CN105400796A - 一种调控产长链二元酸的基因及其应用 - Google Patents

一种调控产长链二元酸的基因及其应用 Download PDF

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CN105400796A CN201511003830.0A CN201511003830A CN105400796A CN 105400796 A CN105400796 A CN 105400796A CN 201511003830 A CN201511003830 A CN 201511003830A CN 105400796 A CN105400796 A CN 105400796A
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    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids

Abstract

本发明涉及一种调控产长链二元酸的基因及其应用。一种长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p，核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；其表达的长链脂肪酸转运蛋白Pxa1p，氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明还公开了上述长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p在生产长链二元酸中的应用。本发明构建的热带假丝酵母基因工程重组菌能够有效降低所产生的二元酸及中间产物一元酸的消耗，进而大幅提升二元酸转化率及产量。

Description

一种调控产长链二元酸的基因及其应用
技术领域
本发明涉及一种调控产长链二元酸的基因及其应用，特别涉及一种反向调控产长链二元酸的基因及利用该基因构建高产长链二元酸热带假丝酵母工程菌的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
长链二元酸(Long-chaindicarboxylicacid，DCA)是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸，包括饱和及不饱和二羧酸，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品，是化学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等的重要原料。长链二元酸在自然界中不单独存在，同时由于生产长链二羧酸的有机合成法工艺复杂、成本较高，有的二羧酸如十五碳二羧酸等尚无法合成，使得长链二羧酸的开发利用受到限制。发酵法生产DCA是70年代兴起的微生物发酵技术在石油化工领域的应用，具有原料来源广、反应专一性强和反应条件温和等优点，在国内外受到普遍重视。生物法可提供从C9到C18甚至C22的系列长碳链二元酸单体，这些新型特种长碳链二元酸单体可以以更优良的性能竞争化学法生产的已有长碳链二元酸市场，同时，不同性质的系列特种长碳链二元酸单体将会衍生一系列具有不同性质的新功能材料，国内已经实现了以烷烃为底物发酵生产长碳链二元酸的产业化，生物法制备得到十一至十四碳二元酸已投放市场。如中国专利文献CN1570124A(申请号2004100182557)、中国专利文献CN1844404A(申请号CN200610038331X)、中国专利文献CN101225411A(申请号2007101958427)、中国专利文献CN102115769A(申请号2009102565907)、中国专利文献CN102115768A(申请号2009102565890)、中国专利文献CN102115766A(申请号2009102565871)、中国专利文献CN102115765A(申请号2009102565867)、中国专利文献CN102061316A(申请号2010101603101)和中国专利文献CN103805642A(申请号2012104397995)等。
目前微生物发酵法生产长链二元酸的技术特别是微生物育种方面日趋成熟，如中国专利文献CN103992959A(申请号2014101755564)通过增加一个拷贝的CYP单加氧酶基因提高热带假丝酵母长链二元酸的产率，中国专利文献CN102839133A(申请号CN201110168672X)则菌种诱变育种筛选到一株pox4基因、fao基因和CYP52A18基因的突变株，突变株对不同碳链长度的烷烃、脂肪酸等物质具有很高的转化性能，虽然通过多种育种手段二元酸生产微生物的产量有了一定程度的提升，但转化率与理论转化率相比依然还有较大的提升空间，同时由于微生物发酵法生产长链二元酸的主要菌种热带假丝酵母为二倍体，因此通过传统的诱变育种方式获取高产率突变株难度较高。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种调控产长链二元酸的基因及其应用。
本发明技术方案如下：
一种长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。该基因来源于热带假丝酵母，其表达可以反向调控长链二元酸的转化率。该序列第2110～4308bp编码732个氨基酸的长链脂肪酸转运蛋白Pxa1p。
上述长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p表达的长链脂肪酸转运蛋白Pxa1p，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。长链脂肪酸转运蛋白Pxa1p首先被转运到过氧化物酶体膜上，与其它脂肪酸转运相关蛋白结合形成多聚体后可以特异性的将位于细胞质中的长链脂肪酸转运到过氧化物酶体中，并做为β-氧化作用的底物消耗掉。
