CN111500608B

CN111500608B - 一种引入信号肽的抗菌肽串联基因及其应用

Info

Publication number: CN111500608B
Application number: CN202010288835.7A
Authority: CN
Inventors: 王东升; 黄江丽; 圣平; 张国华; 张志红; 田晓娟; 何力; 王入霞
Original assignee: INSTITUTE OF BIOLOGICAL RESOURCES JIANGXI ACADEMY OF SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF BIOLOGICAL RESOURCES JIANGXI ACADEMY OF SCIENCES
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2040-04-14
Also published as: CN111500608A

Abstract

本发明提供了一种引入信号肽的抗菌肽串联基因及其应用，涉及抗菌肽技术领域。本发明提供了一种引入信号肽的抗菌肽串联基因、串联基因的构建方法、包含所述串联基因的重组表达载体和抗菌重组毕赤酵母。本发明通过将来源于扣囊复膜孢酵母的2个信号肽经过序列改良和优化后，用于鸡源抗菌肽的在毕赤酵母中串联表达，得到抗菌重组毕赤酵母，通过发酵罐发酵，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达，实现很强的抑菌效果。

Description

一种引入信号肽的抗菌肽串联基因及其应用

技术领域

本发明属于抗菌肽技术领域，具体涉及一种引入信号肽的抗菌肽串联基因及其应用。

背景技术

抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，通常由12～45个氨基酸组成，分子量约为40kD，不易使细菌产生耐药性；此外，还具有广谱抗菌性、热稳定性、高水溶性以及无残留等特点。然而，天然抗菌肽含量很少，达不到应用要求，因此通过微生物工程来生产抗菌肽是一个很好的途径。但是目前利用微生物工程生产抗菌肽时，依然存在表达量少和表达不稳定的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种引入信号肽的抗菌肽串联基因、串联基因的构建方法、包含所述串联基因的重组表达载体和抗菌重组毕赤酵母，使鸡源抗菌肽在毕赤酵母中获得高效表达，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达，实现很强的抑菌效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种引入信号肽的抗菌肽串联基因，所述串联基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述串联基因的构建方法，包括以下步骤：在来源于扣囊复膜孢酵母的信号肽1的DNA序列的5’端引入限制性酶切位点XhoⅠ的酶切位点，3’端引入Kex2酶切位点后，在3’端依次连接鸡源抗菌肽、来源于扣囊复膜孢酵母的信号肽2、Kex2酶切位点、鸡源抗菌肽和XbaⅠ酶切位点；

所述来源于扣囊复膜孢酵母的信号肽1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述鸡源抗菌肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述来源于扣囊复膜孢酵母的信号肽2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述来源于扣囊复膜孢酵母的信号肽1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述来源于扣囊复膜孢酵母的信号肽2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了一种抗菌肽表达载体的构建方法，包括以下步骤：将所述串联基因和表达载体分别用XbaⅠ和XhoⅠ双酶切后，酶切产物连接后，得重组载体。

优选的，所述表达载体包括pPICZαB。

本发明还提供了一种利用所述构建方法构建得到的抗菌肽表达载体pPICZαB-抗菌肽串联基因。

本发明还提供了一种抗菌重组毕赤酵母的构建方法，包括以下步骤：将所述抗菌肽表达载体的质粒用SacⅠ单酶切线性化后，转化毕赤酵母感受态细胞。

本发明还提供了利用所述构建方法构建得到的抗菌重组毕赤酵母。

本发明还提供了所述抗菌重组毕赤酵母在抗菌肽发酵中的应用。

本发明提供了一种引入信号肽的抗菌肽串联基因，将来源于扣囊复膜孢酵母的2个信号肽经过序列改良和优化后，用于鸡源抗菌肽的在毕赤酵母中串联表达，得到抗菌重组毕赤酵母，通过发酵罐发酵，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达，实现很强的抑菌效果。对得到的所述抗菌重组毕赤酵母进行牛津杯抑菌实验，引入扣囊复膜孢酵母信号肽的抗菌肽表达量比没有引入信号肽的要多1.5倍(通过发酵液稀释位数和抑菌圈的大小来确定的)，引入扣囊复膜孢酵母信号肽的抗菌肽重组菌发酵液抑菌能力比100mg/mL氨苄青霉素要强。

