CN102167734A - 一种重组突变的黄粉虫抗菌肽的高效表达及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种突变的黄粉虫抗菌肽及其制备获得方法及其应用。所述的突变的黄粉虫抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，全长为195bp，其编码由序列表中序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中65个氨基酸组成的蛋白质，获得的重组突变黄粉虫抗菌肽属于富含半胱氨酸类抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。本发明获得重组突变的黄粉虫抗菌肽具有很强的热稳定性，在沸水中煮沸8h，抑菌活性不变，耐酸、碱特性，pH在2-12的范围内，抗菌活力保持不变，广谱抗菌的功能突出，对微生物具有显著的抑制作用，尤其是对耐药菌具有显著的抑制作用，具有广泛的应用领域。

Description

一种重组突变的黄粉虫抗菌肽的高效表达及其应用

发明领域

本发明涉及微生物次生物质代谢技术领域。具体的说，本发明涉及一种高效表达重组突变的黄粉虫抗菌肽及其高效表达的应用。

背景技术

抗菌肽广泛存在于各种有机体内，包括细菌、昆虫、植物和脊椎动物，已经从多种生物体内分离得到抗菌肽，它们具有广谱抗菌活性，可以保护机体抵御细菌、病毒、真菌和一些寄生物的侵染，是生物体内先天性防御系统的重要组成成分。目前越来越多的细菌对传统抗生素产生了耐药性，尤其是超级细菌的出现，新型抗生素的研发速度相对较慢，对付超级细菌已经成为现代医学面临的一个难题。与传统抗生素作用机理不同，抗菌肽通过破坏质膜结构达到抑杀细菌的作用，是目前抗病原微生物药物开发研究中的热点，有望成为新一代的抗菌制剂。

近年来，对昆虫抗菌肽的研究已成为一个迅速发展的新领域，越来越引起人们的关注和重视。黄粉虫(Tenebrio molitor)其幼虫别名面包虫，既是一种生理、遗传学实验材料，又为极具开发潜力的重要资源昆虫。虽然黄粉虫在我国分布广，资源丰富，但是，由于天然抗菌肽含量少，提取得率低(0.005％)，成本高未能实现工业化生产。随着现代生物技术的发展，获得黄粉虫抗菌肽基因的高效表达，为黄粉虫抗菌肽的研究和开发具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术天然抗菌肽含量少，提取得率低，重组抗菌肽的表达量不高的现状，本发明旨在提供一种高表达的突变黄粉虫抗菌肽的基因序列和编码多肽序列，以应用于黄粉虫抗菌肽的大量制备中。

本发明的技术方案：根据GenBank中的黄粉虫抗菌肽基因tenecin 1设计特异性引物，从黄粉虫的3龄幼虫中克隆到黄粉虫抗菌肽的tenecin 1 cDNA分子，所编码的蛋白质富含半胱氨酸；扩增获得tenecin 1 cDNA分子的开放阅读框是255bp，为了获得黄粉虫抗菌肽的原核高效表达，本发明设计了特异性突变引物用于扩增其成熟肽部分核酸序列，同时获得带有更多正电荷的抗菌肽，以利其高抗菌活性的发挥，将成熟肽部分N端的两个谷氨酸突变成两个精氨酸；从而获得本发明用于原核细胞高效表达并具有高活性的抗菌肽基因195bp，命名为TmAMP1m。将突变的黄粉虫抗菌肽基因TmAMP1m 195bp亚克隆至原核表达载体，转化大肠杆菌，获得了突变的黄粉虫抗菌肽基因的高效表达，抑菌实验证明所表达的黄粉虫抗菌肽具有明显的抑菌活性，为黄粉虫抗菌肽的大量制备奠定了基础。

具体的，本发明提供了一种突变的黄粉虫抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，全长为195bp，其编码由序列表中序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中65个氨基酸组成的蛋白质，获得的重组黄粉虫抗菌肽属于富含半胱氨酸类抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。

