CN116262781A - 抗菌肽defensin衍生物及其原核表达方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗菌肽defensin衍生物及其原核表达方法与应用。本发明通过RACE PCR的方法从大麦虫扩增出抗菌肽defensin基因编码区，通过原核表达获得了具有良好抗菌活性的重组大麦虫defensin，实现了抗菌肽defensin体外表达。然后利用生物合成技术制备了大麦虫defensin衍生物，序列如SEQ ID NO:3～8所示。试验证实重组defensin及其衍生物ZM‑d14CFR对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有良好的抗菌活性，且无细胞毒性和溶血性，是理想的抗菌物质，应用前景广阔。

Description

抗菌肽defensin衍生物及其原核表达方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及抗菌肽defensin衍生物及其原核表达方法与应用。
背景技术
“超级细菌”的出现已成为目前全球公共卫生面临的巨大挑战。近年来，随着细菌耐药性问题日益严重，人们逐渐意识到“超级细菌”的感染可能会使人类面临无药可医的窘境。为维护公共卫生安全，自2001年以来，欧盟委员会针对其构成的相关威胁制定了“同一健康”方针。2006年，欧洲开始全面禁止在饲料中添加抗生素。我国自2020年起开的全面禁止在饲料中添加抗生素，以减少抗生素滥用造成的危害，维护动物源性食品安全和公共卫生安全，为此合理使用抗生素，研发新型抗生素替代药物势在必行。
抗菌肽是一类具有跟抗生素相同作用的多肽，具有相对分子质量低，抗菌高效和广谱，毒副作用小，免疫原性低，热稳定和水溶性良好，抗菌机理独特和不易产生耐药株等优点，在新型抗菌药物开发领域展现出巨大的潜力。
防御素是一类富含二硫键的阳离子型多肽，分布广泛，是生物免疫系统中的重要调节分子，也是生物自身防御体系的重要组成部分。研究表明防御素具有较强的抗菌、抗病毒功能，是一类重要的抗菌肽。目前，以防御素为主要来源的抗菌肽的开发与利用已成为药理学、昆虫学、微生物学等多个领域的研究热点。
由于天然防御素来源广泛，提取工艺复杂，产量低，大大限制了其作为抗生素替代物的发展。而防御素和其他蛋白质类物质一样，可由基因直接编码，因此采用基因工程技术开发和生产防御素类抗菌肽具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供抗菌肽defensin衍生物及其原核表达方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种来自大麦虫的重组抗菌肽defensin(rZM-defensin)，所述抗菌肽包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或
ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供抗菌肽defensin衍生物，其为ZM-d13、ZM-d14C、ZM-d14CF、ZM-d14CR或ZM-d14CFR：
ZM-d13：GGYCNSKSVCVCR-NH2；
ZM-d14C：RGCYCNSKSVCVCR-NH2；
ZM-d14CF：RGCYCNSKSFCVCR-NH2；
ZM-d14CR：RGCRCNSKSVCVCR-NH2；
ZM-d14CFR：RGCRCNSKSFCVCR-NH2。
第三方面，本发明提供编码抗菌肽defensin或其衍生物的核酸分子。
第四方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
第五方面，本发明提供抗菌肽defensin或其衍生物的原核表达的方法，包括以下步骤：
(1)通过RACE PCR方法从大麦虫中扩增得到抗菌肽defensin的编码基因，或者人工合成所述抗菌肽defensin衍生物的编码基因；
(2)构建重组载体：将所述编码基因插入到原核表达载体中，构建得到包含所述编码基因的重组载体；
(3)表达抗菌肽defensin或其衍生物：用重组载体转化大肠杆菌，利用IPTG诱导后收集包含抗菌肽defensin或其衍生物的细菌。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤(2)和(3)分别为：
(2)构建重组载体：将抗菌肽defensin或其衍生物的编码基因连接到pMD19-T克隆载体中，构建得到重组质粒pMD19-defensin；分别酶切重组质粒pMD19-defensin和原核表达载体pGEX 6p-1，构建得到包含defensin编码基因的重组载体pGEX6p-defensin。
(3)表达抗菌肽defensin或其衍生物：将重组载体pGEX 6p-defensin转化至E.coli Rosetta(DE3)菌株中，利用IPTG诱导后收集包含抗菌肽defensin或其衍生物的细菌。