上述长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p在生产长链二元酸中的应用。
上述应用，通过基因工程手段对热带假丝酵母中的长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p进行基因敲除，构建热带假丝酵母基因工程重组菌，再利用热带假丝酵母基因工程重组菌发酵生产长链二元酸。
对热带假丝酵母pxa1p基因进行基因敲除，可以减弱长链脂肪酸转运至过氧化物酶体内进行有氧氧化过程，使烷烃或油脂更多的进入形成二元酸的转化过程，从而提高二元酸转化率及产量。
根据本发明优选的，所述热带假丝酵母基因工程重组菌的发酵，步骤如下：
将热带假丝酵母基因工程重组菌种子液接种于发酵培养基中，28～32℃条件下培养12～14小时，然后调pH至7.0～8.0，接入油脂或烷烃进入产酸期发酵，维持pH7.0～8.0，每10～14小时流加葡萄糖溶液至发酵液中葡萄糖浓度为2.5～20g/L，发酵产酸4～5天，即得；
所述发酵培养基组分如下：
葡萄糖40～60g/L、(NH4)2SO40.5～1g/L、玉米浆1～2g/L、酵母膏1～2g/L、VB10.1～0.2g/L、NaCl1～2g/L、KH2PO44～8g/L、Na2HPO4·12H2O5～10.08g/L、尿素2～3g/L、Mg2SO4·7H2O5～6.15g/L、吐温600.02～0.5g/L、泡敌3g/L，水配制，pH6.0～7.0。
进一步优选的，所述热带假丝酵母基因工程重组菌种子液采用如下方法制备：
将热带假丝酵母基因工程重组菌接种于种子培养基中，28～32℃、200～250rpm条件下培养14～16小时，制得热带假丝酵母基因工程重组菌种子液；
所述种子培养基组分如下：
酵母浸粉5～10g/L、蛋白胨10～20g/L、葡糖糖20～30g/L，水配制，pH自然。
进一步优选的，所述调pH的pH调节剂为氢氧化钠。
上述热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法，步骤如下：
(1)提取热带假丝酵母菌体的基因组DNA，以基因组DNA为模板，用引物Pxa1p1-up和Pax1p1-down进行PCR扩增，制备用于pxa1p基因敲除的同源臂pxa1p1；
所述的PCR引物核苷酸序列如下：
Pxa1p1-up:GGAATTCCCTGCTTCTTATACCAATGCC
Pax1p1-down:ACCTGGCTGGGGTTGAGGCCGTTGAGCAC
(2)提取pPIC9K质粒，并以此为模板，使用引物Kan-up和Kan-down进行PCR扩增，得到G418抗性基因片段Kan；
所述的PCR引物序列如下：
Kan-up:GTGCTTAAATATACCTGGCTGGGGTTGAGGCCGTTG
Kan-down:CTTGCCGGGTCTTCTTTAGGGAATTCACTTGA
(3)将步骤(1)制得的用于pxa1p基因敲除的同源臂pxa1p1与步骤(2)制得的G418抗性基因片段Kan进行重叠PCR，制得pxa1p1-kan片段；
(4)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，使用引物Pxa1p2-up和Pax2p2-down进行PCR扩增，得到同源臂pxa1p2；
Pxa1p2-up:TCACTGTCCGACTTCAAGTGAATTCCCTAAAGAAGACC
Pax2p2-down:TTGATCACGCAAACTTCC
(5)将步骤(3)制得的pxa1p1-kan片段与步骤(4)制得的同源臂pxa1p2进行重叠PCR，制得pxa1p1-kan-pxa1p2片段；
(6)将步骤(5)制得的pxa1p1-kan-pxa1p2片段经限制性内切酶EcoRI酶切，转化热带假丝酵母，经筛选，制得热带假丝酵母基因工程重组菌。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，所述的PCR扩增体系为50μl：
2×HiFi-PCRmaster25μl，浓度为10μmol/L引物Pxa1p1-up2.5μl，浓度为10μmol/L引物Pax1p1-down2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，所述的PCR扩增体系为50μl：
2×HiFi-PCRmaster25μl，浓度为10μmol/L引物Kan-up2.5μl，浓度为10μmol/L引物Kan-down2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
用于pxa1p基因敲除的同源臂pxa1p14μl；G418抗性基因片段Kan4μl；2×HiFi-PCRmaster12.5μl；ddH2O4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
浓度为10μmol/L的上游引物Pxa1p1-up2μl；浓度为10μmol/L的下游引物Kan-down2μl；2×HiFi-PCRmaster12.5μl；ddH2O8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，所述的PCR扩增体系为50μl：
2×HiFi-PCRmaster25μl，浓度为10μmol/L的引物Pxa1p1-up2.5μl，浓度为10μmol/L的引物Pax1p1-down2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
根据本发明优选的，所述步骤(5)中，重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
