CN111548403B - 改良鸡源抗菌肽及其编码基因、重组质粒、重组菌和应用 - Google Patents

改良鸡源抗菌肽及其编码基因、重组质粒、重组菌和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了改良鸡源抗菌肽及其编码基因、重组质粒、重组菌和应用，属于基因工程技术领域，所述改良鸡源抗菌肽包括第一抗菌肽和/或第二抗菌肽；所述第一抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述第二抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明的改良鸡源抗菌肽是以原始鸡源抗菌肽(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)为基础，设计得到的改良鸡源抗菌肽。本发明的改良鸡源抗菌肽与原始鸡源抗菌肽相比，抗菌能力显著增强。

Description

改良鸡源抗菌肽及其编码基因、重组质粒、重组菌和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及改良鸡源抗菌肽及其编码基因、重组质粒、重组菌和应用。
背景技术
抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，通常由12～45个氨基酸组成，分子量约为40kD，不易使细菌产生耐药性；此外，还具有广谱抗菌性、热稳定性、高水溶性以及无残留等特点。因此，研究和应用抗菌肽作为无毒、无公害、无耐药的新型抗菌制剂替代抗生素对于保障人类健康来说具有重要意义。然而，天然抗菌肽并不是完美无缺，大部分天然抗菌肽的抗菌能力不高，这极大地限制了抗菌肽的广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供改良鸡源抗菌肽及其编码基因、重组质粒、重组菌和应用，改良鸡源抗菌肽与原始鸡源抗菌肽相比，抗菌能力显著增强。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了改良鸡源抗菌肽，包括第一抗菌肽和/或第二抗菌肽；所述第一抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述第二抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了上述方案所述改良鸡源抗菌肽的编码基因，包括第一基因和/或第二基因；所述第一基因用于编码所述第一抗菌肽，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述第二基因用于编码所述第二抗菌肽，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明提供了一种包括上述方案所述编码基因的重组质粒，包括第一重组质粒和/或第二重组质粒；所述第一重组质粒包括所述第一基因；所述第二重组质粒包括所述第二基因；所述第一重组质粒和第二重组质粒的表达质粒分别包括pPICZαB。
优选的，所述第一基因或第二基因插入在pPICZαB上的XbaⅠ和XhoⅠ位点之间。
本发明提供了一种包括上述方案所述重组质粒的重组菌，包括第一重组菌和/或第二重组菌；所述第一重组菌包括第一重组质粒；所述第二重组菌包括第二重组质粒。
优选的，所述重组菌的原始菌包括毕赤酵母。
优选的，所述毕赤酵母包括毕赤酵母X33。
本发明提供了上述方案所述改良鸡源抗菌肽或者所述编码基因或者所述重组质粒或者所述重组菌在抑制细菌中的应用。
优选的，所述细菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌和鼠伤寒沙门氏菌。
本发明的有益效果：本发明提供了改良鸡源抗菌肽，包括第一抗菌肽和/或第二抗菌肽；所述第一抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示；所述第二抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明的改良鸡源抗菌肽是以原始鸡源抗菌肽(氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)为基础，设计得到的改良鸡源抗菌肽。本发明的改良鸡源抗菌肽与原始鸡源抗菌肽相比，抗菌能力显著增强。经过抑菌效果测定，改良鸡源抗菌肽(SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3)重组菌发酵液抑菌能力比原始鸡源抗菌肽重组菌发酵液强2.15倍和1.95倍；并且原始鸡源抗菌肽重组菌发酵液抑菌能力没有100mg/mL氨苄青霉素强，但是经过改良鸡源抗菌肽重组菌发酵液抑菌能力比100mg/mL氨苄青霉素强，由此可见，改良鸡源抗菌肽比原始鸡源抗菌肽的抗菌能力强。
附图说明
图1为质粒pUC57-Simple图谱；
图2为表达载体pPICZαB图谱；
图3为PCR测序鉴定阳性转化子的电泳图谱；其中M为DL2000 DNA Marker(从上到下2000、1000、750、500、250和100bp)；a为SEQ ID NO.6序列的酵母阳性转化子基因组DNA的PCR结果，片段大小为408bp；b为SEQ ID NO.7序列的酵母阳性转化子基因组DNA 的PCR结果，片段大小为399bp；
图4为以金黄色葡萄球菌作为指示菌发酵液牛津杯抑菌实验图； A抑菌圈是加入原始鸡源抗菌肽重组菌发酵液；B抑菌圈是加入浓度为100mg/mL氨苄青霉素；C抑菌圈是加入改良鸡源抗菌肽重组菌 (SEQ ID NO.2)发酵液；D抑菌圈是加入改良鸡源抗菌肽重组菌(SEQ ID NO.3)发酵液；