进一步地，所述方法还包括采用PBS处理诱导后细菌，超声破碎后离心并收上清液；依次采用GST柱亲和层析和Superdex30凝胶过滤层析纯化所述上清液，获得纯化的抗菌肽defensin或其衍生物。
第六方面，本发明提供抗菌肽defensin的以下任一应用：
1)用于抑制细菌(包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)；
2)用于制备抑菌剂；
3)用于制备防腐剂；
4)用于制备抗菌药物；
5)预防或治疗细菌性感染。
6)用于治疗由细菌感染所致疾病。
所述细菌包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、沙门氏菌(Salmonella)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)。
第七方面，本发明提供一种抗菌药物或组合物，有效成分为抗菌肽defensin和/或其衍生物。
第八方面，本发明提供一种抑菌剂或防腐剂，有效成分为抗菌肽defensin和/或其衍生物。
第九方面，本发明提供抗菌肽defensin和/或其衍生物在制备用于治疗或减轻由大肠杆菌导致的乳腺炎的药物中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明通过RACE PCR的方法扩增出大麦虫defensin完整的CDs序列，并采用原核表达载体构建包含抗菌肽defensin的编码基因的重组载体，实现了抗菌肽defensin的体外表达，获得的重组抗菌肽在纯化后具有明显的体外抑菌效果。在上述研究基础上合成defensin衍生物，其中衍生物ZM-d14CFR具有良好的抗菌活性，且在高浓度下(0.5mg/mL)无溶血性和细胞毒性。此外，抗菌肽ZM-d14CFR还具有分子量小，氨基酸组成简单，便于大规模合成等优点。抗菌肽ZM-d14CFR还可以有效抑制大肠杆菌在小鼠乳腺中的粘附和增殖，对小鼠大肠杆菌性乳腺炎具有良好的治疗作用，应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中defensin基因扩增；其中，(a)简并引物保守基因序列扩增；(b)defensin 5’RACE扩增；(c)defensin 3’RACE扩增；(d)defensin完整CDs区扩增。
图2为本发明较佳实施例中重组质粒pGEX 6p-defensin菌液PCR鉴定结果。
图3为本发明较佳实施例中重组抗菌肽defensin SDS-PAGE凝胶电泳(a-b)与Western blot验证(c)：(a)M:Marker 180KD-10KD；1：Rosetta全菌；2：pGEX 6p-1空载；3：pGEX 6p-defensin上清；4：pGEX 6p-defensin沉淀；(b)M:Marker 180KD-10KD；1：pGEX 6p-defensin上清；2：纯化后重组defensin蛋白；3：重组defensin蛋白经PrescissionProtease柱上切割后洗脱的GST标签；(c)M:Marker 180KD-10KD；1：纯化后重组defensin蛋白；2：重组defensin蛋白经Prescission Protease柱上切割后洗脱的GST标签。
图4为本发明较佳实施例中抗菌肽defensin纯化(a)与质谱鉴定(b)结果。
图5为本发明较佳实施例中重组defensin抗菌活性检测结果。
图6为本发明较佳实施例中抗菌肽defensin及其衍生物ZM-d14CFR细胞毒性(a-c)和溶血性(d)检测结果。
图7为本发明较佳实施例中抗菌肽ZM-d14CFR在小鼠细菌性感染模型中的应用：(a)小鼠乳腺炎模型中，给予defensin衍生物ZM-d14CFR治疗后乳腺组织载菌量的变化；(b)小鼠乳腺炎模型中，给予defensin衍生物ZM-d14CFR治疗后乳腺组织病理学变化。
具体实施方式
本发明提供一种抗菌肽defensin的原核表达及其衍生物的制备与应用。本发明制备的抗菌肽defensin衍生物ZM-14CFR是一种新型抗菌肽，具有明显的体外抑菌效果，且安全性良好。抗菌肽ZM-14CFR可有效抑制小鼠大肠杆菌性乳腺炎模型中细菌的粘附，对大肠杆菌性乳腺炎具有良好的治疗作用。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种抗菌肽defensin的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，对所述表达载体进行PCR扩增的引物序列为8条(5′-3′)：
P1:AAACGCTTYACWTGTGACGTWCT
P2:TCATTAKCGRCAAACGCARAC
P3:TGGTTTCGAAATTGCAGGAACAAAACTGAATAGCG
P4:AGATTTAGAGTTACAATAACCCCCTCTCCTCCCT
P5:TGCTTGTGGTGCTCATTGTCTAG
P6:ACAATAACCCCCTCTCCTCCCTA