pxa1p1-kan片段4μl；同源臂pxa1p24μl；2×HiFi-PCRmaster12.5μl；ddH2O4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸5min，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
浓度为10μmol/L的上游引物pxa1p1-up2μl；浓度为10μmol/L的下游引物pxa1p1-down2μl；2×HiFi-PCRmaster12.5μl；ddH2O8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸6min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
根据本发明优选的，所述步骤(6)中，筛选为将转化后的热带假丝酵母涂在含G418的YPD平板上，在30℃培养2～3天，筛选具有G418抗性的转化子，即得。
上述热带假丝酵母(Candidatropicalis)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；编号为CICC1798。
有益效果
本发明首次发现热带假丝酵母中的长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p具有反向调控二元酸产生速率的作用，通过基因工程手段对热带假丝酵母pxa1p基因进行基因敲除，减弱长链脂肪酸转运至过氧化物酶体内进行有氧氧化过程，使烷烃或油脂更多的进入形成二元酸的转化过程，从而提高二元酸转化率及产量。本发明所述热带假丝酵母基因工程重组菌能够有效降低所产生的二元酸及中间产物一元酸的消耗，进而大幅提升二元酸转化率及产量。
附图说明
图1、同源臂pxa1p1、pxa1p2和G418抗性基因片段Kan的电泳结果照片；
图2、pxa1p1-kan片段的电泳结果照片；
图3、pxa1p1-kan-pxa1p2片段的电泳及酵母基因组PCR验证结果照片；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源：
质粒pPIC9K购自宝生物有限公司；
热带假丝酵母(Candidatropicalis)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；编号为CICC1798；
实施例1
目前关于长链脂肪酸转运蛋白的研究非常少，已知仅酿酒酵母中存在特殊的长链脂肪酸转运蛋白负责长链脂肪酸至过氧化物酶体的转运(JournalofBiologicalChemistry,2012,287:20144-20153)，而热带假丝酵母中类似基因尚未被报道。以酿酒酵母pxa1p基因为模板在NCBI数据库查询可知，热带假丝酵母基因组中存在相似基因序列，其序列如SEQIDNO.1所示，所编码的蛋白质与酿酒酵母中的Pxa1p序列一致性为41％，推测其与长链脂肪酸转运和消耗有关并命名为长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p，经后续验证，其第2110～4308bp编码732个氨基酸的长链脂肪酸转运蛋白Pxa1p。
实施例2
热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法，步骤如下：
(1)提取热带假丝酵母(Candidatropicalis)菌体的基因组DNA，并以基因组为模板，进行PCR扩增，得到同源臂pxa1p1(如图1第1、2泳道所示，长度553bp)，
所述的PCR引物序列如下：
Pxa1p1-up:GGAATTCCCTGCTTCTTATACCAATGCC
Pax1p1-down：ACCTGGCTGGGGTTGAGGCCGTTGAGCAC
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×HiFi-PCRmaster25μl，引物Pxa1p1-up(10μmol/L)2.5μl，引物Pax1p1-down(10μmol/L)2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(2)提取pPIC9K质粒，并以此为模板，进行PCR扩增，得到Kan片段(如图1第3、4泳道所示，长度1586bp)；
所述的PCR引物序列如下:
Kan-up:GTGCTTAAATATACCTGGCTGGGGTTGAGGCCGTTG
Kan-down:CTTGCCGGGTCTTCTTTAGGGAATTCACTTGA
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×HiFi-PCRmaster25μl，引物Kan-up(10μmol/L)2.5μl，引物Kan-down(10μmol/L)2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(3)将步骤(1)制得的pxa1p1片段与步骤(2)制得的kan片段进行重叠PCR，制得pxa1p1-kan片段(如图2第3、4泳道所示，长度2139bp)；
所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
pxa1p1片段4μl；kan片段4μl；2×HiFi-PCRmaster12.5μl；ddH2O4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物Pxa1p1-up2μl；下游引物Kan-down2μl；2×HiFi-PCRmaster12.5μl；ddH2O8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(4)提取Candidatropicalis菌体的基因组DNA，并以此模板，进行PCR扩增，得到同源臂pxa1p2(如图1第5、6泳道所示，长度568bp)，