图5为以大肠杆菌作为指示菌发酵液牛津杯抑菌实验图；A抑菌圈是加入原始鸡源抗菌肽重组菌发酵液；B抑菌圈是加入浓度为100 mg/mL氨苄青霉素；C抑菌圈是加入改良鸡源抗菌肽重组菌(SEQ ID NO.2)发酵液；D抑菌圈是加入改良鸡源抗菌肽重组菌(SEQ IDNO.3) 发酵液；
图6为以粪肠球菌作为指示菌发酵液牛津杯抑菌实验图；A抑菌圈是加入原始鸡源抗菌肽重组菌发酵液；B抑菌圈是加入浓度为100 mg/mL氨苄青霉素；C抑菌圈是加入改良鸡源抗菌肽重组菌(SEQ ID NO.2)发酵液；D抑菌圈是加入改良鸡源抗菌肽重组菌(SEQ IDNO.3) 发酵液；
图7为以鼠伤寒沙门氏菌作为指示菌发酵液牛津杯抑菌实验图； A抑菌圈是加入原始鸡源抗菌肽重组菌发酵液；B抑菌圈是加入浓度为100mg/mL氨苄青霉素；C抑菌圈是加入改良鸡源抗菌肽重组菌 (SEQ ID NO.2)发酵液；D抑菌圈是加入改良鸡源抗菌肽重组菌(SEQ ID NO.3)发酵液。
具体实施方式
本发明提供了改良鸡源抗菌肽，包括第一抗菌肽和/或第二抗菌肽；所述第一抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为： RKIRFVPLYVQRGTITVKIQGSARRK；所述第二抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：RKIRFLVYVRTITIQGPASRARK。本发明的改良鸡源抗菌肽是以原始鸡源抗菌肽(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：LVQRGRFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARF，参见【Xiao Y,Herrera A,I,Bommineni Y,R,Soulages J,L,Prakash O, Zhang G:The Central Kink Region of Fowlicidin-2,anα-Helical Host Defense Peptide,Is Critically Involved in Bacterial Killing andEndotoxin Neutralization.J Innate Immun 2009；1:268-280.】)为基础，得到的改良鸡源抗菌肽。
本发明提供了上述方案所述改良鸡源抗菌肽的编码基因，包括第一基因和/或第二基因；所述第一基因用于编码所述第一抗菌肽，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：AGAAAGATCAGATTCGTTCCATTGTACGTTCAAAGAGGTACTAT CACTGTTAAGATCCAAGGTTCTGCTAGAAGAAAG；所述第二基因用于编码所述第二抗菌肽，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为： AGAAAGATCAGATTCTTGGTTTACGTTAGAACTATCACTATCCA AGGTCCAGCTTCTAGAGCTAGAAAG。
本发明提供了一种包括上述方案所述编码基因的重组质粒，包括第一重组质粒和/或第二重组质粒；所述第一重组质粒包括所述第一基因；所述第二重组质粒包括所述第二基因；所述第一重组质粒和第二重组质粒的构建用骨架质粒为pUC57-Simple；所述第一重组质粒和第二重组质粒的表达质粒是pPICZαB；所述第一基因或第二基因优选的插入在pPICZαB上的XbaⅠ和XhoⅠ位点之间，所述第一基因或第二基因的3′端靠近XbaⅠ，5′端靠近XhoⅠ。本发明对所述重组质粒的构建方法没有特殊限制，采用本领域常见的重组质粒构建方法即可。
本发明提供了一种包括上述方案所述重组质粒的重组菌；所述重组菌包括第一重组菌和/或第二重组菌；所述第一重组菌包括所述第一重组质粒；所述第二重组菌包括所述第二重组质粒；所述第一重组菌和第二重组菌的原始菌优选的分别包括毕赤酵母；所述毕赤酵母优选的包括毕赤酵母X33。本发明对所述重组菌的构建方法没有特殊限制，采用本领域常见的重组菌的构建方法即可。
本发明提供了上述方案所述改良鸡源抗菌肽或者所述编码基因或者所述重组质粒或者所述重组菌在抑制细菌中的应用；所述细菌优选的包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌和鼠伤寒沙门氏菌。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、改造的改良鸡源抗菌肽DNA序列引入酶切位点
改良抗菌肽的编码基因(第一基因SEQ ID NO.4和第二基因SEQ ID NO.5)，5′端分别引入限制性酶切位点XhoⅠ
Figure GDA0003273840780000051
再引入Kex2酶切位点(氨基酸酶切位点EKR)的DNA序列
Figure GDA0003273840780000052
3′引入终止密码子TGA，再加上XbaⅠ
Figure GDA0003273840780000053
酶切位点。设计好的序列提交DNA合成公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)进行合成，合成好的DNA序列连接在质粒pUC57-Simple (质谱图如图1所示)上。
第一基因引入酶切位点后的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：