附图说明

图1为本发明实施例中发酵液牛津杯抑菌实验图，其中A抑菌圈是加入没有用扣囊复膜孢酵母信号肽表达的抗菌肽发酵液200μL；B抑菌圈加入浓度为100mg/mL氨苄青霉素200μL；C抑菌圈是加入用扣囊复膜孢酵母信号肽串联表达的抗菌肽发酵液200μL；

图2为质粒pUC57-Simple图谱；

图3为表达载体pPICZαB图谱。

具体实施方式

本发明提供了一种引入信号肽的抗菌肽串联基因，所述串联基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

TAGGACTCCAAGGCTGACCCTGTCATGATGCAGCTTAGCGAAGCTGCGCTACTCGCATCTCTGGCTGCCCTAGTGTATGCCCAACCAGTAACTTTGTTCAAGAGAGAGATCAAAGACAAGACCAATGCATGGAGGAGTCAATCCATAGTCTACCAGCGATTCATTACGGATGCTGGAGATACAGACCGCACCTCAGCGAACACGTCGTGTCGTGAGGACTTATATTGTGGAGGTTCAATCAAGTTACAGGGCATCAAACTGGATTACGATGAGAAAAGACGTGTCAAGCGAGTTTGGCCACTGGTCATCAGAACTGTTATTGCTGGATACAACCTTTACCGTGCTATCAAGAAGAAGTAACAAGCTTTGCCACCTCGCAGCATGATGTTATTCGAGAAGAGCTTGATCCTTAGTGTACTCCTAAGCCTGAGTTTAGCTGCACCAGTCGAGAAACGAGAGAAGACACTTGATGGTACCTTTGACAAGGTTCGTATATCTAAAGCCCTAAACGTGACTGTAGCGTCCTCACCTGGATTCCTCGAACGCAATCTGTCGAGAGCAGCTGATGCAGGTGTAACGATCTTCTCTCGGTACTCGAGCAAGAACGAATATCTAACCATTACAGAGATCGAGAAAAGACGTGTCAAGCGAGTTTGGCCACTGGTCATCAGAACTGTTATTGCTGGATACAACCTTTACCGTGCTATCAAGAAGAAGTGA

在本发明SEQ ID NO.1所示的序列中，在Xho酶切位点和信号肽1之间存在一段冗余序列(SEQ IDNO.7：GACTCCAAGGCTGACCCTGTC)，延长抗菌肽串联表达无关的表达终止子(TAG)和下游的抗菌肽表达的起始密码子ATG之间的距离，否则会影响信使RNA(mMRA)上翻译因子与起始密码子(ATG)的顺利结合，从而影响抗菌肽的翻译表达；同理在抗菌肽和信号肽2之间(表达终止子TAA和下一个表达起始密码子ATG之间)同样存在一条冗余序列(SEQ ID NO.8：CAAGCTTTGCCACCTCGCAGC)。

所述鸡源抗菌肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

本发明所述来源于扣囊复膜孢酵母的信号肽1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：ATGCAGCTTAGCGAAGCTGCGCTACTCGCATCTCTGGCTGCCCTAGTGTATGCCCAACCAGTAACTTTGTTCAAGAGAGAGATCAAAGACAAGACCAATGCATGGAGGAGTCAATCCATAGTCTACCAGCGATTCATTACGGATGCTGGAGATACAGACCGCACCTCAGCGAACACGTCGTGTCGTGAGGACTTATATTGTGGAGGTTCAATCAAGTTACAGGGCATCAAACTGGATTACGAT，其编码氨基酸的序列优选如SEQ ID NO.5所示：MQLSEAALLASLAALVYAQPVTLFKREIKDKTNAWRSQSIVYQRFITDAGDTDRTSANTSCREDLYCGGSIKFQGIKLDYD。

