CN102245630A - 具有抗微生物活性的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有抗微生物活性的分离的多肽。本发明还涉及编码所述多肽的多核苷酸；和包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。

Description

具有抗微生物活性的多肽

序列表

本发明包含序列表。

技术领域

本发明涉及具有抗微生物活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。

背景技术

本发明的目标是提供具有改善的抗微生物活性的多肽。所述多肽可呈现减少的溶血活性和/或减少的细胞毒性。所述多肽还可呈现对阳离子如Ca²⁺、Mg²⁺、Na⁺的减少的敏感性。所述多肽还可与其他抗微生物多肽相比呈现不同的和有利的抗微生物谱。

发明内容

本发明涉及具有抗微生物活性的分离的多肽，选自下组：

(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸1至40的多肽；

(b)(a)具有抗微生物活性的片段。

本发明还涉及编码本发明多肽的多核苷酸，并涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及产生此类具有抗微生物活性的多肽的方法，包括(a)在有助于产生所述多肽的条件下，培养包含核酸构建体的重组宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及使用本发明的多肽和多核苷酸的方法。

定义

抗微生物活性：术语“抗微生物活性”于本文定义为一种能够杀死微生物细胞或抑制微生物细胞生长的活性。在本发明的上下文中，术语“抗微生物的”系意欲意指有杀细菌的和/或抑制细菌的和/或杀真菌的和/或抑制真菌的效果和/或杀病毒的效果，其中术语“杀细菌的”应被理解为能够杀死细菌细胞。术语“抑制细菌的”应被理解为能够抑制细菌的生长，即抑制生长的细菌细胞。术语“杀真菌的”应被理解为能够杀死真菌细胞。术语“抑制真菌的”应被理解为能够抑制真菌生长，即抑制生长的真菌细胞。术语“杀病毒的”应被理解为能够使病毒失活。术语“微生物细胞”代表细菌或真菌细胞(包括酵母)。

在本发明的上下文中，术语“抑制微生物细胞的生长”意欲指细胞处于非生长状态，即它们不能繁殖。

在一个优选的实施方案中，术语“抗微生物活性”系定义为杀细菌的和/或抑制细菌的活性。更优选地，“抗微生物活性”定义为针对葡萄球菌属(Staphylococci)(优选金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))的杀细菌的和/或抑制细菌的活性。

就本发明而言，抗微生物活性可根据由Lehrer等，Journal ofImmunologicalmethods，Vol.137(2)pp.167-174(1991)所述的方法测定。或者，抗微生物活性可根据来自CLSI(临床和实验室标准学会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)；之前称为国家临床与实验室标准委员会(Naional Committee ofClinical and Laboratory Standards))的NCCL S指南测定。

具有抗微生物活性的多肽以浓度为500μg/ml；优选浓度为250μg/ml；更优选浓度为100μg/ml；甚至更优选浓度为50μg/ml；最优选浓度为25μg/ml；且特别是浓度为10μg/ml的具有抗微生物活性的多肽在相关微生物生长底物中于37℃温育16小时后(优选8小时后，更优选4小时后，最优选2小时后)可将金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)的活细胞数目减少至1/100。

具有抗微生物活性的多肽当以500μg/ml的浓度加入；优选当以250μg/ml的浓度加入；更优选当以100μg/ml的浓度加入；甚至更优选当以50μg/ml的浓度加入；最优选当以10μg/ml的浓度加入；以及特别是当以5μg/ml的浓度加入时，在相关微生物生长底物中于37℃也可将金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)的长出(outgrowth)抑制8小时。

本发明的多肽具有至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，且甚至最优选至少100％的由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸1至40所示的氨基酸序列组成的多肽的抗微生物活性。

分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文指至少20％纯的，优选至少40％纯的，更优选至少60％纯的，甚至更优选至少80％纯的，最优选至少90％纯的，且甚至最优选至少95％纯的多肽，如通过SDS-PAGE所测定的。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”于本文代表一种多肽制备物，其含有以重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，且甚至最优选至多0.5％的与其天然结合的其它多肽材料。因此，优选地，基本上纯的多肽按该制备物中存在的总多肽材料的重量计为至少92％纯的，优选至少94％纯的，更优选至少95％纯的，更优选至少96％纯的，更优选至少96％纯的，更优选至少97％纯的，更优选至少98％纯的，甚至更优选至少99％，最优选至少99.5％纯的，且甚至最优选100％纯的。