所述的PCR引物序列如下：
Pxa1p2-up:TCACTGTCCGACTTCAAGTGAATTCCCTAAAGAAGACC
Pax2p2-down:TTGATCACGCAAACTTCC
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×HiFi-PCRmaster25μl，引物Pxa1p1-up(10μmol/L)2.5μl，引物Pax1p1-down(10μmol/L)2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(5)将步骤(3)制得的pxa1p1-kan片段与步骤(4)制得的pxa1p2片段进行重叠PCR，制得pxa1p1-kan-pxa1p2片段(如图3第5-8泳道所示，长度2139bp)；
所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
pxa1p1-kan片段4μl；pxa1p2片段4μl；2×HiFi-PCRmaster12.5μl；ddH2O4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸5min，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物pxa1p1-up2μl；下游引物pxa1p1-down2μl；2×HiFi-PCRmaster12.5μl；ddH2O8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸6min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(6)将pxa1p1-kan-pxa1p2片段用限制性内切酶EcoRI消化，用电转化转化热带假丝酵母感受态细胞，并涂在含G418的YPD平板上，在30℃培养3天，筛选具有G418抗性的转化子。
实施例3
阳性重组菌的培养及鉴定
将上述筛选获得的阳性重组菌子接种到YPD液体培养基中培养过夜，吸取1mL菌液，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，pxa1p1-up和pxa1p2-down为引物进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳证明外源片段pxa1p1-kan-pxa1p2转化到基因组上(如图3第1-4泳道所示，长度2139bp)。
实施例4
利用上述热带假丝酵母基因工程重组菌发酵生产长链二元酸的方法，步骤如下：
将热带假丝酵母基因工程重组菌种子液接种于发酵培养基中，30℃条件下培养14小时，然后氢氧化钠调pH至7.5，接入十六烷进入产酸期发酵，维持pH7.5，每12小时流加葡萄糖溶液至发酵液中葡萄糖浓度为5g/L，发酵产酸5天，即得含有长链二元酸的发酵液；
所述发酵培养基组分如下：
葡萄糖40g/L、(NH4)2SO41g/L、玉米浆1g/L、酵母膏2g/L、VB10.1g/L、NaCl2g/L、KH2PO44g/L、Na2HPO4·12H2O10.08g/L、尿素2g/L、Mg2SO4·7H2O6.15g/L、吐温600.02g/L、泡敌3g/L，水配制，pH7.0；
所述热带假丝酵母基因工程重组菌种子液采用如下方法制备：
将热带假丝酵母基因工程重组菌接种于种子培养基中，30℃、220rpm条件下培养14小时，制得热带假丝酵母基因工程重组菌种子液；
所述种子培养基组分如下：
酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖30g/L，水配制，pH自然。
使用酸碱滴定法对二元酸的产量进行测定，测定结果显示热带假丝酵母基因工程重组菌的二元酸转化率由原始菌种的5％提高到了18.7％，产量由原始菌种的3.2g/L提高到了20g/L，十六碳二元酸的产率和产量都有了较大幅度的提升。

Claims (10)

1.一种长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p表达的长链脂肪酸转运蛋白Pxa1p，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.权利要求1所述长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p在生产长链二元酸中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，通过基因工程手段对热带假丝酵母中的长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p进行基因敲除，构建热带假丝酵母基因工程重组菌，再利用热带假丝酵母基因工程重组菌发酵生产长链二元酸。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述热带假丝酵母基因工程重组菌的发酵，步骤如下：
将热带假丝酵母基因工程重组菌种子液接种于发酵培养基中，28～32℃条件下培养12～14小时，然后调pH至7.0～8.0，接入油脂或烷烃进入产酸期发酵，维持pH7.0～8.0，每10～14小时流加葡萄糖溶液至发酵液中葡萄糖浓度为2.5～20g/L，发酵产酸4～5天，即得；
所述发酵培养基组分如下：