Figure GDA0003273840780000054
第二基因引入酶切位点后的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：
Figure GDA0003273840780000061
2、抗菌肽表达载体的构建
将连接有合成好改良鸡源抗菌肽基因序列的质粒pUC57-Simple 和表达载体pPICZαB(质谱图如图2所示)均用XbaⅠ和XhoⅠ双酶切。酶切条件：在37℃下保温10min。酶切体系(50μL)：
Figure GDA0003273840780000062
XbaⅠ和XhoⅠ双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收相应的 DNA片段，用T4DNA连接酶连接，然后转化大肠杆菌DH5α，送测序公司测序，判断序列是否确。连接条件：在16℃下过夜连接。连接体系(10μL)：
Figure GDA0003273840780000063
3、重组阳性质粒转化毕赤酵母菌株和阳性转化子筛选
大肠杆菌中提取质粒pPICZαB-抗菌肽基因，用限制性内切酶Sac I酶切，使质粒pPICZαB-抗菌肽基因线性化，片段回收试剂盒回收线性化片段。酶切条件：在37℃下保温10min。酶切体系(50μL)：
Figure GDA0003273840780000064
Figure GDA0003273840780000071
以毕赤酵母X33为表达宿主菌，线性化pPICZαB-抗菌肽基因电转化进入毕赤酵母。酵母电转化过程如下：
①取80μL上述毕赤酵母感受态细胞至一新的灭菌Eppendorf管中，加入8μL上面酶切回收的线性质粒pPICZαB-抗菌肽基因的片段，混匀，转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中。
②电转杯放在冰上8min。
③电转化条件：电阻400Ω，电压1500V，电容25μF，脉冲时间 13mS左右，电击1次。
④电击后，立即往电击转化杯中加入1mL 0℃预冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液器轻轻吹打均匀，置于冰浴中。
⑤电转杯中的混合液转移到新的无菌Eppendorf管中，在30℃下放置1～2h。
⑥分别取10、25、50、100和200μL混合液均匀涂布在含有100 μg/m Zeocin抗生素的YPD平板上，筛选阳性克隆子。
⑦平板置于30℃培养箱中培养3～4d。
⑧挑取长出的菌落接到新的YPD(含有100μg/mL Zeocin)平板上进行纯化。
含有100μg/m Zeocin抗生素的YPD平板长出的阳性克隆，用酵母基因组提取试剂盒提取基因组DNA，用引物P1 (5′-GCTGAAGCTCTCATCGGTTAC-3′，如SEQ ID NO.8所示)和P2(5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′，如SEQ ID NO.9所示)进行 PCR，PCR反应体系(50μL)：
Figure GDA0003273840780000072
PCR扩增的反应条件：起始94℃变性5min，94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸50sec，30个循环，最后72℃延伸6min。
PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，产物经测序来鉴定阳性转化子。鉴定结果参见图3；其中M为DL2000 DNA Marker(从上到下2000、1000、750、500、250和100bp)；a为SEQID NO.6序列的酵母阳性转化子基因组DNA的PCR结果，片段大小为408bp；b为 SEQ ID NO.7序列的酵母阳性转化子基因组DNA的PCR结果，片段大小为399bp。
4、阳性酵母转化子的发酵诱导表达
将筛选到的阳性毕赤酵母转化子单菌落接种于含100μg/mL博莱霉素的5mL YPD液体培养的管中，在30℃180r/min的条件下培养至OD600值为2时，取1mL菌液接种于含有150mLYPD培养液的500mL的三角瓶中在180r/min的条件下过夜培养，最后以8％的接种量接入发含BMGY培养基的发酵罐，在30℃、200r/min、pH值 5.0、溶氧25％的条件下进行发酵，当溶氧突然升高2h后，流加甲醇，控制甲醇含量在0.3％～0.5％范围内，持续发酵15h。发酵液6000r/min 离心10min，收集上清即为供试抗菌肽，于4℃存放。
BMGY培养基的配制(1000mL)：20g蛋白胨，10g酵母提取物，加水至700mL；115℃高温灭菌30min。然后分别在无菌条件下加入10×YNB 100l，10×磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mL，10×甘油100 mL。
5、牛津杯抑菌实验