本发明的多肽优选为基本上纯的形式。具体而言，优选所述多肽是“基本上(essentially)纯的形式”，即所述多肽制备物基本上不含与其天然结合的其他多肽材料。这可以通过以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该多肽来完成。

本文中，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”同义。

同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“同一性”描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列的比对是通过使用来自EMBOSS包(http://emboss.org)的Needle程序(版本2.8.0)来确定的。所述Needle程序执行Needleman，S.B.和Wunsch，S.D.(1970)J.Mol.Biol.48：443-453中所述的全局比对算法。使用的取代矩阵为BLOSUM62，缺口开放罚分为10，而缺口延伸罚分为0.5。本发明氨基酸序列(如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸1至40)与不同氨基酸序列之间的同一性程度计算为两个序列的比对中精确匹配数除以本发明序列的长度(氨基酸残基数)；或者，使用Needle标记为“最长同一性”的输出作为百分比同一性并计算如下：(相同的残基×100)/(比对的长度-比对中的缺口数)。结果表示为同一性百分比。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文定义为从SEQ ID NO：1或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个氨基酸的多肽；其中所述片段具有抗微生物活性。在一个实施方案中，所述片段含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的至少34个，优选至少35个，更优选至少36个，甚至更优选至少37个，最优选至少38个并特别地至少39个连续氨基酸。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合于在遗传工程蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式。具体而言，优选本文中公开的多核苷酸为“基本上(essentially)纯的形式”，即所述多核苷酸制备物基本上不含与其天然结合的其它多核苷酸材料。在本文中，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”同义。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的。此类调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和目的为引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

编码序列：当用于本文中时，术语“编码序列”意指直接指明其蛋白质产物氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框确定，其通常以ATG起始密码子或其他起始密码子如GTG和TTG起始。所述编码序列可为DNA、cDNA或重组核苷酸序列。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

修饰：术语“修饰”在本文中意指对由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸1至40组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码该多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可为氨基酸取代、缺失和/或插入，以及氨基酸侧链的置换；或在氨基酸序列中使用具有类似特征的非天然氨基酸。具体而言，所述修饰可为酰胺化，如C端的酰胺化。

发明详述

具有抗微生物活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及具有抗微生物活性的分离的多肽，选自下组：

(a)包含下述氨基酸序列的多肽：

GFGCNGPWSE DDLXCHXHCK SIKGYXGGYC AKGGFXCKCY (SEQID NO：1)

其中

位置14的X是R或K；

位置17的X是N或R；优选位置17的X是R；

位置26的X是R或K；和

位置36的X是V或L；

和

(b)(a)的具有抗微生物活性的片段。

在一个优选实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或其具有抗微生物活性的片段。在一个优选的方面，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列；或其具有抗微生物活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。

在一个优选实施方案中，本发明的多肽为防卫素多肽。

N-端延伸

本发明的多肽的N-端延伸可适当地由1至50个氨基酸，优选2-20个氨基酸，尤其是3-15个氨基酸组成。在一个实施方案中，N-端肽延伸不包含Arg(R)。在另一个实施方案中，N-端延伸包含kex2或kex2-样切割位点，如在下文进一步定义的。在一个优选的实施方案中，N-端延伸为肽，其包含至少两个Glu(E)和/或Asp(D)氨基酸残基，如包含以下序列之一的N-端延伸：EAE、EE、DE和DD。

Kex2位点

Kex2位点(参见，例如，Methods in Enzymology Vol 185，D.Goeddel编，Academic Press Inc.(1990)，San Diego，CA，“Gene Expression Technology”)和kex2-样位点为在一些蛋白质的前肽编码区和成熟区之间存在的二元的(dibasic)识别位点(即，切割位点)。

插入kex2位点或kex2-样位点已在某些情况中显示改进于前肽切割位置的正确内肽酶加工，导致蛋白质分泌水平增加。

在本发明的上下文中，插入kex2或kex2-样位点导致在N-端延伸中某个位置处获得切割的可能性，造成抗微生物多肽与如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸1至40的成熟多肽相比得到延长。

融合的多肽

本发明的多肽也包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽被融合于本发明的多肽或其片段的N-端或C-端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合的多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

多核苷酸

本发明还涉及具有编码本发明多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteinsfrom recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞有用的其它启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞有用的其它终止子由Romanos等，1992，见上描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码区，该信号肽编码区与编码分泌多肽的编码区的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码区为外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可为必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶和疏棉状腐质霉脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码区由Romanos等，1992，见上。