本发明所述来源于扣囊复膜孢酵母的信号肽2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：ATGTTATTCGAGAAGAGCTTGATCCTTAGTGTACTCCTAAGCCTGAGTTTAGCTGCACCAGTCGAGAAACGAGAGAAGACACTTGATGGTACCTTTGACAAGGTTCGTATATCTAAAGCCCTAAACGTGACTGTAGCGTCCTCACCTGGATTCCTCGAACGCAATCTGTCGAGAGCAGCTGATGCAGGTGTAACGATCTTCTCTCGGTACTCGAGCAAGAACGAATATCTAACCATTACAGAGATC，其编码的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.6所示：MLFEKSLILSVLLSLSFAAPVEKREKTLDGTFDKVRISKALNVTVASSPGFLERNLSRAADAGVTIFSRYSSKNEYLTITEI。

本发明所述鸡源抗菌肽的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示：CGTGTCAAGCGAGTTTGGCCACTGGTCATCAGAACTGTTATTGCTGGATACAACCTTTACCGTGCTATCAAGAAGAAG，编码氨基酸序列优选如SEQ ID NO.9所示：RVKRVWPLVIRTVIAGYNLYRAIKKK。

本发明在所述双酶切前优选还包括将所述串联基因连接到如图2所示的质粒pUC57-simple上，然后双酶切，得双酶切产物1。本发明所述表达载体优选包括pPICZαB(图3)，然后利用与上述相同的酶进行双酶切，得双酶切产物2。本发明优选将所述双酶切产物1和双酶切产物2分别胶回收后再连接，本发明对所述胶回收和连接的方法并没有特殊限定。

本发明还提供了一种抗菌重组毕赤酵母的构建方法，包括以下步骤：将所述抗菌肽表达载体的质粒用SacⅠ单酶切线性化后，转化毕赤酵母感受态细胞。本发明对所述转化的方法并没有特殊限定，优选为电转化。本发明在所述转化后优选还包括阳性转化子筛选，所述阳性转化子筛选优选包括：转化后用含100μg/mL博莱霉素的YPD平板选择阳性转化子，平板在30℃培养3～5天，长出来的菌株经过提取基因组DNA，用引物P1(SEQ ID NO.10：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′)和P2(SEQ ID NO.11：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)进行PCR扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳、染色后观察，PCR扩增产物经测序来鉴定阳性转化子。

本发明还提供了所述抗菌重组毕赤酵母在抗菌肽高密度发酵和高效表达中的应用。本发明应用所述抗菌重组毕赤酵母进行抗菌肽高密度发酵和高效表达时，所述发酵优选在30℃、200r/min、pH值5.5、溶氧30％的条件下进行，当溶氧突然升高2h后，流加甲醇，控制甲醇含量在0.3％～0.5％范围内，持续发酵15h，而后离心，上清液即为抗菌肽液。

下面结合实施例对本发明提供的引入信号肽的抗菌肽串联基因及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)引入信号肽的抗菌肽基因的串联序列合成

来源于扣囊复膜孢酵母经过改良的信号肽1的DNA序列(SEQ ID NO.2)，5’端引入限制性酶切位点XhoⅠ，3’端引入Kex2酶切位点(氨基酸酶切位点)的DNA序列，后面连接上抗菌肽DNA序列(其末端加终止序列TAA，SEQ ID NO.3)，接上来源于扣囊复膜孢酵母经过改良的信号肽2的DNA序列(SEQ ID NO.4)后，再接上Kex2酶切位点(氨基酸酶切位点)的DNA序列，然后再连上抗菌肽DNA序列(其末端加终止序列TGA，SEQ ID NO.3)，最后引入XbaⅠ酶切位点，形成如SEQ ID NO.1所示的序列。设计好的这个序列提交DNA合成公司进行合成，连接到如图2所示的质粒pUC57-simple上。