实验分别以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌和鼠伤寒沙门氏菌作为指示菌，在液体LB培养基中培养至浓度106CFU/mL，取 80μL菌悬液于LB固体培养基中涂布均匀，放上灭菌牛津杯并轻轻按一下，牛津杯中加入200μL发酵液，过夜培养，观察并测量并记录抑菌圈大小，如图4～图7所示：改良的鸡源抗菌肽(SEQ ID NO.2 和SEQ ID NO.3)重组菌发酵液抑菌能力比原始鸡源抗菌肽重组菌发酵液强2.15倍和1.95倍(通过发酵液稀释倍数和抑菌圈的大小来确定)。原始鸡源抗菌肽重组菌发酵液抑菌能力没有100mg/mL氨苄青霉素强，但是经过改造的改良鸡源抗菌肽重组菌发酵液抑菌能力比 100mg/mL氨苄青霉素要强很多(如图4所示)，可以判定经过改造的改良鸡源抗菌肽抑菌能力比原始鸡源抗菌肽强。图4中A抑菌圈是加入原始鸡源抗菌肽重组菌发酵液；B抑菌圈是加入浓度为100 mg/mL氨苄青霉素；C抑菌圈是加入改良鸡源抗菌肽重组菌(SEQ ID NO.2)发酵液；D抑菌圈是加入改良鸡源抗菌肽重组菌(SEQ ID NO.3) 发酵液。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江西省科学院生物资源研究所
<120> 改良鸡源抗菌肽及其编码基因、重组质粒、重组菌和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Val Gln Arg Gly Arg Phe Gly Arg Phe Leu Arg Lys Ile Arg Arg
1 5 10 15
Phe Arg Pro Lys Val Thr Ile Thr Ile Gln Gly Ser Ala Arg Phe
20 25 30
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Lys Ile Arg Phe Val Pro Leu Tyr Val Gln Arg Gly Thr Ile Thr
1 5 10 15
Val Lys Ile Gln Gly Ser Ala Arg Arg Lys
20 25
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Lys Ile Arg Phe Leu Val Tyr Val Arg Thr Ile Thr Ile Gln Gly
1 5 10 15
Pro Ala Ser Arg Ala Arg Lys
20
<210> 4
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agaaagatca gattcgttcc attgtacgtt caaagaggta ctatcactgt taagatccaa 60
ggttctgcta gaagaaag 78
<210> 5
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agaaagatca gattcttggt ttacgttaga actatcacta tccaaggtcc agcttctaga 60
gctagaaag 69
<210> 6
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcgagaaaa gaagaaagat cagattcgtt ccattgtacg ttcaaagagg tactatcact 60
gttaagatcc aaggttctgc tagaagaaag tgatctaga 99
<210> 7
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcgagaaaa gaagaaagat cagattcttg gtttacgtta gaactatcac tatccaaggt 60
ccagcttcta gagctagaaa gtgatctaga 90
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctgaagctc tcatcggtta c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims (7)

1.改良鸡源抗菌肽，为第一抗菌肽或第二抗菌肽；所述第一抗菌肽的氨基酸序列如SEQID NO.2所示；所述第二抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述改良鸡源抗菌肽的编码基因，为第一基因或第二基因；所述第一基因用于编码所述第一抗菌肽，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述第二基因用于编码所述第二抗菌肽，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.一种包括权利要求2所述编码基因的重组质粒，为第一重组质粒或第二重组质粒；所述第一重组质粒包括所述第一基因；所述第二重组质粒包括所述第二基因；所述第一重组质粒或第二重组质粒的表达质粒分别为pPICZα B。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述第一基因或第二基因插入在pPICZα B上的XbaⅠ和XhoⅠ位点之间。
5.一种包括权利要求3或4所述重组质粒的重组菌，为第一重组菌或第二重组菌；所述第一重组菌包含第一重组质粒；所述第二重组菌包含第二重组质粒；
所述重组菌的原始菌为毕赤酵母。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母X33。
7.权利要求1所述改良鸡源抗菌肽或者权利要求2所述编码基因或者权利要求3或4所述重组质粒或者权利要求5或6所述重组菌在制备抑制细菌的制剂中的应用；
所述细菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌和鼠伤寒沙门氏菌。
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