调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过从前多肽催化或自催化切割所述前肽而转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码区。

当信号肽和前肽区二者均出现在多肽的氨基末端时，使前肽区的位置紧接着(next to)多肽氨基末端，并且使信号肽区的位置紧接着前肽区的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。上述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达用调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等价物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch 15：9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，从而也含有该多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸，将所述重组宿主细胞有利地用于多肽的重组产生。将包含本发明的多核苷酸的载体引入宿主细胞从而将所述载体作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体保持，如前文所述。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其因为在复制过程中发生的突变而与该亲本细胞不同。宿主细胞的选择在很大程度上会依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可为单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。

可用的单细胞微生物为细菌细胞如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌(Bacillus)细胞，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，或链霉菌(Streptomyces)细胞，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)和灰鼠链霉菌(Streptomyces murinus)，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(E.coli)和假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)。在一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。在另一个优选的方面，所述芽孢杆菌细胞是嗜碱芽孢杆菌。

例如，可通过下述方法实现将载体引入细菌宿主细胞：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278)。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’Dictionary of The Fungi，第八版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，见上)。

在更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，会将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。

在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevistae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母细胞(Saccharomyces oviformis)。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、鬼伞属(Coprmus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。

在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjapomcus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusariumvenenatum)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa或Ceriporiopsis subverm ispora、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngu)、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、Trametes villosa、Trametes versicolor、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal ofBacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academyof Sciences USA 75：1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞能够以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。优选地，所述细胞为Zophobas属的细胞，并更优选为Zophobas atratus的细胞。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用。例如，抗微生物活性测定可用于确定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCHPublishers，New York，1989)。

植物

本发明还涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，其经本发明编码具有抗微生物活性的多肽的核苷酸序列转化，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如为了促进本发明的应用而分离的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个表达构建体并入植物宿主基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定在其中整合了该表达构建体的宿主细胞有用的选择性标记和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等，1988，Plant Physiology 86：506所述。

对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等，1980，Cell 21：285-294，Christensen等，1992，PlantMo.Biol.18：675-689；Zhang等，1991，Plant Cell 3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等，1998，Plant andCell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Viciafaba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其它种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，PlantMolecular Biology 22：573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等，1993，见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant MolecularBiology 19：15-38)，而且也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物常常使用其它的转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecular Biology 21：415-428所描述的。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择并入了表达构建体的转化体并且再生成为完整植株。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明具有抗微生物活性的多肽；和(b)回收所述多肽。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物如药物组合物。优选地，所述组合物富集这种多肽。术语“富集”表示所述组合物的抗微生物活性得到了增加，例如，以1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

所述组合物还可包含另一种药学活性剂，如其他杀生物剂或抑生物剂(biostatic agent)，如呈现如上所定义的抗微生物活性的另一种抗微生物多肽。所述杀生物剂可为本领域已知的抗生素。抗生素的类型包括青霉素类，例如青霉素G、青霉素V、甲氧西林、苯唑西林、羧苄西林、萘夫西林、氨苄西林等；青霉素类组合β-内酰胺酶抑制剂，头孢菌素类，例如头孢克洛、头孢唑啉、头孢呋辛、拉氧头孢等；碳青霉烯类；单酰胺菌素类；氨基糖苷类；四环素类；大环内酯类；林可霉素类；多粘菌素类；磺胺类；喹诺酮类；氯霉素；甲硝唑；大观霉素；甲氧苄啶；万古霉素等。所述杀生物剂还可为抗霉菌剂，包括多烯类，例如两性霉素B、制霉菌素；5-flucosyn；和唑类，例如咪康唑、酮康唑、伊曲康唑和氟康唑。

在一个实施方案中，所述杀生物剂为非酶化学剂。在另一个实施方案中，所述杀生物剂是非多肽化学剂。

所述组合物可包含合适的载体物质。所述组合物还可包含合适的递送介质，其在所述组合物用作药物时，能够将本发明的抗微生物多肽递送至所需的位置。

可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法将包括于所述组合物中的多肽稳定化。

下面给出的是本发明多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法确定。

方法和用途

本发明还涉及使用具有抗微生物活性的多肽的方法。所述抗微生物多肽通常可用于任何受细菌、真菌、酵母或藻类污染的位置。通常，位置为在水性系统如冷却水系统、洗衣漂洗水中，油系统如切削油、润滑油、油田等中，其中需要杀灭微生物或需要控制其生长。然而本发明还可用于所有对其可使用已知的抗微生物组合物的应用，如保护木材、橡胶、粘合剂、胶、纸、纸板、纺织品、皮革、塑料、填缝剂(caulking)和饲料。

