在于,所述甾药前体生产菌株发酵培养基中添加有甘蔗糖蜜和废菌体水解液。
2.如权利要求1所述的一种甾药前体的生产方法,其特征在于,所述甘蔗糖蜜的添加量按甘蔗糖蜜中的还原糖在发酵培养基中的含量为2-20g/L进行添加。
3.如权利要求1所述的一种甾药前体的生产方法,其特征在于,所述废菌体水解液是将上轮次新金分枝杆菌以植物甾醇为底物生产雄甾-4-烯-3,17-二酮发酵结束后的发酵液离心收集菌体,用水洗涤后,调节菌体浓度为20-200g/L,用NaOH调节pH至6.8后煮沸10-30分钟即为菌体水解液。
4.如权利要求1所述的一种甾药前体的生产方法,其特征在于,培养基中菌体水解液的添加量为20-100%。
5.如权利要求1所述的甾药前体的生产方法,其特征在于,所述的甾药前体,包括雄甾-4-烯-3,17-二酮、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮和A环降解物。
6.如权利要求1所述的甾药前体的生产方法,其特征在于,所述发酵培养基组成:K2HPO40.1-3g/L,MgSO4 0.1-3g/L,柠檬酸铁铵0.01-0.2g/L,柠檬酸1-5g/L,磷酸氢二铵1-10g/L,植物甾醇1-50g/L,环糊精1-30mM,其余为水,pH 6.0-7.5。
7.如权利要求1-6任意一项所述的甾药前体的生产方法,其特征在于,具体如下:将甾体药物前体生产菌株的种子液按2-10%的接种量转接于发酵培养基中,发酵培养基中添加2-40%甘蔗糖蜜和20-100%的废菌体水解液,在25-35℃,50-200rpm条件下培养24-168h。
8.如权利要求1所述的甾药前体的生产方法,其特征在于,生产菌株为新金分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3。
9.如权利要求1所述的甾药前体的生产方法,其特征在于,生产菌株为偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)ARL-91。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2019105890924 | 2019-07-02 | ||
CN201910589092 | 2019-07-02 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111621539A true CN111621539A (zh) | 2020-09-04 |
Family
ID=72257546
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010611959.4A Pending CN111621539A (zh) | 2019-07-02 | 2020-06-30 | 一种通过加强胞内代谢提高甾醇转化的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111621539A (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102586139A (zh) * | 2012-01-20 | 2012-07-18 | 广东本科生物工程股份有限公司 | 一种高产ad/add的菌株及高效生产ad/add的方法 |
CN109706108A (zh) * | 2019-01-29 | 2019-05-03 | 天津科技大学 | 一种通过强化nadh脱氢增强甾药前体生产的方法 |
CN109706107A (zh) * | 2019-01-29 | 2019-05-03 | 天津科技大学 | 一种高效发酵生产甾药前体的方法 |
-
2020
- 2020-06-30 CN CN202010611959.4A patent/CN111621539A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102586139A (zh) * | 2012-01-20 | 2012-07-18 | 广东本科生物工程股份有限公司 | 一种高产ad/add的菌株及高效生产ad/add的方法 |
CN109706108A (zh) * | 2019-01-29 | 2019-05-03 | 天津科技大学 | 一种通过强化nadh脱氢增强甾药前体生产的方法 |
CN109706107A (zh) * | 2019-01-29 | 2019-05-03 | 天津科技大学 | 一种高效发酵生产甾药前体的方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
XIULING ZHOU等: "Economical production of androstenedione and 9α-hydroxyandrostenedione using untreated cane molasses by recombinant mycobacteria", 《BIORESOUR TECHNOL》 * |
孙婉菊等: "废弃菌体水解液作氮源发酵产腈水合酶的研究", 《江西师范大学学报(自然科学版)》 * |
徐锐: "《发酵技术》", 31 January 2016, 重庆大学出版社 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5618995B2 (ja) | 嫌気的微生物発酵によるブタンジオールの製造 | |
Sun et al. | Efficient production of lactic acid from sugarcane molasses by a newly microbial consortium CEE-DL15 | |
Zhang et al. | Fast conversion of glycerol to 1, 3-propanediol by a new strain of Klebsiella pneumoniae | |
Geng et al. | Effect of key factors on hydrogen production from cellulose in a co-culture of Clostridium thermocellum and Clostridium thermopalmarium | |
Fangkum et al. | Biohydrogen production from sugarcane bagasse hydrolysate by elephant dung: Effects of initial pH and substrate concentration | |
Abubackar et al. | Improved operating strategy for continuous fermentation of carbon monoxide to fuel-ethanol by clostridia | |
Sinha et al. | Biohydrogen production from various feedstocks by Bacillus firmus NMBL-03 | |
Shaw et al. | End-product pathways in the xylose fermenting bacterium, Thermoanaerobacterium saccharolyticum | |
Wang et al. | Mixed culture of Saccharomyces cerevisiae and Acetobacter pasteurianus for acetic acid production | |
CN105400860B (zh) | 微生物共培养系统及其应用 | |
Xu et al. | Cell growth and hydrogen production on the mixture of xylose and glucose using a novel strain of Clostridium sp. HR-1 isolated from cow dung compost | |
Sirisansaneeyakul et al. | Repeated fed‐batch production of xylitol by Candida magnoliae TISTR 5663 | |
CN105734092B (zh) | 一种酶法制备d-塔格糖的方法 | |
Yang et al. | Industrial production of 2, 3-butanediol from the engineered Corynebacterium glutamicum | |
Hild et al. | Effect of nutrient limitation on product formation during continuous fermentation of xylose with Thermoanaerobacter ethanolicus JW200 Fe (7) | |
Sheu et al. | Production of high-purity neofructooligosaccharides by culture of Xanthophyllomyces dendrorhous | |
Li et al. | Improvement in bacterial cellulose production by co-culturing Bacillus cereus and Komagataeibacter xylinus | |
CN102199632B (zh) | 一种转化dl-乳酸制备丙酮酸的方法 | |
CN111621539A (zh) | 一种通过加强胞内代谢提高甾醇转化的方法 | |
JP2016528924A (ja) | 糖を基質とする微生物発酵プロセス及び当該プロセスにおける原子状、イオン状及び気体状の水素の使用 | |
CN111394396B (zh) | 一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法 | |
Sahoo et al. | An investigation on glycerol biosynthesis by an osmophilic yeast in a bioreactor | |
AU2014311204A1 (en) | A process for microbial fermentation of sugary substrates and use of the hydrogen in atomic, ionic or gaseous state in said process | |
Shah et al. | Ethanol production kinetics by a thermo-tolerant mutant of Saccharomyces cerevisiae from starch industry waste (Hydrol) | |
CN112501219A (zh) | 一种以蔗糖为原料发酵生产乳酸单体的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |