CN104945467B - 一种抗菌肽的人工合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种抗菌肽的人工合成方法：S1.取适量氨基酸原料，加入植物油和磷酸，在150℃烘2h，所述植物油和磷酸的体积比为17～30：1；S2.取出聚合物用无水乙醇洗涤、离心、烘干，得到产物抗菌肽；所述氨基酸原料含有赖氨酸、亮氨酸和半胱氨酸，加上精氨酸、甘氨酸、丝氨酸中的一种或多种；其中，半胱氨酸：赖氨酸：亮氨酸=9：7～9：4.5～14，所述比值为重量比。本发明所述合成方法生产工序简单，合成时间短，成本低，可大规模生产，合成得到的抗菌肽具有广谱抗菌活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种抗菌肽的人工合成方法。
背景技术
抗生素（antibiotics）是一类天然或人工合成的化合物，能够杀死细菌或者可以抑制细菌的生长。随着科学技术的不断发展，抗生素的定义也不断被扩充，其中抗微生物，包括抗真菌等化合物都被纳入到抗生素的范围。
人类自1940年发现第一种抗生素青霉素（penicillin）并将其应用于临床之后，就开始了抗生素治疗的新时代。许多曾经严重危害人类生命健康的感染性疾病因抗生素的使用而得到了有效的控制，并大幅降低了婴儿出生的死亡率和手术后的感染率，人类的平均寿命也得以延长15～20年。因此，各种各样的抗生素已经成为多数疾病的治疗中必不可少的药物。
然而，随之而来的是抗生素的滥用导致的严重的问题：抗生素的耐药性（Drugresistance）。在临床上，耐药性是指病原体及癌细胞等对化学治疗药物敏感性降低。而抗生素的耐药性主要指当微生物暴露在抗生素环境中时，仍然能够生存并进行繁殖的现象。出现耐药性的原因是，在自然选择的压力下，拥有抗性基因的菌株会成为优势菌株存活下来。这些抗性基因通常存在于质粒中，而对于微生物（尤其是细菌），抗性基因可以通过转化、转导等现象进行转移并迅速复制，使一个菌落迅速获得抗性。
研究表明，研制一种新型抗生素大约需要十年或更长的时间，而细菌产生耐药性的时间却不足两年，新药的研制速度远远跟不上细菌耐药性产生的速度。而一旦出现拥有多种抗性基因的“超级细菌”，人们将对其无药可用。早在1976年，肺炎链球菌就被发现对青霉素产生了耐药。而在2010年在南亚地区发现的新型超级病菌NDM-1，所有现存的抗生素都对其不起作用。目前为止，NDM-1引起的疾病还找不到有效的治疗方法，而且有不断蔓延的趋势，引起了广泛关注。
因此在医疗卫生上迫切需要高效、低毒、高选择性广谱抑菌药物的研究和开发以保护人类的健康。而研究表明许多生物的基因组中也有编码抗生素的基因。这些基因编码的多为一些短肽，称为抗菌肽。抗菌肽一般携带正电荷，其具有抑菌活性强、不易产生耐药性等特点。抗菌肽一般长为10到40个氨基酸，经常形成过膜通道并经常具有溶血性、毒性，缺乏靶向抗菌抗癌特性。如果能够人工设计抗菌肽，则能够开发新的抗生素的资源，有效地解决当前医学上抗生素耐药性的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术所存在的上述缺陷，提供一种抗菌肽的人工合成方法。
本发明的第二个目的是提供上述方法得到的抗菌肽。
本发明的第三个目的是提供上述抗菌肽的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一种抗菌肽的人工合成方法，包括以下步骤：
S1. 取适量氨基酸原料，加入植物油和磷酸，在150℃烘2h，所述植物油和磷酸的体积比为17～30：1；
S2. 取出聚合物用无水乙醇洗涤、离心、烘干，得到产物抗菌肽；
所述氨基酸原料含有半胱氨酸、赖氨酸和亮氨酸；半胱氨酸：赖氨酸：亮氨酸=9：7～9：4.5～14，所述比值为重量比。
优选地，所述氨基酸原料中还含有精氨酸、甘氨酸、丝氨酸中的一种或多种。
优选地，S2所述用无水乙醇洗涤、离心的方式为用3倍体积的无水乙醇洗三次再离心或者用3倍体积的无水乙醇洗涤后离心，再重复两次。
更优选地，S2所述离心方法为6000 r/min，离心5～10min。
优选地，所述氨基酸原料为进口、国产分析纯或化学纯氨基酸。
优选地，所述氨基酸原料为L型、D型或DL型。
优选地，所述植物油为任意的植物油。更优选地，所述植物油选自花生油、葵花籽油、玉米油或芝麻油中的一种或多种。
具体地，当氨基酸原料为赖氨酸、亮氨酸、半胱氨酸和精氨酸时，所述半胱氨酸：赖氨酸：亮氨酸：精氨酸=9：7～9：4.5～14：2.25～7，所述比值为重量比。
具体地，当氨基酸原料为赖氨酸、亮氨酸、半胱氨酸和甘氨酸时，所述半胱氨酸：赖氨酸：亮氨酸：甘氨酸=9：7～9：4.5～14：2.25～13，所述比值为重量比。
具体地，当氨基酸原料为赖氨酸、亮氨酸、半胱氨酸和丝氨酸时，所述半胱氨酸：赖氨酸：亮氨酸：丝氨酸=9：7～9：4.5～14：2.25～6，所述比值为重量比。
具体地，所述氨基酸原料为精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸和丝氨酸6种氨基酸的不同比例组合，所述精氨酸：半胱氨酸：甘氨酸：亮氨酸：赖氨酸：丝氨酸=7：9～18：13：7～14：7～14：6，所述比值为重量比。
在一个实施例中，所述精氨酸：半胱氨酸：甘氨酸：亮氨酸：赖氨酸：丝氨酸=7：18：13：14：14：6。
在另一个实施例中，所述精氨酸：半胱氨酸：甘氨酸：亮氨酸：赖氨酸：丝氨酸=7：9：13：14：7：6。