其他的用途包括保存食物，饮料，化妆品如洗液、乳膏、凝胶、软膏、肥皂、洗发剂、调理剂(conditioner)、止汗剂、除臭剂、漱口剂(mouth wash)，隐形眼镜产品，酶制剂或食物成分。

因此，本发明的抗微生物多肽可用作消毒剂，例如，用于治疗眼中或口部的感染，皮肤感染；用于止汗剂或除臭剂；用于清洁和消毒隐形眼镜和牙齿(口腔护理)。

概括而言，可以考虑将本发明的抗微生物多肽用于清洁、消毒或抑制任何表面上的微生物生长。可以有利地与本发明的抗微生物多肽接触的表面的例子是所用加工设备的表面，例如，乳制品厂，化学或药品加工厂，水卫生系统，炼油厂，纸浆加工厂，水处理厂和冷却塔所用的加工设备的表面。本发明的抗微生物多肽应该以对于清洁、消毒或抑制所述表面上微生物生长有效的量使用。

本发明的抗微生物多肽还可用于在食品加工厂以及任何准备或供应食物的区域如医院、疗养院和餐馆中清洁表面或烹饪器皿。

其还可在水基颜料中用作防腐剂或消毒剂。

本发明还涉及本发明抗微生物多肽或组合物作为药物的用途。此外，本发明的抗微生物多肽或组合物还可用于制备控制微生物如真菌生物或细菌(优选革兰氏阳性细菌)或与之对抗的药物。

本发明的组合物和抗微生物多肽可用作抗微生物的兽用或人用治疗剂或预防剂。因此，本发明的组合物和抗微生物多肽可用于制备供治疗微生物感染，如细菌或真菌感染，优选革兰氏阳性细菌感染的兽用或人用治疗剂或预防剂。具体而言，所述微生物感染可与包括但不限于结核病、肺炎和囊性纤维化病的肺部疾病，以及包括但不限于淋病和衣原体(chlamydia)的性传播疾病相关。

本发明组合物包含有效量的本发明的抗微生物多肽。

当用于本文中，术语“有效量”旨在意指足以抑制讨论中的微生物生长的本发明抗微生物多肽的量。

本发明还涉及伤口愈合组合物或产物如绷带，医疗仪器如例如导管，并进一步涉及抗头皮屑护发产品(hair product)如洗发剂。

将本发明的抗微生物多肽的配制物施用给正罹患或易患微生物感染的宿主。施用可为外用的、局部的或系统性的，取决于具体微生物，优选其为局部的。一般而言，本发明的抗微生物多肽剂量会足以通过杀灭至少约50％，通常为至少1个数量级，且可为2个或更多个数量级而减小微生物群体。本发明的化合物以减小微生物群体同时最小化任何副作用的剂量施用。考虑对于体内用途，所述组合物可在医师的指导下获取并使用。本发明的抗微生物多肽特别有用于杀灭革兰氏阳性细菌，包括链球菌如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoma)、乳房链球菌(S.uberis)、猪肠链球菌(S.hyointestinalis)、酿脓链球菌(S.pyogenes)和无乳链球菌(S.agalactiae)，以及葡萄球菌如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、模仿葡萄球菌(S.simulans)、木糖葡萄球菌(S. xylosus)和肉葡萄球菌(S.carnosus)。

可将本发明的抗微生物多肽的配制物施用于正罹患或易感微生物肺部感染如肺炎，或微生物伤口感染如细菌性伤口感染的宿主。

还可将本发明的抗微生物多肽的配制物施用于正罹患或易感皮肤感染如粉刺、特应性皮炎或脂溢性皮炎的宿主；优选地，所述皮肤感染是细菌性皮肤感染，例如由表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、Pityrosporum ovale或Malassezia furfur造成的感染。

本发明的抗微生物多肽还可用于体外配制物以杀灭微生物，特别是当不愿引入大量常规抗生素时。举例而言，可将本发明的抗微生物多肽添加至动物和/或人食品制备物；或其可作为细胞体外培养的添加剂包含在内，以阻止微生物在组织培养中长出(outgrowth)。

具体微生物对用本发明抗微生物多肽杀灭的易感性可通过体外测试确定，如实验部分所详述。通常，将微生物的培养物与多种浓度的抗微生物多肽组合一段足以允许蛋白起作用的时间，通常为约一小时至一日。然后对生活的微生物进行计数，并确定杀灭的水平。