P7:CGGGATCCTTCACCTGCGACGTTCTTG
P8:TAAAGCGGCCGCTTAACGACATACACAAACAGATTTAGAGT
本发明还提供一种抗菌肽defensin的重组载体，该重组载体包含如SEQ ID NO:2所示的defensin的编码基因。
本发明还提供一种抗菌肽defensin，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供一种抗菌肽defensin原核表达的方法，该方法包括以下步骤：
(1)获取抗菌肽defensin的编码基因：提取大麦虫RNA，通过RACE PCR方法扩增defensin基因的3’端和5’端，拼接后获得defensin CDs全长序列。
(2)构建重组载体：将抗菌肽defensin编码基因的PCR扩增产物纯化后连接到pMD19-T克隆载体中，构建得到重组质粒pMD19-defensin；分别酶切重组质粒pMD19-defensin和原核表达载体pGEX 6p-1，构建得到包含defensin编码基因的重组载体pGEX6p-defensin；
(3)表达抗菌肽defensin：将重组载体pGEX 6p-defensin转化至E.coli Rosetta(DE3)菌株中，利用IPTG诱导后收集包含抗菌肽defensin的细菌。采用PBS重悬细菌，超声破碎后离心并收集沉淀，获得上清液；采用GST柱亲和层析法纯化所述上清液，获得纯化后的重组抗菌肽defensin。重组抗菌肽defensin经Prescission Protease酶切，Superdex 30分离纯化后获得抗菌肽defensin；
(4)提供抗菌肽defensin衍生物的制备，所述衍生物为ZM-d13、ZM-d14C、ZM-d14CF、ZM-d14CR、ZM-d14CFR；
(5)所述ZM-d13为(a1)或(a2)；
(a1)氨基酸序列是SEQ ID NO:4的多肽；
(a2)将SEQ ID NO:4的氨基酸序列经过部分氨基酸残基缺失得到的多肽；
(6)所述ZM-d14C为(b1)或(b2)；
(b1)氨基酸序列是SEQ ID NO:5的多肽；
(b2)将SEQ ID NO:5的氨基酸序列经过部分氨基酸残基缺失和一个氨基酸残基的取代到的多肽；
(7)所述ZM-d14CF为(c1)或(c2)；
(c1)氨基酸序列是SEQ ID NO:6的多肽；
(c2)将SEQ ID NO:6的氨基酸序列经过一个氨基酸残基的取代到的多肽；
(8)所述ZM-d14CR为(d1)或(d2)；
(d1)氨基酸序列是SEQ ID NO:7的多肽；
(d2)将SEQ ID NO:7的氨基酸序列经过一个氨基酸残基的取代到的多肽；
(9)所述ZM-d14CFR为(e1)或(e2)；
(e1)氨基酸序列是SEQ ID NO:8的多肽；
(e2)将SEQ ID NO:8的氨基酸序列经过一个氨基酸残基的取代到的多肽；
上述衍生物均可人工合成，本领域技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如点突变对本发明所述的defensin衍生物的氨基酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明所述defensin衍生物的氨基酸序列具有75％或者更高同源性的氨基酸，只要具有所述defensin衍生物的功能，均是衍生于本发明的氨基酸序列，等同于本发明的序列。
本发明提供defensin及其衍生物在抑制细菌生长中的应用。
本发明还提供defensin衍生物ZM-d14CFR的安全性评价，包括细胞毒性和溶血性。
本发明提供defensin衍生物ZM-d14CFR在抑制细菌生长中的应用。
本发明还提供defensin衍生物ZM-d14CFR在治疗或预防细菌感染疾病的应用。
本发明还提供含有所述defensin衍生物的产品，所述产品为以下所述任一产品：
1)抑制细菌生长产品；
2)治疗和/或预防细菌所致疾病产品；
3)防止细菌引起腐败的产品。
上述产品可将defensin及其衍生物作为活性成分，还可以将defensin及其衍生物与其他物质组合在一起作为活性成分。
本发明中，所述细菌可以为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
本发明中，所述预防和/或治疗细菌引起的疾病的产品均可为药物或疫苗。所述防止细菌引起腐败的产品均可为防腐剂。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中涉及的菌种、质粒及主要试剂：
E.coli DH5αChemically Competent Cell(北京全式金生物技术有限公司)、E.coli Rosetta(DE3)Chemically Competent Cell(北京索莱宝科技有限公司)；pMD19-TVector(TaKaRa公司)；pGEX 6p-1载体、E.coli、S.aureus均来自中国农业大学动物医学院。