在另一个实施例中，所述精氨酸：半胱氨酸：甘氨酸：亮氨酸：赖氨酸：丝氨酸=7：9：13：7：7：6。
提供上述方法制备得到的抗菌肽。
本发明合成的抗菌肽具有抗金黄色葡萄球菌（ATCC6538），嗜水气单胞菌（珠江水产研究所惠赠），酿酒酵母（INVSc1）、多重耐药金黄色葡萄球菌Y5和黄曲霉NRRL3357等的效果。抑菌圈大小与抗菌肽用量密切相关；因此，本发明还提供上述抗菌肽在制备抗嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、多重耐药金黄色葡萄球菌、酿酒酵母或/和黄曲霉药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种抗菌肽的人工合成方法，使用的氨基酸原料仅需赖氨酸、亮氨酸、半胱氨酸，加上精氨酸、甘氨酸、丝氨酸中的一种或多种，生产工序简单，合成时间短，成本低，可大规模生产，合成得到的抗菌肽具有广谱且高效的抗菌活性。
本发明方法适用于生产需大量使用抑菌消毒剂的产品，如表面消毒液、饲料添加剂、产品抑菌保鲜剂等，更可确保抗菌肽无污染无残留。大规模应用时，可在降低养殖动物发病率的同时，降低肉类中的抗生素残留，减少人体间接摄入抗生素的量，对水产养殖业、生猪和肉禽的养殖以及农业种植业具有实际的应用意义。
附图说明
图1为实施例1合成的抗菌肽对黄曲霉NRRL3357的抑菌效果。
图2为实施例1合成的抗菌肽对金黄色葡萄球菌Y5的抑菌效果。
图3为实施例1合成的抗菌肽对嗜水气单胞菌的抑菌效果。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一、抗菌肽的合成方法：
S1. 按照不同比例（见表1）称取精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸和丝氨酸6种氨基酸放入10毫升烧杯中，向各烧杯中加入体积比为30：1的花生油和磷酸，花生油和磷酸刚好浸没氨基酸原料，在150℃烘2小时后取出。
S2. 用3倍体积的无水乙醇洗三次，6000转/分钟离心10分钟，60℃烘箱烘干，4℃冰箱保存备用。
二、抗菌肽的抑菌圈实验：
S1. 从保种管中分别取50μl金黄色葡萄球菌ATCC6538等细菌、100μl黄曲霉NRRL3357和100μl酿酒酵母INVSC1至相应的5ml培养基中。
S2. 各细菌在37℃，220rpm摇床过夜培养11小时左右，酵母菌和黄曲霉在30℃，220rpm摇床过夜培养16小时左右。
S3. 分别将400μl细菌加入到50℃左右的融化的300ml LB固体培养基混匀，倒入培养皿；将500μl酵母菌、1000μl黄曲霉的菌液分别加入到50℃左右的融化的300ml YPD、300mlPDA固体培养基混匀（浓度视具体情况而定）。
S4. LB培养基冷却后用直径为6mm打孔器打孔，各孔中分别加入事先配好的浓度为0.5g/ml的各肽40μl（即每孔肽的质量约为20mg），YPD、PDA固体培养基冷却后用直径为7mm打孔器打孔，各孔中分别加入事先配好的浓度为0.5g/ml的各肽100μl（即每孔肽的质量约为50mg）。每个板另设两个对照孔：无菌水，氨苄或卡那霉素。（注：细菌中无菌水40μl，100mg/ml氨苄5μl补加35μl无菌水；酿酒酵母和黄曲霉中无菌水100μl，50mg/ml卡那霉素20μl补加80μl无菌水）。
S5. 金黄色葡萄球菌置于37℃培养14小时，酵母菌培养24小时、黄曲霉30℃培养2天后观察合成肽是否有抑菌效果及直径大小，拍照记录（结果见表2）。
S6. 从上述抗菌肽中选出效果最好的肽，然后根据其成分设计合成新的抗菌肽（见表3），新肽的合成过程与抑菌圈实验过程同上（除了体积比为17：1的花生油和磷酸外，其它一样，结果见表4）。
Claims (3)
1.一种抗菌肽的人工合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 取适量氨基酸原料，加入花生油和磷酸，在150℃烘2h；
S2. 取出聚合物用无水乙醇洗涤、离心、烘干，得到产物抗菌肽；
所述氨基酸原料为：
（1）半胱氨酸、赖氨酸和亮氨酸，其重量比为2：2：1，所述 花生油和磷酸的体积比为17：1；
（2）半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸和精氨酸，其重量比为4：4：2：1，所述 花生油和磷酸的体积比为17：1；
（3）半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸，其重量比为4：4：2：1，所述 花生油和磷酸的体积比为17：1；
（4）半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸和丝氨酸，其重量比为4：4：2：1，所述 花生油和磷酸的体积比为17：1或
（5）精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸和丝氨酸，其重量比为7：18：13：14：14：6，所述 花生油和磷酸的体积比为30：1。
2.一种如权利要求1所述方法制备得到的抗菌肽。
3.权利要求2所述抗菌肽在制备抗嗜水气单胞菌、多重耐药金黄色葡萄球菌或/和黄曲霉药物中的应用。
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