同时，本发明提供了一种重组突变的黄粉虫抗菌肽的获得方法，具体包括如下步骤：

1.黄粉虫总RNA的提取和反转录合成cDNA。

取大约3龄的黄粉虫幼虫，放入无RNA酶的研钵中液氮研磨，使用Trizol试剂提取总RNA；A260/A280鉴定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳检测；以总RNA为模板，Oligo dT为引物，使用反转录酶M-MLV(RNase H-)，反转录合成eDNA。

2.PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因(tenecin 1)。

以上述合成的cDNA为模板，设计上、下游引物，引入限制性内切酶BamHI和XhoI位点，PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因tenecin 1；在1％琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR结果，回收PCR产物，连接T载体；进行测序分析，鉴定获得了正确的tenecin 1。

3.突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因的PCR扩增。

设计了特异性突变引物用于扩增其成熟肽部分基因，将成熟肽部分N端的两个谷氨酸突变成两个精氨酸；从而获得本发明用于原核细胞高效表达并具有高活性的抗菌肽基因195bp，命名为TmAMP1m。获得突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因的流程图见图1。

4.原核表达载体的构建及表达。

将回收的PCR产物TmAMP1m基因与表达载体pET30a分别进行双酶切，对双酶切的TmAMP1m，pET30a进行过夜连接，获得pET30a-TmAMP1m重组质粒。pET30a-TmAMP1m转化感受态细胞E.coli DH5α，筛选阳性克隆，阳性克隆大量培养并提取质粒。将提取的质粒pET30a-TmAMP1m转化感受态细胞E.coli BL21，卡那霉素筛选获得阳性克隆。将含重组质粒的阳性克隆在37℃培养，加入IPTG诱导获得可溶性、突变的黄粉虫抗菌肽。

进一步，本发明提供了一种突变的黄粉虫抗菌肽详细的获得方法，具体包括如下步骤：

1.黄粉虫总RNA的提取

操作前实验台用紫外灯照射30min后，取一条大约3龄的黄粉虫幼虫，放入无RNA酶的研钵中液氮研磨，粉末移入装有1mLTrizol试剂的Eppendorf管中，盖紧盖激烈震荡15s，15～30℃室温放置3～5min，4℃、12000r/min离心15min，小心的将上清移入干净Eppendorf管中，加入氯仿0.22mL抽提蛋白质，震荡15s，15～30℃室温放置3～5min，4℃、12000rpm离心10min，溶液分成上、中、下三层，其中无色上层即为含RNA层。将此层移入洁净的1.5mL的Eppendorf管中，加入异丙醇0.5mL，15～30℃室温放置10min，4℃、12000rpm离心10min。弃上清，沉淀部分加入75％乙醇溶液(无RNA酶水配置)1mL，洗涤，4℃、7500r/min离心5min。弃上清，待沉淀干燥后，加入无RNA酶水，轻轻混匀，使其充分溶解，A260/A280鉴定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳检测，其余-70℃保存。

2.反转录合成cDNA

EP管中配制下列模板RNA/引物混合液：10μL总RNA，10μL OligodT-Adaptor引物，31.5μL无RNase的水，70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上。离心数秒使模板RNA/引物的变性液聚集于管底。再加入51.5μL上述RNA/引物变性溶液，20μL5×M-MLV缓冲液，20μL dNTP，2.5μL RNase抑制剂，6μL RNase M-MLV(RNase H-)。42℃保温1h，70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上。

3.PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因(tenecin 1)

以上述合成的cDNA为模板，设计上、下游引物，引入限制性内切酶BamHI和XhoI位点，PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因tenecin 1。

上游引物F1：CGCGGATCCATGAAGCTTACAATCTTCGC

下游引物R1：CCGCTCGAGTTATCTGCAAACGCAGACCCTC

PCR反应体系：13.9μL dd H₂O，2μL 10×Taq缓冲液，1.6μL dNTPs，0.6μLMg²⁺，0.4μL Primer(F1)，0.4μL Primer(F2)，1μL cDNA。PCR反应条件：95℃预变性1min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环。最后72℃温育10min。

4.PCR产物的电泳检测及序列分析

取5μLPCR扩增产物加6×Loading Buffer，在1％琼脂糖凝胶进行电泳，结果见图2，M是标准核酸分子量Marker D2000；泳道1，2是阴性对照；泳道3，4是大约255bp大小的黄粉虫抗菌肽基因。采用TIANGEN生物公司的回收试剂盒，回收PCR产物，连接T载体，进行测序分析。