SMARTer RACE 5’/3’Kit、Taq酶、琼脂糖凝胶电泳10×Loading Buffer、DL2000DNA Marker、限制性核酸内切酶NotⅠ和BamHⅠ、质粒连接DNA Ligation Kit均为TaKaRa公司产品；DNA质粒小量提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒为Omega公司产品，BCA蛋白定量试剂盒为Thermo公司产品；纯化蛋白所用GSTrap FF以及Superdex 30为GEHealthcare公司产品。
实施例1重组抗菌肽defensin原核表达与纯化
1、defensin基因扩增
提取大麦虫总RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit(with gDNA Eraser)说明书反转录成cDNA，根据大麦虫defensin保守氨基酸序列设计简并引物，扩增保守区，PCR反应体系如下：2×Tap PCR Master Mix 25μL；10μmol/L上、下游引物各2μL；ddH2O 19μL；cDNA 2μL。PCR反应条件如下：95℃10min；94℃30s，60℃-50℃30s(每个循环降2℃，每个温度2个循环)，72℃30s；95℃10min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，25个循环；72℃10min；将PCR扩增产物通过胶回收进行纯化，纯化的目的基因克隆到pMD19-T载体中送往生工生物工程(上海)有限公司进行测序。根据测序结果获得大麦虫defensin基因保守序列，设计特异性引物，并根据SMARTer RACE5’/3’Kit说明书扩增defensin基因的3’端和5’端，随后将PCR扩增产物纯化后克隆到pMD19-T载体，并进行测序；将测序结果进行拼接获得defensin完整的序列(图1)。
PCR扩增引物序列如下(5′-3′)：
P1:AAACGCTTYACWTGTGACGTWCT
P2:TCATTAKCGRCAAACGCARAC
P3:TGGTTTCGAAATTGCAGGAACAAAACTGAATAGCG
P4:AGATTTAGAGTTACAATAACCCCCTCTCCTCCCT
P5:TGCTTGTGGTGCTCATTGTCTAG
P6:ACAATAACCCCCTCTCCTCCCTA
2、重组质粒的构建
以大麦虫cDNA为模板，PCR扩增defensin蛋白的基因序列；其中，PCR反应体系如下：2×Tap PCR Master Mix 25μL；10μmol/L上、下游引物各2μL；ddH2O 19μL；cDNA 2μL。PCR反应条件如下：95℃10min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，32个循环；72℃10min；采用Cycle-Pure Kit试剂盒纯化PCR产物，用BamHⅠ、NotⅠ双酶切defensin基因与原核表达载体pGEX 6p-1，将双酶切产物胶回收后，经T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物用转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在100μg/mL氨苄抗性的LB平板上培养16h，挑取大小均一合适的单菌落，提取质粒，PCR扩增defensin基因验证质粒，将阳性质粒送往生工生物工程(上海)有限公司进行测序，鉴定正确的重组质粒命名为pGEX 6p-defensin(图2)。
PCR扩增引物序列如下(5′-3′)：
P7:CGGGATCCTTCACCTGCGACGTTCTTG
P8:TAAAGCGGCCGCTTAACGACATACACAAACAGATTTAGAGT
3、重组defensin蛋白的表达
将pGEX 6p-defensin质粒加入Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰浴静置30min后，置于42℃水浴锅中热激90s，并立即插入冰浴中静置2min。加入400μL不含抗生素的无菌LB培养基，37℃、150rpm振摇培养40min。吸取100μL菌液均匀涂布到含氨苄西林的固体LB培养基表面，置37℃培养箱中培养14-16h。挑取阳性转化子接种于LB培养基，37℃、200rpm振摇培养过夜，取50μL菌液接种于500mL液体LB培养基中，37℃、230rpm振摇培养至OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度为0.8mM，16℃诱导表达20h。将转化有pGEX 6p-1空载体质粒的Rosetta(DE3)为对照。诱导表达结束后，4℃、8000g离心10min离心收集菌体，用预冷的0.01M PBS液重悬菌体后超声破碎(4℃，功率200W，超声开4s、停4s，共30min)，4℃、8000g离心15min，收集上清(图3)。
4、重组defensin蛋白的纯化与鉴定
