CN102031227A - 一种产延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用，属于遗传工程领域。本发明从能够大量积累延胡索酸的米根霉(RhizopusoryzaeNRRL1526)克隆延胡索酸积累途径中的关键基因苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)和富马酸酶基因(RoFUM1)，通过连接到能在酿酒酵母中高拷贝双向表达质粒pY26TEF/GPD，转化酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeBMA64)，获得产延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌。本发明公开的酿酒酵母工程菌可在胞质中积累延胡索酸，发酵方法简单，产量可达26.2mg/L，为代谢工程改造酿酒酵母生产延胡索酸的工业化奠定了基础。

Description

一种产延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种产延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用，属于遗传工程领域。

背景技术

延胡索酸(Fumaric acid)，又名富马酸(IUPAC名为反丁烯二酸)，是最简单的不饱和二羧酸。在工业、医药、食品及畜牧业中均有非常广泛的应用。2004年，美国联邦政府能源部专门成立了1,4-二羧酸组，主要研究延胡索酸和苹果酸及琥珀酸，而这三种有机酸包含在被称为最引人瞩目的可再生的十二大化工结构元件，同一年的世界经合组织(OCED)发展报告也将其列为着重发展的C4化合物。

石油化工路线(petrochemical routes)是当前延胡索酸的主要生产方法，但是随着石油价格的不断上涨以及石油资源的不可再生性，研究人员又把目光投向了微生物发酵法生产延胡索酸。目前研究得最多的微生物是米根霉(Rhizopus oryzae) 和少根根霉(Rhizopus arrhizus)。但是，R. oryzae和R. arrhizus表现出复杂的生长形态，在发酵过程中会形成菌丝、菌球和大块聚集物。其生长形态受多种因素的影响，如菌种本身的特性、营养供应情况、培养基的pH 值、搅拌通气、接种量和基质浓度等。菌丝和大块聚集物的形成会影响溶氧和传质，很大程度上会影响最终的结果。而且，R. oryzae是人、动物和植物的强致病菌；此外，由于它们的遗传信息和生化机制的研究较少，加上它产生分生孢子，对其直接进行代谢工程改造十分困难。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae）作为一种真核模式微生物，其遗传信息较为清楚，便于代谢工程研究；S. cerevisiae作为一种单细胞微生物，其营养要求简单，特别适合工业化生产；S. cerevisiae被美国FDA认证为GRAS(General Regarded As Safe)。S. cerevisiae的以上诸多优势，使得其已成为代谢工程生产有机酸的良好宿主，但S. cerevisiae本身并不积累延胡索酸。而R. oryzae可以积累大量的延胡索酸，13C同位素示踪研究表明R. oryzae积累延胡索酸主要是通过胞质三羧酸还原途径，即是通过丙酮酸羧化生成草酰乙酸，然后转化为苹果酸，进一步转化为延胡索酸。本发明从通过将R. oryzae的关键基因转化到酿酒酵母中表达，构建一条延胡索酸积累途径。代谢工程改造酿酒酵母生产延胡索酸目前国内外均未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是构建一种能积累延胡索酸的酿酒酵母工程菌，在其胞质中构建一条类似于米根霉的延胡索酸积累途径。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

克隆米根霉(Rhizopus oryzae)延胡索酸积累途径中关键酶基因苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)和富马酸酶基因(RoFUM1)于双向表达载体质粒pY26TEF/GPD，然后转化酿酒酵母（S. cerevisiae BMA64），通过改造代谢途径，得到可积累延胡索酸的酿酒酵母工程菌。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述工程菌发酵生产延胡索酸的方法。

将30℃、200 rpm下培养24 h的基因工程菌种子以5%的接种量转入发酵培养基于30℃、200 rpm条件下培养60 h，因S. cerevisiae BMA64为缺陷型菌株，培养基需添加不同浓度的Leu、Trp、Ade、His。

延胡索酸的测定方法：

高效液相（HPLC）检测法，色谱柱为ZORBAX SB-Aq柱，流动相为磷酸缓冲盐：磷酸二氢钾8.34 g，磷酸氢二钾 0.87 g，乙腈 5ml，加水定容到1000mL， 用磷酸调节pH至2.5。流速为1ml min-1，温度为35度，检测器选用Agilent 1200 DAD检测器，检测波长为210nm。