5.突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因的PCR扩增

克隆突变的成熟肽基因序列引物：

上游引物MF1：CGCGGATCCTTCCCTCTTAGGAGAGCGGCAACAGCTG

下游引物MR1：CCGCTCGAGTTATCTGCAAACGCAGACCCTC

PCR反应体系：13.9μL dd H₂O，2μL 10×Taq缓冲液，1.6μL dNTPs，0.6μLMg²⁺，0.4μL Primer(M F1)，0.4μL Primer(MF2)，1μL cDNA

PCR反应条件：95℃预变性1min，95℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环。最后72℃温育10min。电泳检测结果见图3，M是标准核酸分子量Marker D2000；泳道1是大约195bp大小的突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因TmAMP1m。

6.原核表达载体的构建

将回收的PCR产物TmAMP1m基因与表达载体pET30a分别进行双酶切。

在一微量离心管中分别依次加入下列试剂：

10×K Buffer            15μL

TmAMP1m                 55μL

BamHI                   6μL

Xho I                   6μL

双蒸水                  70μL

总体系                150μL

轻弹管壁，混匀并离心，37℃酶切6小时。

采用TIANGEN生物公司的PCR产物回收试剂盒，对双酶切的TmAMP1m，pET30a进行回收，然后进行连接反应；在一个微量离心管中依次加入下列试剂：

10×连接缓冲液        1μL

TmAMP1m               7μL

pET30a                0.7μL

T4DNA连接酶           1μL

双蒸水                0.3μL

总体积                10μL

16℃，过夜连接。

7.重组质粒pET30a-TmAMP1m的转化与鉴定

将连接产物与35μL感受态细胞E.coliDH5α混匀，冰浴30min，然后42℃水浴热休克45s，迅速取出冰浴3min(不要摇动EP管)。在每管中加入800μL LB培养液，混匀，37℃温和振荡培养1h。4℃，3000rpm，离心1min，吸弃600μL上清，轻轻吹打混匀剩余菌液，在准备好的固体LB培养基(含卡那霉素)上均匀的涂布，37℃过夜培养。

将过夜长出的阳性克隆挑取到6mLLB培养基(含卡那霉素)中培养12-16h。菌液PCR方法鉴定重组质粒正确。按照碱裂解法提取质粒DNA。

8.重组质粒pET30a-TmAMP1m的原核表达

将提取的质粒pET30a-TmAMP1m 5μL转化感受态细胞E.coli BL21，卡那霉素筛选获得阳性克隆。将含重组质粒的阳性克隆在37℃培养过夜，再以1％比例接种，37℃培养2～3h，当菌液的吸光度(A₆₀₀)值达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.5M，于37℃诱导5h。取培养液1.5mL，12000rpm离心3min，收集菌体，沉淀用40μL PBS(pH7.4)重悬，然后加入等体积的SDS缓冲液振荡后，置沸水浴中5min，12000rpm离心10min，SDS-PAGE电泳检测结果见图4。M是标准蛋白质分子量marker；泳道1是没有诱导的大肠杆菌(含有质粒pET30a-TmAMP1m)；泳道2是0.5mM IPTG诱导的大肠杆菌(含有质粒pET30a-TmAMP1m)表达产物；泳道3是诱导后的上清；泳道4是诱导后的沉淀，表明黄粉虫抗菌肽已高效表达，且大部分是可溶的。