目标微生物包括但不限于革兰氏阴性细菌，例如：柠檬酸杆菌属菌种(Citrobacter sp.)；肠杆菌属菌种(Enterobacter sp.)；埃希氏菌属菌种(Escherichiasp.)例如大肠杆菌；克雷伯氏菌属菌种(Klebsiella sp.)；摩根氏菌属菌种(Morganella sp.)；变形菌属菌种(Proteus sp.)；普罗威登斯菌属菌种(Providenciasp.)；沙门氏菌属菌种(Salmonella sp.)例如伤寒沙门氏菌(S.typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属菌种(Serratia sp.)；志贺氏菌属菌种(Shigellasp.)；假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；耶尔森氏菌属菌种(Yersinia sp.)例如鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、假结核耶尔森氏菌(Y. pseudotuberculosis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)；弗朗西丝氏菌属菌种(Franciscella sp.)；巴斯德氏菌属菌种(Pasturella sp.)；弧菌属菌种(Vibrio sp.)例如霍乱弧菌(V.cholerae)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)；弯曲杆菌属菌种(Campylobacter sp.)例如空肠弯曲杆菌(C.jejuni)；嗜血菌属菌种(Haemophilus sp.)例如流感嗜血菌(H.influenzae)、杜氏嗜血菌(H.ducreyi)；博德特氏菌属菌种(Bordetella sp.)例如百日咳博德特氏菌(B.pertussis)、支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)；布鲁氏菌属菌种(Brucella sp.)，奈瑟氏菌属菌种(Neisseria sp.)例如淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)等。其他目标细菌包括军团菌属菌种(Legionella sp.)例如嗜肺军团菌(L.pneumophila)；利斯特氏菌属菌种(Listeria sp.)例如单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；枝原体属菌种(Mycoplasma sp.)例如人型枝原体(M.hominis)、肺炎枝原体(M. pneumoniae)；分枝杆菌属菌种(Mycobacterium sp.)例如结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M. leprae)；密螺旋体属菌种(Treponema sp.)例如苍白密螺旋体(T.pallidum)；疏螺旋体属菌种(Borrelia sp.)例如布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)；钩端螺旋体属菌种(Leptospirae sp.)；立克次氏体属菌种(Rickettsia sp.)例如立氏立克次氏体(R.rickettsii)、斑疹伤寒立克次氏体(R.typhi)；衣原体属菌种(Chlamydia sp.)例如砂眼衣原体(C.trachomatis)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)；螺杆菌属菌种(Helicobacter sp.)例如幽门螺杆菌(H.pylori)等。

目标非细菌病原体包括真菌和原生生物病原体例如疟原虫属物种(Plasmodia sp.)例如恶性疟原虫(P.falciparum)；锥虫属物种(Trypanosoma sp.)例如布氏锥虫(T.brucei)；血吸虫；内变形虫属物种(Entaemoeba sp.)，隐球属物种(Cryptococcus sp.)，假丝酵母属物种(Candida sp.)，例如白假丝酵母(C.albicans)等。

可使用多种不同的施用方法。所述多肽配制物可口服施用，或可静脉内、皮下、腹膜内注射、通过气雾剂、眼部(opthalmically)、膀胱内、局部(topically)等方式施用。举例而言，通过吸入的施用方法在本领域是公知的。治疗性配制物的剂量变化会较广泛，其取决于待施用的特定抗微生物多肽、疾病的特性、施用的频率、施用的方式、药剂自宿主的清除率(clearance)等。初始剂量可较大，然后用较小的维持剂量。剂量的施用可为不频繁的，如每周或每两周(biweekly)，或可分为较小的剂量，并每日一次或数次，或半周一次等施用以维持有效的剂量水平。在许多情况下，口服施用会比静脉内施用需要更高的剂量。酰胺键，以及氨基与羧基端，可经修饰以在口服施用中具有较高的稳定性。例如，羧基端可以是酰胺化的。

配制物

本发明的化合物可并入不同配制物中以供治疗施用。更具体而言，本发明的化合物可通过与适合的、药学上可接受的载体或稀释剂结合而配制成药物组合物，且可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制备物，例如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、软膏、乳霜、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球体、洗剂以及气雾剂。如此，所述化合物的施用可通过不同的方式达成，包括口服、含服、直肠、胃肠外、腹膜内、皮内、经皮、气管内施用等。本发明的抗微生物多肽在施用后可为系统性的，或通过使用发挥在植入位点保持活性剂量的作用的植入物或其他配制物而为局部的。