所用培养基：

SC培养基：Difco Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 1.7g/L, (NH4)2SO4  5 g/L, Glucose 20g/L。按要求分别添加Leu 100 mg/L、Trp 20 mg/L、Ade 20 mg/L、His 20 mg/L、Ura 20 mg/L。

种子培养基：SC培养基，装液量为20ml/瓶。

发酵培养基：SC培养基，添加碳酸钙，5g/L，装液量为50ml/瓶。

本发明提供的基因工程菌可积累延胡索酸，其浓度可达到26.2 mg/L，为代谢工程改造酿酒酵母生产延胡索酸的工业化奠定了基础。本基因工程菌的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

 

实施例 1 产延胡索酸的酿酒酵母工程菌

一种产延胡索酸的酿酒酵母工程菌，携带有苹果酸脱氢酶基因(RoMDH) 序列如SEQ ID:1所示，和富马酸酶基因(RoFUM1)，序列如SEQ ID:2所示

实施例 2产延胡索酸的酿酒酵母工程菌的构建方法

1、菌株和质粒

米根霉(R.oryzae NRRL 1526)购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)；酿酒酵母(S. cerevisiae BMA64)购自欧洲EUROSCARF，其基因型为MAT a/α  ura 3-1 ade 2-1 leu 2-3, 112  his3-11, 15  trp1D can 1-100；酿酒酵母双向表达质粒pY26TEF/GPD(catalog number YV8124)购自德而宝生物技术有限公司。

 2、基因的克隆

提取米根霉(R.oryzae NRRL 1526)的总RNA，通过RT-PCR获得成熟的苹果酸脱氢酶基因RoMDH和富马酸酶基因RoFUM1，克隆到表达质粒pY26TEF/GPD(catalog number YV8124)。将测序结果递交到Genbank，并已公布，RoMDH的编号为HM130702.1，RoFUM1的编号为HM130701.1。克隆RoFUM1所用的引物为F1:ATGTTGCGAGCTTCTGCTACC, R1: TTAATCCTTGGCAGAGATCATATCTT; 克隆RoMDH所用的引物为F2:ATGTTTGCCGCCTCTCGTG, R2: TTATTGAACAAAGCTGTTACCCTTG。 将两端分别带有BamHI和HindIII两个酶切位点及保护碱基的RoMDH连接到pMDTM19-T Simple Vector，然后用BamHI和Hind进行双酶切，获得的基因片段，连接到经过同样酶切的pY26TEF-GPD；将两端分别带NotI和BglII两个酶切位点及保护碱基的的RoFUM 1连接到pMDTM19-T Simple Vector，然后用NotI和BglII进行双酶切，获得的基因片段，连接到经过同样酶切的pY26TEF-GPD-RoMDH，转化大肠杆菌JM109，获得的转化子经菌落PCR验证、提取质粒酶切验证及测序确认为重组质粒 pY26TEF-GPD-RoMDH-RoFUM1.

3、转化及验证

将构建好的质粒转化酿酒酵母（S. cerevisiae BMA64），提取转化子的质粒，酶切验证，确认为阳性转化子，将阳性转化子进行发酵实验，结果显示：通过改造代谢途径，得到可积累延胡索酸的酿酒酵母工程菌。

实施例3 发酵生产延胡索酸

将30℃、200 rpm下培养24 h的基因工程菌种子以5%的接种量转入发酵培养基于30℃、200 rpm条件下培养60 h，培养基中按实验要求添加不同浓度的Leu、Trp、Ade、His。

SC培养基：Difco Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 1.7g/L, (NH4)2SO4  5 g/L, Glucose 20g/L。按要求分别添加Leu 100 mg/L、Trp 20 mg/L、Ade 20 mg/L、His 20 mg/L、Ura 20 mg/L。

种子培养基：SC培养基，装液量为20ml/瓶。

发酵培养基：SC培养基，添加碳酸钙，5g/L，装液量为50ml/瓶。

延胡索酸含量的测定方法：

高效液相（HPLC）检测法，色谱柱为ZORBAX SB-Aq柱，流动相为磷酸缓冲盐：磷酸二氢钾8.34 g，磷酸氢二钾 0.87 g，乙腈 5ml，加水定容到1000mL， 用磷酸调节pH至2.5。流速为1ml min-1, 温度为35度，检测器选用Agilent 1200 DAD检测器，检测波长为210nm. 