通过上述工艺制备获得的重组突变黄粉虫抗菌肽属于富含半胱氨酸类抗菌肽，其所编码的抗菌肽成熟肽为65个氨基酸，富含半胱氨酸和精氨酸。

其DNA碱基序列：

TTC CCT CTT AGG AGA GCG GCA ACA GCT GAA GAA ATC GAA CAA

GGC GAA CAC ATT CGA GTA AAG AGA GTG ACA TGC GAC ATT CTT

AGT GTG GAA GCT AAA GGT GTT AAA CTC AAC GAC GCA GCC TGT GCT

GCA CAT TGT CTC TTC AGG GGC AGA AGT GGA GGT TAC TGT AAC GGA

AAG AGG GTC TGC GTT TGC AGA

其氨基酸序列：

FPLRRAATAE EIEQGEHIRV KRVTCDILSV EAKGVKLNDA

ACAAHCLFRG RSGGYCNGKR VCVCR

9.重组突变的黄粉虫抗菌肽的高效表达及纯化

将含重组突变的黄粉虫抗菌肽基因载体的阳性克隆在37℃培养过夜，再以1％比例接种，37℃培养3～4h，当菌液的吸光度(A₆₀₀)值达到0.5-0.7时，加入IPTG至终浓度0.5～1M，于37℃诱导5h。12000rpm离心3min，收集沉淀。

将所收集的沉淀溶于50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM imidazole，pH 8.0缓冲液后，4℃下进行超声破菌，超声波超声破菌条件：400W，每5sec间隔5sec共50次。4℃，12000rpm，20min，离心后收集上清，0.45μm滤膜过滤备用。

亲和层析：将超声破菌后获得的上清，在4℃下通过装有预处理的Ni-NTA琼脂糖介质柱中，使其自然通过层析柱。用洗杂液洗涤杂蛋白，洗杂液成分：50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0。使用含有300mM的咪唑缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，300mM imidazole，pH 8.0)洗脱抗菌肽。

凝胶过滤层析：将亲和层析所获得的抗菌肽上样于Superdex 75凝胶过滤柱，凝胶过滤柱长300mm，直径10mm，用10-100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0-9.0缓冲液进行洗脱，收集活性峰。将凝胶过滤层析所获得的样品上样于10kD浓缩超滤管中，4℃，3300rpm离心30min，获得重组突变的黄粉虫抗菌肽。

本发明也提供了上述纯化工艺所获得的重组突变黄粉虫抗菌肽相关的生物学特性。具体为，抗菌肽是一小分子肽，具有热稳定性，耐酸、碱特性，耐高盐特性、能杀耐药菌、抗菌肽广。

同时，本发明提供了一种突变的黄粉虫抗菌肽在杀灭氨苄青霉素和卡那霉素抗性的大肠杆菌中的应用，其最小抑菌浓度(MIC)为0.020-0.011μg/ml和0.022-0.013μg/ml。

本发明提供的重组突变的黄粉虫抗菌肽在制备治疗病原微生物感染(耐药菌)的抗菌药物、饲料添加剂、保鲜剂中的应用，都具有良好的效果。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：

1.本发明提供了一种重组突变的黄粉虫抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，全长为195bp，其编码由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中65个氨基酸组成的蛋白质，获得的重组黄粉虫抗菌肽属于富含半胱氨酸类抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。

2.本发明提供的一种重组突变的黄粉虫抗菌肽具有很强的热稳定性，在沸水中煮沸8h，抑菌活性不变。

3.本发明提供的一种重组突变的黄粉虫抗菌肽具耐酸、碱特性：pH在2-12的范围内，重组黄粉虫抗菌肽的抗菌活力保持不变。

4.本发明提供的一种重组突变的黄粉虫抗菌肽能杀灭氨苄青霉素和卡那霉素抗性的大肠杆菌，其最小抑菌浓度(MIC)为0.020-0.011μg/ml和0.022-0.013μg/ml。

5.本发明提供的一种重组突变的黄粉虫抗菌肽具有广谱抗菌的功能，对微生物具有显著的抑制作用，所有微生物包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、苏云金杆菌、普通变形杆菌、化脓放线菌、链球菌、布氏杆菌、粪肠球菌、葡萄球菌、杆状菌、棒状杆菌等。重组突变的黄粉虫抗菌肽在制备治疗病原微生物感染(包括耐药菌)的抗菌药物、饲料添加剂、保鲜剂等方面中具有广泛的应用前景。