在一个实施方案中，用于外用的配制物包含螯合剂，其减少二价阳离子，特别是钙和镁的有效浓度。举例而言，可包含药剂如柠檬酸、EGTA或EDTA，其中优选柠檬酸。柠檬酸的浓度通常会为约1至10mM。

本发明的化合物可单独施用、彼此组合施用、或其可与其他已知化合物(例如，穿孔素(perforin)、抗炎剂、抗生素、等等)组合使用。在药物剂量形式中，所述化合物可以其药学上可接受的盐形式施用。以下方法与赋形剂仅为示例性的，而决非限制性的。

对于口服制备物，所述化合物可单独使用或与适合的添加剂组合以制造片剂、粉剂、颗粒或胶囊，例如，与常规的添加剂，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与结合剂，例如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶组合；与崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠结合；与润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁组合；以及若需要，与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂以及调味剂组合。

所述化合物可通过将其溶解、悬浮、或乳化于水性或非水性溶剂，如植物油或其他类似的油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇中，以及若需要，与常规的添加剂，如助溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂与防腐剂组合，而配制成用于注射的制备物。

所述化合物可用于气雾剂配制物中通过吸入施用。本发明的化合物可配制到经加压可接受的推进剂，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮和类似物中。

所述化合物可通过与常规添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂配制用作洗剂，例如用于防止烧伤感染，

此外，所述化合物可通过与不同基底，如乳化基底或水溶性基底混合而制成栓剂。本发明的化合物可通过栓剂经直肠施用。栓剂可包括媒介，如可可脂、碳蜡与聚乙二醇，其在体温下会融化，但在室温下会凝固。

可提供用于口服或直肠施用的单位剂量形式，如糖浆、酏剂和悬浮剂，其中每个剂量单位，例如，一荼匙的量(teaspoonful)、一大匙的量(tablespoonful)、片剂或栓剂包含预定量的组合物，其包含一种或多种本发明的化合物。类似的，用于注射或静脉内施用的单位剂量形式可包括在组合物中的本发明的化合物，而所述组合物是无菌水、生理盐水或另一个药学上可接受载体的溶液。

用于持续释放配制物的移植物在本领域是公知的。移植物用生物可降解的或非生物可降解的聚合物配制为微球体、厚板(slab)等。例如，乳酸和/或羟基乙酸的聚合物形成可受到侵蚀的聚合物，其可良好地被宿主所容忍。将包含本发明的抗微生物多肽的移植物置于接近感染部位处，使得活性药剂的局部浓度相对于身体其他部分有所增加。

如本文所使用的术语”单位剂量形式”指物理上分开的单位，其适合作为用于人类和动物受试者的单位剂量，每个单位包含与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介结合的预定量的本发明化合物，该量经计算足以产生期望的效果。本发明单位剂量形式的规格取决于所使用的特定化合物以及所欲达到的效果、以及在宿主中与所述化合物相关的药物动力学。

药学上可接受的赋形剂，例如媒介、佐剂、载体或稀释剂，是公众可轻易获得的。此外，药学上可接受的辅助物质，例如pH调整与缓冲剂、张力调整剂、稳定剂、湿润剂、以及类似物，是公众可轻易获得的。

用于系统性施用的典型剂量范围是从每次施用每公斤受试者体重0.1pg至100毫克。典型剂量可为每天服用一个片剂二到六次，或每天服用一个经时间-释放(time-release)的胶囊或片剂一次，其包含成比例较高含量的活性成分。经时间-释放效果可通过溶于不同pH值的胶囊物质、通过渗透压缓慢释放的胶囊、或任何其他已知的控制性释放方法而获得。

本领域技术人员会容易地了解到剂量水平可作为所述特定化合物、症状严重性和受试者对副作用的敏感性的函数而变化。一些特定化合物比其他的更具效力。对于给定化合物的优选剂量可由本领域技术人员容易的通过不同的方式确定。一个优选的方式为测定给定化合物的生理效力。

使用脂质体作为递送媒介为一种受关注的方法。脂质体与靶位点的细胞融合并将其内腔的内容物递送至细胞内。将脂质体维持与细胞接触足够的时间以融合，其使用不同的方法以维持接触，例如分离、结合剂以及类似物。在本发明的一个方面，脂质体经设计为气雾剂化的以供肺部施用。脂质体可用介导膜融合的纯化蛋白质或肽，如仙台病毒或流感病毒等制备。脂质可为任何已知的脂质体形成性脂质的有用组合，包括阳离子或两性离子脂质，如磷脂酰胆碱。剩下的脂质一般会为中性或酸性脂质，如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油以及类似物。