通过代谢工程改造不产延胡索酸的酵母菌得到本发明提供的可积累延胡索酸酵母基因工程菌，延胡索酸含量可达26.2 mg/L，为代谢工程改造酿酒酵母生产延胡索酸的工业化奠定了基础。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种产延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用

<160> 6     

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1014

<212> DNA

<213>米根霉（Rhizopus oryzae NRRL 1526）

<400> 1

atgtttgccg cctctcgtgt tttctctatt gctgccaagc gttctttctc tacttctgct     60

gctaatcttt ccaaggttgc cgttcttggc gctgctggtg gtattggtca acccttgtct    120

ttgttgttga aggaaaaccc tcacgtcacc cacctttctc tttatgatat tgtcaacact    180

cctggtgtcg ctgccgatct tagccacatc aacaccaact ccaaggtcac tggccacacc    240

cctgaaaacg atggtttgaa gactgctctt gaaggtgctc acgttgttgt tattcctgct    300

ggcgttcctc gtaagcctgg tatgacccgt gatgatttat tcaacaccaa tgcttccatt    360

gttcgtgacc ttgctgaagc tgctgccaag cactgtcccg acgctcattt ccttatcatc    420

tccaaccctg tcaactccac tgttcccatc tttgccgaaa ccttaaagaa ggctggtgtc    480

ttcaacccta agcgtttgta tggtgtcacc actcttgatg tcgtccgtgc ctctcgcttc    540

gttgccgaag tcaagaactt ggaccccaac gatgtcaagg ttaccgttgt cggtggtcac    600

tctggtgtga ctattgtccc tctcctctct caaaccggtc tcgaattcag caaggaagaa    660

ctcgatgcct tgacccaccg tatccaattc ggtggtgatg aagtcgttca agccaagaat    720

ggtactggtt ctgtcactct ctccatggcc tttgccggtg ctcgtttcgc caactctgtc    780

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<210> 2

<211> 1485

<212> DNA

<213>米根霉（Rhizopus oryzae NRRL 1526）

<400> 2

atgttgcgag cttctgctac cagattctta agtcaagcta aaaacatgaa caactctcct     60

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cacgatgctc tcgttgaagc tcacggagct ctcaataccg ttgcttgttc tcttatgaag    960

atcgccaacg atatccgtta tcttggttct ggacctcgct gtggtcttgg tgagctttcc   1020

ttgcctgaaa acgaacccgg atcttctatc atgcccggta aggttaatcc tactcaatgt   1080

gaagctatga ccatggtctg tgctcaagtc atgggtaaca acactgctat ttctgttgct   1140

ggttccaatg gtcaattcga gcttaatgtc ttcaaacccg tcatgatcaa gaacttgatc   1200

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gaccagtggg ttagacccga agatatgatc tctgccaagg attaa                   1485

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220> 

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

 

<400> 3

atgttgcgag cttctgctac c                                               21

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220> 

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

 

<400> 4

ttaatccttg gcagagatca tatctt                                          26

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220> 

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

 

<400> 5

atgtttgccg cctctcgtg                                                  19

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220> 

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

 

<400> 6

ttattgaaca aagctgttac ccttg                                           25

Claims (3)

1.一种产延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌，携带有米根霉苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)和富马酸酶基因(RoFUM1)。

2.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)和富马酸酶基因(RoFUM1)克隆于双向表达载体质粒pY26TEF/GPD上。

3.权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步：构建重组质粒

克隆米根霉(Rhizopus oryzae)苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)和富马酸酶基因(RoFUM1)到pY26TEF/GPD，构建重组质粒pY26TEF/GPD- RoMDH- RoFUM1；

第二步：构建有效积累富马酸的基因工程菌

将构建的重组质粒转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae BMA64），获得产延胡索酸酿酒酵母基因工程菌。