6.重组突变的黄粉虫抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)：重组黄粉虫抗菌肽对微生物的最小抑菌浓度明显低于氨苄青霉素，显示较强的抗菌能力。重组黄粉虫抗菌肽对微生物的最小抑菌浓度包括大肠杆菌0.030-0.056μg/ml、金黄色葡萄球菌0.007-0.011μg/ml、巨大芽孢杆菌0.010-0.014μg/ml、谷氨酸棒杆菌0.018-0.021μg/ml、苏云金杆菌0.012-0.016μg/ml、普通变形杆菌0.013-0.017μg/ml、化脓放线菌0.028-0.033μg/ml、链球菌0.009-0.011μg/ml、布氏杆菌0.005-0.006μg/ml、粪肠球菌0.020-0.025μg/ml、葡萄球菌0.013-0.015μg/ml、杆状菌0.005-0.010μg/ml、棒状杆菌0.028-0.032μg/ml等。

附图说明

图1所示为突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因克隆流程图。

图2所示为黄粉虫抗菌肽基因(tenecin 1)的PCR扩增图，图中，M为DNA分子量标准DL2000；1，2为阴性对照；3，4是黄粉虫抗菌肽tenecin 1基因片段。

图3所示为突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因TmAMP1m的PCR扩增图，图中，M为DNA分子量标准DL2000；1为突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因TmAMP1m。

图4所示为TmAMP1m表达产物的SDS-PAGE分析图，图中，M是标准蛋白质分子量marker；1为没有诱导大肠杆菌含有质粒pET30a-TmAMP1m；2为0.5mM IPTG诱导大肠杆菌含有质粒pET30a-TmAMP1m的表达产物；3为诱导后的上清；4为诱导后的沉淀。

图5所示为TmAMP1m的抑菌实验图，图中，1，6为对照PBS缓冲液；2为阳性对照氨苄青霉素；3-5是重组突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP1m的抑菌结果。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有：

主要试剂：Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNA Marker、蛋白质Marker、蛋白胨、酵母浸出粉、丙烯酰胺、甲叉双丙稀酰胺、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等。

主要仪器：PCR仪、高压灭菌锅、气浴恒温振荡器、电子天平、微波炉、超纯水仪、超净工作台、恒温培养箱、热空气消毒柜、台式冷冻离心机、电泳仪、凝胶成像仪等。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：重组突变的黄粉虫抗菌肽的制备

1.黄粉虫总RNA的提取

操作前实验台用紫外灯照射30min后，取一条大约5龄的黄粉虫幼虫，放入无RNA酶的研钵中液氮研磨，粉末移入装有1mLTrizol试剂的Eppendorf管中，盖紧盖激烈震荡15s，15～30℃室温放置3～5min，4℃、12000r/min离心15min，小心的将上清移入干净Eppendorf管中，加入氯仿0.22mL抽提蛋白质，震荡15s，15～30℃室温放置3～5min，4℃、12000rpm离心10min，溶液分成上、中、下三层，其中无色上层即为含RNA层。将此层移入洁净的1.5mL的Eppendorf管中，加入异丙醇0.5mL，15～30℃室温放置10min，4℃、12000rpm离心10min。弃上清，沉淀部分加入75％乙醇溶液(无RNA酶水配置)1mL，洗涤，4℃、7500r/min离心5min。弃上清，待沉淀干燥后，加入无RNA酶水，轻轻混匀，使其充分溶解，A260/A280鉴定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳检测，其余-70℃保存。

2.反转录合成cDNA

EP管中配制下列模板RNA/引物混合液：10μL总RNA，10μL OligodT-Adaptor引物，31.5μL无RNase的水，70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上。离心数秒使模板RNA/引物的变性液聚集于管底。再加入51.5μL上述RNA/引物变性溶液，20μL5×M-MLV缓冲液，20μL dNTP，2.5μL RNase抑制剂，6μL RNase M-MLV(RNase H-)。42℃保温1h，70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上。

3.PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因(tenecin1)

以上述合成的cDNA为模板，设计上、下游引物，引入限制性内切酶BamHI和XhoI位点，PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因(tenecin 1)。

上游引物F 1：CGCGGATCCATGAAGCTTACAATCTTCGC

下游引物R1：CCGCTCGAGTTATCTGCAAACGCAGACCCTC

PCR反应体系：13.9μL dd H₂O，2μL 10×Taq缓冲液，1.6μL dNTPs，0.6μLMg²⁺，0.4μL Primer(F1)，0.4μL Primer(F2)，1μL cDNA。PCR反应条件：95℃预变性1min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环。最后72℃温育10min。