为了制备脂质体，可使用Kato等(1991)J. Biol.Chem.266：3361所叙述的方法。简而言之，脂质与包含肽的内腔组合物在适合的水性介质，方便的为盐水介质中组合，其中总固体范围会大约为1-10重量百分比。在短时间(大约5-60秒)激烈搅动后，将试管置于温水浴(大约25-40℃)并重复此循环约5-10次。接着将组合物用超声处理一段方便的时间(一般约1-10秒)并可进一步通过漩涡震荡而搅动。接着通过加入水性介质扩增体积，通常使体积增加大约1-2倍，接着摇动并冷却。此方法使得将高分子量分子并入内腔中成为可能。

与其他活性剂一起的配制物

为了用于本主题的方法，本发明的抗微生物多肽可与其他药学上有活性的试剂，特别是其他抗微生物剂一起配制。关注的其他试剂包括种类广泛的抗生素，如本领域中已知的。抗生素的类型包括青霉素类，如青霉素G、青霉素V、甲氧西林、苯唑西林(oxacillin)、羧苄西林、萘夫西林(nafcillin)、氨苄西林等；青霉素类组合β-内酰胺酶抑制剂，头胞菌素类，如头孢克洛(cefaclor)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢呋辛(cefuroxime)、拉氧头孢(moxalactam)等；碳青霉烯(carbapenem)类；单酰胺菌素(monobactam)类；氨基糖苷类；四环素类；大环内酯类；林可霉素类；多粘菌素类；磺胺类；喹诺酮(quinolone)类；氯霉素；甲硝唑(metronidazole)；大观霉素；甲氧苄啶(trimethoprim)；万古霉素等。

抗霉菌剂，包括多烯类，例如两性霉素B、制霉菌素；5-flucosyn；以及唑类，例如咪康唑、酮康唑(ketoconazol)、伊曲康唑(itraconazol)与氟康唑(fluconazol)亦为有用。抗结核药物包括异烟肼(isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、链霉素与利福平(rifampin)。细胞因子如干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白介素12等亦可包括于本发明的抗微生物多肽的配制物中。

体外合成

本发明的抗微生物肽可通过体外合成使用本领域中已知的常规方法制备。不同的商业合成设备，例如Applied Biosystems Inc.，Beckman的自动化合成仪等，是可获得的。通过使用合成仪，可以用非天然氨基酸，特别是D-异构体(或D-型)，例如D-丙氨酸与D-异亮氨酸、非对映异构体、具有不同长度或官能基的侧链以及类似物取代天然存在的氨基酸。制备的特定顺序与方式会依据方便性、经济性、所需纯度以及类似因素而确定。

可将化学结合提供给不同的肽或蛋白质，包括常规的用于键合的官能团，例如用于形成酰胺或取代胺，例如还原性胺化的氨基基团、用于形成硫醚或二硫键的巯基基团、用于形成酰胺的羧基基团，等等。

若需要，可在合成过程中或在表达过程中将不同的基团引入肽中，其允许结合至其他分子或表面。因此，可使用半胱氨酸以制备硫醚、使用组氨酸以连接至金属离子络合物、使用羧基基团以形成酰胺或酯、使用氨基基团以形成酰胺，等等。

多肽亦可根据常规的重组合成方法而分离与纯化。可制备表达宿主的裂解液，而将该裂解液使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其他纯化技术纯化。在大多数情况下，所使用的组合物会包括至少20重量百分比的所期望的产物，更通常为至少大约75重量百分比，优选为至少大约95重量百分比，以及为了治疗性目的，通常至少为大约99.5重量百分比，其是相对于与产物制备和产物纯化的方法有关的污染物而言。通常，百分比会基于总蛋白质。

本发明进一步通过以下实施例叙述，其不应被视为对本发明之范围加以任何限制。

实施例

用作缓冲液和底物的化学品为至少试剂级的商业产品。

实施例1

合成防卫素多肽的抗微生物活性

设计了三种合成的防卫素多肽(SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4)以呈现针对葡萄球菌的提高的抗微生物活性。将其抗微生物活性与之前在WO03/044049和WO2006/131504中公开的已知防卫素相比较。氨基酸序列如下所示。所有与SEQ ID NO：5(Plectasin)的差异以下划线显示。