取上述上清液，采用GST亲和层析柱纯化目的蛋白，具体步骤如下：(1)使用10mL结合缓冲液润洗纯化柱(流速1mL/min)；(2)加入30mL重组蛋白上清液，设置流速1mL/min，使得蛋白与GST柱充分结合，同时收集过柱后的液体；(3)加入20mL结合缓冲液洗去未结合的杂蛋白；(4)加入1mL Prescission Protease工作液，4℃孵育16h去掉GST标签；(5)加入0.01M PBS缓冲液，设置流速0.8mL/min，充分收集切下来的目的蛋白。(6)加入10mL洗脱液，设置流速0.8mL/min，洗脱亲和层析柱残留的蛋白。纯化的目的defensin蛋白经Superdex30进一步纯化后，通过质谱进行鉴定，蛋白表达正确(图4)。
实施例2抗菌肽defensin抗菌活性测定
使用琼脂糖平板扩散法进行抗菌活性鉴定。试验菌株为大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC29213。具体步骤如下：(1)将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别在液体LB培养基中培养至对数生长期(OD600＝0.6)；(2)将菌液分别稀释至0.5麦氏标准单位(1.5×108CFU/mL)，取20μL菌液分别均匀涂布在LB平板上；(3)使用无菌打孔器在上述平皿上打孔，每孔分别加入50μL(约200μg)纯化的defensin蛋白。同时设置阳性对照血淋巴粗提物(1000μg/孔)和庆大霉素(40μg/孔)以及、阴性对照(生理盐水)，37℃培养14-16h后观察抑菌效果。试验结果表明抗菌肽defensin对大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213具有良好的抑菌效果(图5)。
实施例3抗菌肽defensin衍生物的制备与抗菌活性检测
1、defensin衍生物的制备
对实施例2的重组抗菌肽defensin进行优化，缺失部分氨基酸序或进行个别氨基酸残基的取代到defensin衍生物ZM-d13、ZM-d14C、ZM-d14CF、ZM-d14CR、ZM-d14CFR。衍生物由生工生物工程(上海)有限公司合成后，利用高效液相色谱法(HPLC)和高效液相--串联质谱对上述衍生物纯度和分子量进行测定，结果表明defensin衍生物的纯度均大于95％，具体信息如表1所示。
表1抗菌肽defensin衍生物结构信息
Figure BDA0003407723070000081
2、defensin衍生物抗菌谱及最小抑菌浓度测定
采取肉汤稀释法(CLSI)对defensin衍生物抗菌谱及最小抑菌浓度进行测定，测定菌株为大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌临床分离株19、大肠杆菌临床分离株20、大肠杆菌CVCC1450、金黄色葡萄球菌ATCC29213、肺炎克雷伯菌临床分离株、溶血葡萄球菌、沙门氏菌ATCC14028、蜡样芽胞杆菌临床分离株、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC33591、变形杆菌CVCC1971、链球菌CVCC3307，测定温度为37℃，pH为7.0。将实施例1的重组抗菌肽defensin作为对照。结果表明，defensin衍生物ZM-d14CFR的抑菌活性最好，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、蜡样芽胞杆菌以及溶血葡萄球菌均有良好的抑制作用。其中最小抑菌浓度可达到为0.1mg/mL，其他defensin衍生物的抑菌作用能力均小于ZM-d14CFR，结果如表2所示。
表2重组抗菌肽defensin及其衍生物抗菌谱(MIC，mg/mL)
Figure BDA0003407723070000091
注：NA表示无抗菌活性。
实施例4 rZM-defensin及其衍生物安全性评价
1、细胞毒性
在96孔板中每孔加入104个MAC-T或Vero或Hela细胞，培养细胞长至70％左右，弃去培养基，0.01M PBS清洗3次后，加入含有1mg/mL、0.2mg/mL、0.02mg/mL、0.002mg/mLrZM-defensin或衍生物的无抗培养基，于37℃培养12h(每个浓度重复3个孔)；随后向各孔中加入10μL CCK8溶液，37℃培养继续培养2h，使用酶标仪测定450nm处的吸光度。
2、溶血性
5mL脱纤维羊血3000g离心10min后去除血清，0.01M PBS清洗两次后加入5mL PBS重悬制备成100％红细胞悬浮液，取8μL该悬浮液与9.2mL的PBS混合得到8％红细胞悬液，置于4℃备用。96孔板先加入100μL含有1mg/mL、0.2mg/mL、0.02mg/mL、0.002mg/mL rZM-defensin或衍生物的PBS，每种浓度重复3个孔；然后向每孔中加入100μL 8％红细胞悬浮液，37℃孵育1h后，离心，吸取上清液100μL，测定OD576nm。试验同时设置PBS阴性对照(N)和TritonX-100阳性对照(P)，最终溶血率＝(待测液体OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)×100％。