4.PCR产物的电泳检测及序列分析

取5μLPCR扩增产物加6×Loading Buffer，在1％琼脂糖凝胶进行电泳，结果见图2，M是标准核酸分子量Marker D2000；泳道1，2是阴性对照；泳道3，4是大约255bp大小的基因片段。采用TIANGEN生物公司的回收试剂盒，回收PCR产物，连接T载体，进行测序分析结果证明约255bp大小的基因片段是黄粉虫抗菌肽基因tenecin 1的开放阅读框序列。

5.突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因的PCR扩增

克隆突变的成熟肽基因序列引物：

上游引物MF1：CGCGGATCCTTCCCTCTTAGGAGAGCGGCAACAGCTG

下游引物MR1：CCGCTCGAGTTATCTGCAAACGCAGACCCTC

PCR反应体系：13.9μL dd H₂O，2μL 10×Taq缓冲液，1.6μL dNTPs，0.6μLMg²⁺，0.4μL Primer(M F1)，0.4μL Primer(MF2)，1μL cDNA

PCR反应条件：95℃预变性1min，95℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环。最后72℃温育10min。电泳检测结果见图3，M是标准核酸分子量Marker D2000；泳道1是大约195bp大小的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因TmAMP1m。测序分析结果证明约195bp大小的基因片段是突变的黄粉虫抗菌肽基因TmAMP1m序列。

6.原核表达载体的构建

将回收的PCR产物TmAMP1m基因与表达载体pET30a分别进行双酶切，轻弹管壁，混匀并离心，37℃酶切6小时。

在一微量离心管中分别依次加入下列试剂：

10×K Buffer      15μL

TmAMP1m           55μL

BamHI             6μL

Xho I             6μL

双蒸水            70μL

总体系            150μL

采用TIANGEN生物公司的PCR产物回收试剂盒，对双酶切的TmAMP1m，pET30a进行回收，然后进行连接反应；在一个微量离心管中依次加入下列试剂：

10×连接缓冲液    1μL

TmAMP1m           7μL

pET30a            0.7μL

T4DNA连接酶       1μL

双蒸水            0.3μL

总体积            10μL

16℃，过夜连接。

7.重组质粒pET30a-TmAMP1m的转化与鉴定

将连接产物与35μL感受态细胞E.coli DH5α混匀，冰浴30min，然后42℃水浴热休克45s，迅速取出冰浴3min(不要摇动EP管)。在每管中加入800μL LB培养液，混匀，37℃温和振荡培养1h。4℃，3000rpm，离心1min，吸弃600μL上清，轻轻吹打混匀剩余菌液，在准备好的固体LB培养基(含卡那霉素)上均匀的涂布，37℃过夜培养。