A：GFGCNGPWSE DDLRCHRHCK SIKGYRGGYC AKGGFVCKCY  (SEQ工D NO：2)

B：GFGCNGPWSE DDLKCHNHCK SIKGYKGGYC AKGGF_LCKCY  (SEQ工D NO：3)

C：GFGCNGPWSE DDLKCHRHCK SIKGYKGGYC AKGGFLCKCY  (SEQ工D NO：4)

D：GFGCNGPWDE DDMQCHNHCK SIKGYKGGYC AKGGFVCKCY  (SEQ工D NO：5)

E：GFGCNGPWSE DDMKCHNHCK SIKGYKGGYC AKGGFLCKCY  (SEQ工D NO：6)

F：GFGCNGPWNE DDLRCHNHCK SIKGYKGGYC AKGGFVCKCY  (SEQ工D NO：7)

示为SEQ ID NO：5的氨基酸序列与Plectasin(参见WO03/044049)相同。SEQ ID NO：6与WO2006/131504中的SEQ ID NO：227相同。SEQ ID NO：7与WO2006/131504中的SEQ ID NO：241相同。

基本如WO 03/044049和WO 2006/131504中所述将编码基因克隆并在米曲霉中表达，并将其纯化，HPLC定量并在肽稀释缓冲液(0.1％BSA，0.01％乙酸)中稀释至640μg/mL。

最低抑制浓度(MIC)是根据来自NCCLS/CLSI(CLSI M7-A7)的实验方案针对一组革兰氏阳性细菌确定的。

将细菌在阳离子调整的Müller-Hinton培养液中生长，并暴露于两倍稀释的肽，例如，64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.13、0.6和0.03μg/mL。在37℃温育18-24小时之后，对MIC进行读数，将其确定为防止肉眼可见细菌生长的最低肽浓度。

如表1所示，三种合成防卫素，显示为A、B和C，与参照防卫素(显示为(D、E和F)相比，针对葡萄球菌和肠球菌有显著改进(2-8倍)。

表1.最低抑制浓度(MIC；μg/mL)

Claims (17)

1.一种具有抗微生物活性的多肽，选自下组：

(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽：

Gly-Phe-Gly-Cys-Asn-Gly-Pro-Trp-Ser-Glu-Asp-Asp-Leu-Xaa-Cys-His-Xaa-His-Cys-Lys-Ser-Ile-Lys-Gly-Tyr-Xaa-Gly-Gly-Tyr-Cys-Ala-Lys-Gly-Gly-Phe-Xaa-Cys-Lys-Cys-Tyr；

其中

位置14的Xaa是Arg或Lys；

位置17的Xaa是Asn或Arg；

位置26的Xaa是Arg或Lys；

位置36的Xaa是Val或Leu；

和

(b)(a)的具有抗微生物活性的片段。

2.权利要求1的多肽，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其具有抗微生物活性的片段组成。

3.权利要求2的多肽，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

4.权利要求1的多肽，其包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4的氨基酸序列。

5.权利要求4的多肽，其由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。

6.一种分离的多核苷酸，包含编码权利要求1-5中任一项的多肽的核苷酸序列。

7.一种核酸构建体，包含权利要求6的多核苷酸可操作地连接于一个或多个在表达宿主中指导所述多肽产生的调控序列。

8.一种重组表达载体，包含权利要求7的核酸构建体。

9.一种重组宿主细胞，包含权利要求7的核酸构建体。

10.一种产生权利要求1-5中任一项的多肽的方法，包括(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

11.一种产生权利要求1-5中任一项的多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养包含编码本发明具有抗微生物活性的多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。

12.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其经编码权利要求1-5中任一项的多肽的多核苷酸转化。

13.一种药物组合物，包含如权利要求1-5中任一项限定的抗微生物多肽和药学上可接受的载体。

14.一种如权利要求1-5中任一项限定的抗微生物多肽，其用作药物、或抗微生物兽用或人用治疗剂或预防剂。

15.如权利要求1-5中任一项限定的抗微生物多肽在制备用于治疗微生物感染的药物中的用途。

16.一种杀灭或抑制微生物细胞生长的方法，包括将所述微生物细胞与如权利要求1-5中任一项限定的抗微生物多肽相接触。

17.一种治疗微生物感染的方法，包括以有效治疗微生物感染的量向人或动物施用权利要求1-5中任一项的多肽。