试验结果表明，抗菌肽rZM-defensin及其衍生物在最高浓度0.5mg/mL的条件下依然没有溶血性和细胞毒性，说明抗菌肽defensin及其衍生物安全性良好(图6)。
实施例5 defensin衍生物ZM-d14CFR稳定性检测
1、热稳定性：将rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR溶于生理盐水中，配制成浓度为1mg/mL的溶液。平均分成若干份后，分别置于室温、60℃、80℃、100℃的水浴中加热1h，及121℃高温灭菌处理15min后冷却至室温。以E.coli ATCC25922和S.aureus ATCC29213为指示菌，利用最小抑菌浓度法检测其抗菌活性。以室温下的样品作为对照，考察不同温度处理后rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR残余的抗菌活性。试验结果表明抗菌肽rZM-defensin及其衍生物ZM-d14CFR在37℃、60℃、80℃中保持良好的抗菌活性，而衍生物ZM-d14CFR在37℃、60℃、80℃、100℃中保持良好的抗菌活性，说明衍生物ZM-d14CFR具有良好的耐高温能力(表3)。
表3不同温度处理后对rZM-defensin和ZM-d14CFR抗菌活力的影响(MIC，mg/mL)
Figure BDA0003407723070000101
2、酸碱稳定性：将rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR溶于生理盐水中，配制成浓度为1mg/mL的溶液。平均分成若干份后，利用HCl和NaOH将其pH调至2-12，37℃孵育1h后将各管pH调回pH＝7并定容至相同的体积。以E.coli ATCC25922和S.aureus ATCC29213为指示菌，利用最小抑菌浓度法检测其抗菌活性。以未处理的样品作为对照，考察不同酸碱性处理后rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR残余的抗菌活性。试验结果表明抗菌肽rZM-defensin及其衍生物ZM-d14CFR在pH＝4-8中依然保持良好的抗菌活性(表4)。
表4不同酸碱度对rZM-defensin和ZM-d14CFR抗菌活力的影响(MIC，mg/mL)
Figure BDA0003407723070000111
3、蛋白酶稳定性：将rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR溶于生理盐水中，配制成浓度为1mg/mL的溶液。平均分成若干份后，分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶和蛋白酶K，使酶的终浓度为2mg/mL。将混合物至于37℃孵育1h，以MIC法测定其抗菌活性，考察不同蛋白酶对rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR活性的影响，同时设置蛋白酶单独作用组以及以未处理的样品组作为对照。指示菌分别为E.coli ATCC25922和S.aureusATCC29213。试验结果表明抗菌肽rZM-defensin及其衍生物ZM-d14CFR在用蛋白酶处理后完全丧失抗菌活性(表5)。
表5不同蛋白酶对rZM-defensin和ZM-d14CFR抗菌活力的影响(MIC，mg/mL)
Figure BDA0003407723070000121
4、金属离子稳定性：将rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR溶于生理盐水中，配制成浓度为1mg/mL的溶液，平均分成若干份。用蒸馏水配制硫酸亚铁(FeSO4)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸锌(Zn(NO3)2)和氯化钙(CaCl2)溶液，使金属离子的浓度为10mmo1/L。将defensin和衍生物ZM-d14CFR与上述金属离子溶液等体积混合，使金属离子的终浓度为5mmol/L。将混合物至于37℃孵育1h，以MIC法测定其抗菌活性，考察不同金属离子对rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR活性的影响，同时设置金属离子单独作用组以及以未处理的样品组作为对照。指示菌分别为E.coli ATCC25922和S.aureus ATCC29213。试验结果表明抗菌肽rZM-defensin及其衍生物ZM-d14CFR在Mg2+和Zn2+溶液中可以保持良好的抗菌活性，但是在Fe2+和Ca2+中抗菌活性显著降低(表6)。