(2)抗菌肽表达载体的构建

将合成好的含信号肽的抗菌肽基因串联序列和表达载体pPICZαB(图3)均用XbaⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物琼脂糖凝胶电泳切胶回收并连接，转化大肠杆菌DH5α，送测序公司鉴定序列是否正确。

(3)重组阳性质粒转化毕赤酵母菌株和阳性转化子筛选

重组质粒用SacⅠ单酶切线性化用于转化毕赤酵母感受态细胞，电转化后用含100μg/mL博莱霉素的YPD平板选择阳性转化子，平板在30℃培养3～5天，长出来的菌株经过提取基因组DNA，用引物P1和P2进行PCR，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，产物经测序来鉴定阳性转化子。

(4)阳性重组酵母菌的发酵诱导表达

将筛选到的阳性重组毕赤酵母菌单菌落接种于含100μg/mL博莱霉素的5mLYPD液体培养的管中，在30℃180r/min的条件下培养至OD₆₀₀值为2时，取1mL菌液接种于含有150mLYPD培养液的500mL的三角瓶中在180r/min的条件下过夜培养，最后以8％的接种量接入含BMGY培养基的发酵罐，在30℃、200r/min、pH值5.5、溶氧30％的条件下进行发酵，当溶氧突然升高2h后，流加甲醇，控制甲醇含量在0.3％～0.5％范围内，持续发酵15h。发酵液6000r/min离心10min，收集上清即为供试抗菌肽，于4℃存放。

BMGY培养基的配制(1000mL)：20g蛋白胨，10g酵母提取物，加水至700mL；115℃高温灭菌30min。然后分别在无菌条件下加入10×YNB 100mL，10×磷酸钾缓冲液(pH值6.0)100mL，10×甘油100mL。

(5)牛津杯抑菌实验

实验以鼠伤寒沙门氏菌作为指示菌，在液体LB培养基中培养至浓度10⁶CFU/mL，取80μL菌悬液于LB固体培养基中涂布均匀，放上灭菌牛津杯并轻轻按一下，牛津杯中加入200μL发酵液，过夜培养，观察并测量并记录抑菌圈大小，如图1所示：引入扣囊复膜孢酵母信号肽的抗菌肽表达量比没有引入信号肽的要多1.5倍(通过发酵液稀释位数和抑菌圈的大小来确定的)，引入扣囊复膜孢酵母信号肽的抗菌肽重组菌发酵液抑菌能力比100mg/mL氨苄青霉素要强。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江西省科学院生物资源研究所

<120> 一种引入信号肽的抗菌肽串联基因及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcgagtagg actccaaggc tgaccctgtc atgatgcagc ttagcgaagc tgcgctactc 60

gcatctctgg ctgccctagt gtatgcccaa ccagtaactt tgttcaagag agagatcaaa 120

gacaagacca atgcatggag gagtcaatcc atagtctacc agcgattcat tacggatgct 180

ggagatacag accgcacctc agcgaacacg tcgtgtcgtg aggacttata ttgtggaggt 240

tcaatcaagt tacagggcat caaactggat tacgatgaga aaagacgtgt caagcgagtt 300

tggccactgg tcatcagaac tgttattgct ggatacaacc tttaccgtgc tatcaagaag 360

aagtaacaag ctttgccacc tcgcagcatg atgttattcg agaagagctt gatccttagt 420

gtactcctaa gcctgagttt agctgcacca gtcgagaaac gagagaagac acttgatggt 480

acctttgaca aggttcgtat atctaaagcc ctaaacgtga ctgtagcgtc ctcacctgga 540

ttcctcgaac gcaatctgtc gagagcagct gatgcaggtg taacgatctt ctctcggtac 600

tcgagcaaga acgaatatct aaccattaca gagatcgaga aaagacgtgt caagcgagtt 660

tggccactgg tcatcagaac tgttattgct ggatacaacc tttaccgtgc tatcaagaag 720

aagtgatcta ga 732

<210> 2

<211> 243

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcagctta gcgaagctgc gctactcgca tctctggctg ccctagtgta tgcccaacca 60