将过夜长出的阳性克隆挑取到6mLLB培养基(含卡那霉素)中培养12-16h。菌液PCR方法鉴定重组质粒正确。按照碱裂解法提取质粒DNA。

获得的重组突变黄粉虫抗菌肽属于富含半胱氨酸类抗菌肽，其所编码的抗菌肽成熟肽为65个氨基酸，富含半胱氨酸和精氨酸。

其DNA碱基序列：

TTC CCT CTT AGG AGA GCG GCA ACA GCT GAA GAA ATC GAA CAA

GGC GAA CAC ATT CGA GTA AAG AGA GTG ACA TGC GAC ATT CTT

AGT GTG GAA GCT AAA GGT GTT AAA CTC AAC GAC GCA GCC TGT GCT

GCA CAT TGT CTC TTC AGG GGC AGA AGT GGA GGT TAC TGT AAC GGA

AAG AGG GTC TGC GTT TGC AGA

其氨基酸序列：

FPLRRAATAE EIEQGEHIRV KRVTCDILSV EAKGVKLNDA

ACAAHCLFRG RSGGYCNGKR VCVCR

实施例二：重组质粒pET30a-TmAMP1m的原核表达

将提取的质粒pET30a-TmAMP1m5μL转化感受态细胞E.coli BL21，卡那霉素筛选获得阳性克隆。将含重组质粒的阳性克隆在37℃培养过夜，再以1％比例接种，37℃培养2～3h，当菌液的吸光度(A₆₀₀)值达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.5M，于37℃诱导5h。取培养液1.5mL，12000rpm离心3min，收集沉淀，沉淀用40μL PBS(pH7.4)重悬，然后加入等体积的SDS缓冲液振荡后，置沸水浴中5min，12000rpm离心10min，SDS-PAGE电泳检测结果见图4。M是标准蛋白质分子量marker；泳道1是没有诱导的大肠杆菌(含有质粒pET30a-TmAMP1m)；泳道2是0.5mM IPTG诱导的大肠杆菌(含有质粒pET30a-TmAMP1m)表达产物；泳道3是诱导后的上清；泳道4是诱导后的沉淀，表明突变的黄粉虫抗菌肽已高效表达，且大部分是可溶的。

实施例三：重组突变的黄粉虫抗菌肽的抑菌活性检测方法

首先取出通过表达获得的抗菌肽2μl。以金黄色葡萄球菌为实验菌种，在LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.5，参照琼脂孔穴扩散法，取10μl菌悬液与3ml固体培养基(含0.8％琼脂)在45℃混匀，并铺在直径6cm无菌培养皿中，待凝固后于4℃保存备用；使用时，在平皿中打直径为2mm的若干小孔，并在孔中分别滴入2μl待测产物，37℃条件下培养16-24h。测量抑菌圈大小。根据抑菌圈的大小判定抗菌肽的活性。图5所示为表达产物的抑菌圈：1，6为对照PBS缓冲液；2为阳性对照氨苄青霉素；3-5是重组突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP1m的抑菌结果。结果表明重组突变黄粉虫抗菌肽TmAMP1m具有明显的抑制金黄色葡萄球菌生长的作用。

实施例四：重组突变的黄粉虫抗菌肽的高效表达及纯化

将含重组突变的黄粉虫抗菌肽基因载体的阳性克隆在37℃培养过夜，再以1％比例接种，37℃培养3～4h，当菌液的吸光度(A₆₀₀)值达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.5～1M，于37℃诱导5h。12000rpm离心3min，收集沉淀。

将所收集沉淀溶于50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM imidazole，pH 8.0缓冲液后，4℃下进行超声破菌，超声波超声破菌条件：400W，每5sec间隔5sec共50次。4℃，12000rpm，20min，离心后收集上清，0.45μm滤膜过滤备用。

亲和层析：将超声破菌后获得的上清，在4℃下通过装有预处理的Ni-NTA琼脂糖介质柱中，使其自然通过层析柱。用洗杂液洗涤杂蛋白，洗杂液成分：50mMNaH₂PO4，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0。使用含有300mM的咪唑缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，300mM imidazole，pH 8.0)洗脱抗菌肽。

凝胶过滤层析：将亲和层析所获得的抗菌肽上样于Superdex 75凝胶过滤柱，凝胶过滤柱长300mm，直径10mm，用10-100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0-9.0缓冲液进行洗脱，收集活性峰。将凝胶过滤层析所获得的样品上样于10kD浓缩超滤管中，4℃，3300rpm离心30min，获得重组突变的黄粉虫抗菌肽。

实施例五：重组突变的黄粉虫抗菌肽抗菌谱和最小抑菌浓度(MIC)：

按照实施例三提供的方法，检测重组突变的黄粉虫抗菌肽抗菌谱和最小抑菌浓度。重组突变的黄粉虫抗菌肽能杀灭氨苄青霉素和卡那霉素抗性的大肠杆菌。其最小抑菌浓度(MIC)为0.020-0.011μg/ml和0.022-0.013μg/ml。