表6不同金属离子对rZM-defensin和ZM-d14CFR抗菌活力的影响(MIC，mg/mL)
Figure BDA0003407723070000122
Figure BDA0003407723070000131
5、血清稳定性：将rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR溶于生理盐水中，配制成浓度为1mg/mL的溶液，加入胎牛血清使其终浓度为10％。将混合物至于37℃孵育1h，以MIC法测定其抗菌活性，考察血清对rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR活性的影响。以未经血清处理的rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR做对照，指示菌分别为E.coli ATCC25922和S.aureusATCC29213。结果表明抗菌肽rZM-defensin及其衍生物ZM-d14CFR在血清中抗菌活性降低(表7)。
表7血清对rZM-defensin和ZM-d14CFR抗菌活力的影响(MIC，mg/mL)
抗菌肽 E.coli ATCC25922 S.aureus ATCC29213
rZM-defensin 0.5 1.0
ZM-d14CFR 0.2 0.2
6、紫外照射稳定性：将rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR溶于生理盐水中，配制成浓度为1mg/mL的溶液，并置于30W紫外灯下25cm处照射1h，以MIC法测定其抗菌活性，考察紫外照射对rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR活性的影响。以未经过紫外照射处理的rZM-defensin和衍生物ZM-d14CFR做对照，指示菌分别为E.coli ATCC25922和S.aureusATCC29213。试验结果表明抗菌肽rZM-defensin及其衍生物ZM-d14CFR在紫外照射后依然保持良好抗菌活性(表8)。
表8紫外照射对rZM-defensin和ZM-d14CFR抗菌活力的影响(MIC，mg/mL)
抗菌肽 E.coli ATCC25922 S.aureus ATCC29213
rZM-defensin 0.25 0.5
ZM-d14CFR 0.1 0.1
实施例6defensin衍生物ZM-d14CFR在治疗大肠杆菌性乳腺炎中的应用
将32只哺乳3天的CD-1小鼠，平均分成4组，每组8只小鼠。各组分别为：生理盐水组、攻菌组、ZM-d14CFR治疗组、庆大霉素治疗组。小鼠麻醉后，仰卧位固定，第四对乳头消毒后，用眼科剪轻轻减去上面的角质，生理盐水组注射25μL生理盐水，剩余4组注射25μL浓度为4×106CFU/mL的大肠杆菌CVCC1450菌液。3h后，ZM-d14CFR治疗组注射25μL浓度为100μg/mL的ZM-d14CFR蛋白，庆大霉素治疗组注射25μL浓度为40μg/mL的庆大霉素，攻菌组和生理盐水注射25μL生理盐水。在首次治疗12h后，加强治疗一次。12h后，将所有小鼠安乐死，采取乳腺组织，一部分匀浆、混匀，通过平板计数法计算各组乳腺组织中细菌载量。一部分乳腺在4％甲醛溶液固定后制成组织切片，H.E.染色后观察乳腺组织病理学变化。结果表明，ZM-d14CFR可有效的降低小鼠乳腺组织中的细菌载量，缓解大肠杆菌造成的乳腺损伤(图7)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 抗菌肽defensin衍生物及其原核表达方法与应用
<130> KHP211124713.2
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 270
<212> DNA
<213> 大麦虫(Zophobas atratus)
<400> 1
atgaataagt taacactcgc cttcgttctc gcaatttttg cctttgcgtg caactctcaa 60
gttagttcac tgcctgttgg agaagaagag ttacacgtgg ttgagcccac tcaacaaggt 120
cacattcgtg tcagaaggtt cacctgcgac gttcttggtt tcgaaattgc aggaacaaaa 180
ctgaatagcg ctgcttgtgg tgctcattgt ctagctctag ggaggagagg gggttattgt 240
aactctaaat ctgtttgtgt atgtcgttaa 270
<210> 2
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcacctgcg acgttcttgg tttcgaaatt gcaggaacaa aactgaatag cgctgcttgt 60