gtaactttgt tcaagagaga gatcaaagac aagaccaatg catggaggag tcaatccata 120

gtctaccagc gattcattac ggatgctgga gatacagacc gcacctcagc gaacacgtcg 180

tgtcgtgagg acttatattg tggaggttca atcaagttac agggcatcaa actggattac 240

gat 243

<210> 3

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtgtcaagc gagtttggcc actggtcatc agaactgtta ttgctggata caacctttac 60

cgtgctatca agaagaag 78

<210> 4

<211> 246

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgttattcg agaagagctt gatccttagt gtactcctaa gcctgagttt agctgcacca 60

gtcgagaaac gagagaagac acttgatggt acctttgaca aggttcgtat atctaaagcc 120

ctaaacgtga ctgtagcgtc ctcacctgga ttcctcgaac gcaatctgtc gagagcagct 180

gatgcaggtg taacgatctt ctctcggtac tcgagcaaga acgaatatct aaccattaca 240

gagatc 246

<210> 5

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Gln Leu Ser Glu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Leu Ala Ala Leu Val

1 5 10 15

Tyr Ala Gln Pro Val Thr Leu Phe Lys Arg Glu Ile Lys Asp Lys Thr

20 25 30

Asn Ala Trp Arg Ser Gln Ser Ile Val Tyr Gln Arg Phe Ile Thr Asp

35 40 45

Ala Gly Asp Thr Asp Arg Thr Ser Ala Asn Thr Ser Cys Arg Glu Asp

50 55 60

Leu Tyr Cys Gly Gly Ser Ile Lys Phe Gln Gly Ile Lys Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Asp

<210> 6

<211> 82

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Leu Phe Glu Lys Ser Leu Ile Leu Ser Val Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Phe Ala Ala Pro Val Glu Lys Arg Glu Lys Thr Leu Asp Gly Thr Phe

20 25 30

Asp Lys Val Arg Ile Ser Lys Ala Leu Asn Val Thr Val Ala Ser Ser

35 40 45

Pro Gly Phe Leu Glu Arg Asn Leu Ser Arg Ala Ala Asp Ala Gly Val

50 55 60

Thr Ile Phe Ser Arg Tyr Ser Ser Lys Asn Glu Tyr Leu Thr Ile Thr

65 70 75 80

Glu Ile

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gactccaagg ctgaccctgt c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caagctttgc cacctcgcag c 21

<210> 9

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Arg Val Lys Arg Val Trp Pro Leu Val Ile Arg Thr Val Ile Ala Gly

1 5 10 15

Tyr Asn Leu Tyr Arg Ala Ile Lys Lys Lys

20 25

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims

1.一种引入信号肽的抗菌肽串联基因，其特征在于，所述串联基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.权利要求1所述串联基因的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：在来源于扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fbuliger)的信号肽1的DNA序列的5’端引入限制性酶切位点XhoⅠ的酶切位点，3’端引入Kex2酶切位点后，在3’端依次连接鸡源抗菌肽、来源于扣囊复膜孢酵母的信号肽2、Kex2酶切位点、鸡源抗菌肽和XbaⅠ酶切位点；

所述鸡源抗菌肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，所述来源于扣囊复膜孢酵母的信号肽1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，所述来源于扣囊复膜孢酵母的信号肽2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.一种抗菌肽表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述串联基因和表达载体分别用XbaⅠ和XhoⅠ双酶切后，酶切产物连接，得重组载体。

6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，所述表达载体包括pPICZαB。

7.一种利用权利要求5或6所述构建方法构建得到的抗菌肽表达载体pPICZαB-抗菌肽串联基因。

8.一种抗菌重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求7所述抗菌肽表达载体的质粒用SacⅠ单酶切线性化后，转化毕赤酵母(Pichia)感受态细胞。

9.利用权利要求8所述构建方法构建得到的抗菌重组毕赤酵母。

10.权利要求9所述抗菌重组毕赤酵母在抗菌肽发酵中的应用。