葡萄糖40～60g/L、(NH4)2SO40.5～1g/L、玉米浆1～2g/L、酵母膏1～2g/L、VB10.1～0.2g/L、NaCl1～2g/L、KH2PO44～8g/L、Na2HPO4·12H2O5～10.08g/L、尿素2～3g/L、Mg2SO4·7H2O5～6.15g/L、吐温600.02～0.5g/L、泡敌3g/L，水配制，pH6.0～7.0。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述热带假丝酵母基因工程重组菌种子液采用如下方法制备：
将热带假丝酵母基因工程重组菌接种于种子培养基中，28～32℃、200～250rpm条件下培养14～16小时，制得热带假丝酵母基因工程重组菌种子液；
所述种子培养基组分如下：
酵母浸粉5～10g/L、蛋白胨10～20g/L、葡糖糖20～30g/L，水配制，pH自然；
优选的，所述调pH的pH调节剂为氢氧化钠。
7.权利要求3所述热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)提取热带假丝酵母菌体的基因组DNA，以基因组DNA为模板，用引物Pxa1p1-up和Pax1p1-down进行PCR扩增，制备用于pxa1p基因敲除的同源臂pxa1p1；
所述的PCR引物核苷酸序列如下：
Pxa1p1-up:GGAATTCCCTGCTTCTTATACCAATGCC
Pax1p1-down:ACCTGGCTGGGGTTGAGGCCGTTGAGCAC
(2)提取pPIC9K质粒，并以此为模板，使用引物Kan-up和Kan-down进行PCR扩增，得到G418抗性基因片段Kan；
所述的PCR引物序列如下：
Kan-up:GTGCTTAAATATACCTGGCTGGGGTTGAGGCCGTTG
Kan-down:CTTGCCGGGTCTTCTTTAGGGAATTCACTTGA
(3)将步骤(1)制得的用于pxa1p基因敲除的同源臂pxa1p1与步骤(2)制得的G418抗性基因片段Kan进行重叠PCR，制得pxa1p1-kan片段；
(4)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，使用引物Pxa1p2-up和Pax2p2-down进行PCR扩增，得到同源臂pxa1p2；
Pxa1p2-up:TCACTGTCCGACTTCAAGTGAATTCCCTAAAGAAGACC
Pax2p2-down:TTGATCACGCAAACTTCC
(5)将步骤(3)制得的pxa1p1-kan片段与步骤(4)制得的同源臂pxa1p2进行重叠PCR，制得pxa1p1-kan-pxa1p2片段；
(6)将步骤(5)制得的pxa1p1-kan-pxa1p2片段经限制性内切酶EcoRI酶切，转化热带假丝酵母，经筛选，制得热带假丝酵母基因工程重组菌。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述的PCR扩增体系为50μl：
2×HiFi-PCRmaster25μl，浓度为10μmol/L引物Pxa1p1-up2.5μl，浓度为10μmol/L引物Pax1p1-down2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
优选的，所述步骤(2)中，所述的PCR扩增体系为50μl：
2×HiFi-PCRmaster25μl，浓度为10μmol/L引物Kan-up2.5μl，浓度为10μmol/L引物Kan-down2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
用于pxa1p基因敲除的同源臂pxa1p14μl；G418抗性基因片段Kan4μl；2×HiFi-PCRmaster12.5μl；ddH2O4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
浓度为10μmol/L的上游引物Pxa1p1-up2μl；浓度为10μmol/L的下游引物Kan-down2μl；2×HiFi-PCRmaster12.5μl；ddH2O8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。
9.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述的PCR扩增体系为50μl：
2×HiFi-PCRmaster25μl，浓度为10μmol/L的引物Pxa1p1-up2.5μl，浓度为10μmol/L的引物Pax1p1-down2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
优选的，所述步骤(5)中，重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
pxa1p1-kan片段4μl；同源臂pxa1p24μl；2×HiFi-PCRmaster12.5μl；ddH2O4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸5min，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
浓度为10μmol/L的上游引物pxa1p1-up2μl；浓度为10μmol/L的下游引物pxa1p1-down2μl；2×HiFi-PCRmaster12.5μl；ddH2O8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸6min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。
10.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中，筛选为将转化后的热带假丝酵母涂在含G418的YPD平板上，在30℃培养2～3天，筛选具有G418抗性的转化子，即得。
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