ggtgctcatt gtctagctct agggaggaga gggggttatt gtaactctaa atctgtttgt 120
gtatgtcgtt aa 132
<210> 3
<211> 43
<212> PRT
<213> 大麦虫(Zophobas atratus)
<400> 3
Phe Thr Cys Asp Val Leu Gly Phe Glu Ile Ala Gly Thr Lys Leu Asn
1 5 10 15
Ser Ala Ala Cys Gly Ala His Cys Leu Ala Leu Gly Arg Arg Gly Gly
20 25 30
Tyr Cys Asn Ser Lys Ser Val Cys Val Cys Arg
35 40
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Gly Tyr Cys Asn Ser Lys Ser Val Cys Val Cys Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Arg Gly Cys Tyr Cys Asn Ser Lys Ser Val Cys Val Cys Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Gly Cys Tyr Cys Asn Ser Lys Ser Phe Cys Val Cys Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Gly Cys Arg Cys Asn Ser Lys Ser Val Cys Val Cys Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Arg Gly Cys Arg Cys Asn Ser Lys Ser Phe Cys Val Cys Arg
1 5 10

Claims (10)

1.抗菌肽defensin衍生物，其特征在于，其为ZM-d13、ZM-d14C、ZM-d14CF、ZM-d14CR或ZM-d14CFR：
ZM-d13：GGYCNSKSVCVCR-NH2；
ZM-d14C：RGCYCNSKSVCVCR-NH2；
ZM-d14CF：RGCYCNSKSFCVCR-NH2；
ZM-d14CR：RGCRCNSKSVCVCR-NH2；
ZM-d14CFR：RGCRCNSKSFCVCR-NH2。
2.编码权利要求1所述抗菌肽defensin衍生物的核酸分子。
3.含有权利要求2所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
4.抗菌肽defensin或权利要求1所述抗菌肽defensin衍生物的原核表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过RACE PCR方法从大麦虫中扩增得到抗菌肽defensin的编码基因，或者人工合成权利要求1所述抗菌肽defensin衍生物的编码基因；
(2)构建重组载体：将所述编码基因插入到原核表达载体中，构建得到包含所述编码基因的重组载体；
(3)表达抗菌肽defensin或其衍生物：用重组载体转化大肠杆菌，利用IPTG诱导后收集包含抗菌肽defensin或其衍生物的细菌；
其中，抗菌肽defensin在NCBI上的参考序列编号为P80033.1。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括采用PBS处理诱导后细菌，超声破碎后离心并收上清液；依次采用GST柱亲和层析和Superdex30凝胶过滤层析纯化所述上清液，获得纯化的抗菌肽defensin或其衍生物。
6.权利要求1所述抗菌肽的以下任一应用：
1)用于抑制细菌；
2)用于制备抑菌剂；
3)用于制备防腐剂；
4)用于制备抗菌药物；
所述细菌包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细菌包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)、沙门氏菌(Salmonella)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)。
8.抗菌药物，其特征在于，有效成分为抗菌肽defensin和/或权利要求1所述抗菌肽defensin衍生物；
其中，抗菌肽defensin在NCBI上的参考序列编号为P80033.1。
9.抑菌剂或防腐剂，其特征在于，有效成分为抗菌肽defensin和/或权利要求1所述抗菌肽defensin衍生物；
其中，抗菌肽defensin在NCBI上的参考序列编号为P80033.1。
10.抗菌肽defensin和/或权利要求1所述抗菌肽defensin衍生物在制备用于治疗或减轻由大肠杆菌导致的乳腺炎的药物中的应用。
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