其它细菌包括大肠杆菌DH5α0.050-0.065μg/ml、大肠杆菌BL210.053-0.068μg/ml、金黄色葡萄球菌0.004-0.021μg/ml、表皮葡萄球菌0.005-0.023μg/ml、葡萄球菌0.013-0.015μg/ml、谷氨酸棒杆菌0.028-0.031μg/ml、巨大芽孢杆菌0.020-0.034μg/ml、蜡样芽孢杆菌0.022-0.035μg/ml、普通变形杆菌0.023-0.027μg/ml、链球菌0.01-0.021μg/ml、变形链球菌0.02-0.028μg/ml、苏云金杆菌0.02-0.036μg/ml、化脓放线菌0.038-0.043μg/ml、布氏杆菌0.008-0.01μg/ml、鸡沙门氏菌0.009-0.012μg/ml、粘性放线菌0.020-0.031μg/ml、内氏放线菌0.022-0.032μg/ml、粪肠球菌0.022-0.035μg/ml、杆状菌0.007-0.011μg/ml、棒状杆菌0.029-0.036μg/ml、嗜酸乳杆菌0.025-0.030μg/ml等。

本发明提供的重组突变的黄粉虫抗菌肽具有广谱抗菌的功能。重组突变黄粉虫抗菌肽在制备治疗病原微生物感染(包括耐药菌)的抗菌药物、饲料添加剂、保鲜剂等方面中具有广泛的应用前景。

Claims (8)

1.一种突变的黄粉虫抗菌肽，其特征在于，所述的一种突变的黄粉虫抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，全长为195bp，其编码由序列表中序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中65个氨基酸组成的蛋白质，获得的重组黄粉虫抗菌肽属于富含半胱氨酸类抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。

2.一种如权利要求1所述的突变的黄粉虫抗菌肽的获得方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)黄粉虫总RNA的提取和反转录合成cDNA：取大约3龄的黄粉虫幼虫，放入无RNA酶的研钵中液氮研磨，使用Trizol试剂提取总RNA；A260/A280鉴定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳检测；以总RNA为模板，Oligo dT为引物，使用反转录酶M-MLV(RNase H-)，反转录合成eDNA；

(2)PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因(tenecin 1)：以步骤1合成的cDNA为模板，设计上、下游引物，引入限制性内切酶BamHI和XhoI位点，PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因tenecin 1；在1％琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR结果，回收PCR产物，连接T载体；进行测序分析，鉴定获得了正确的tenecin 1；

(3)突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因的PCR扩增：设计了特异性突变引物用于扩增其成熟肽部分基因，将成熟肽部分N端的两个谷氨酸突变成两个精氨酸；从而获得用于原核细胞高效表达并具有高活性的抗菌肽基因195bp，命名为TmAMP1m；

(4)原核表达载体的构建及表达：将回收的PCR产物TmAMP1m基因与表达载体pET30a分别进行双酶切，对双酶切的TmAMP1m，pET30a进行过夜连接，获得pET30a-TmAMP1m重组质粒；pET30a-TmAMP1m转化感受态细胞E.coli DH5α，筛选阳性克隆，阳性克隆大量培养并提取质粒；将提取的质粒pET30a-TmAMP1m转化感受态细胞E.coli BL21，卡那霉素筛选获得阳性克隆；将含重组质粒的阳性克隆在37℃培养，加入IPTG诱导获得可溶性、突变的黄粉虫抗菌肽。

3.如权利要求1所述的重组突变的黄粉虫抗菌肽在杀灭氨苄青霉素的大肠杆菌中的应用，其特征在于，所述的其杀灭氨苄青霉素的大肠杆菌的抑菌浓度(MIC)为0.020-0.011μg/ml。

4.如权利要求1所述的重组突变的黄粉虫抗菌肽在杀灭卡那霉素抗性的大肠杆菌中的应用，其特征在于，所述的其杀灭卡那霉素抗性的大肠杆菌的抑菌浓度(MIC)为0.022-0.013μg/ml。

5.如权利要求1所述的重组突变的黄粉虫抗菌肽在制备治疗病原微生物感染的抗菌药物中的应用。

6.如权利要求1所述的重组突变的黄粉虫抗菌肽在制备耐药菌的抗菌药物中的应用。

7.如权利要求1所述的重组突变的黄粉虫抗菌肽在制备饲料添加剂中的应用。

8.如权利要求1所述的重组突变的黄粉虫抗菌肽在制备保鲜剂中的应用。

Images