CN104311627A

CN104311627A - 一种抗菌肽的合成方法和应用

Info

Publication number: CN104311627A
Application number: CN201410597590.0A
Authority: CN
Inventors: 刘秋云; 何建国; 彭静立; 付敏; 邢梦; 王媛
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2014-10-29
Filing date: 2014-10-29
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2034-10-29
Also published as: CN104311627B

Abstract

本发明公开了一种抗菌肽的合成方法和应用。所述方法包括S1.取适量氨基酸原料，加入溶剂和磷酸，在150~180℃烘2~6h，所述溶剂和磷酸比例为3~16:1；S2.取出烘干反应物用无水乙醇洗涤、离心、晾干，得到产物抗菌肽；所述溶剂为环丁砜或植物油；溶剂为环丁砜时，所述氨基酸原料含有赖氨酸或/和精氨酸；溶剂为植物油时，所述氨基酸原料含有赖氨酸，或含有精氨酸，并添加亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的一种或多种。本发明使用的氨基酸原料仅需赖氨酸或/和精氨酸即可，简单快速，合成成本经济，合成的抗菌肽对多种菌具有高抗菌活性，可大规模生产及应用。

Description

一种抗菌肽的合成方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗菌肽的合成方法和应用。

背景技术

抗生素因其对感染性疾病的卓越疗效而一度被大范围高剂量使用，在大大降低了人类病痛折磨的同时也带来了细菌的耐药性问题。从1960年发现耐青霉素淋球菌到2009年肆虐全球的抗药性基因NDM-1，耐药性细菌的发现贯穿了抗生素使用史。抗生素的作用机理可归纳为：抑制核酸的合成，抑制蛋白质的合成，改变细胞膜的通透性，干扰细胞壁的形成，作用于能量代谢系统或作为抗代谢物。

抗菌肽是生物体对外界病原物质侵染而产生的一系列免疫应答反应产物，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，除具有广谱抗细菌、真菌和病毒等病原体作用外，还有抗肿瘤的作用。抗菌肽具有分子量小、两亲结构、杀菌力强、抗菌谱广、来源多、分布广、不易产生耐药性、安全性好(在高于有效浓度时仍不会引起红细胞或淋巴细胞的裂解)等特点。且多数抗菌肽能够显著增强免疫，刺激动物机体产生天然的免疫反应，提高机体免疫应答能力、抗体水平。

合成抗菌肽多是改造或修饰已知的天然抗菌肽或者根据天然抗菌肽的一部分共有属性设计得来的，具有比天然抗菌肽更小的分子量和相应的结构简单，合成速度快等优势，而其抑菌能力更等同甚至优于天然抗菌肽。

目前，化学合成抗菌肽的一般方法为固相合成法，其主要原理是通过固体树脂载体上的化学基团与氨基酸的羧基末端相连接，暴露氨基端连接肽，接着将需要连接的氨基酸用一定的方法和试剂，只暴露与活化它的羧基端，进而同连在树脂上的氨基端进行连接反应，肽段合成完毕后，再通过相应的化学试剂将多肽从树脂上切除下来，从而得到抗菌肽。该法工序复杂，从树脂上切割下来的过程中容易产生副反应，且需专门的仪器，需要时间较长，进而限制了新型抗菌肽的研制与应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种抗菌肽的合成方法。所述方法使用的氨基酸原料仅需赖氨酸或/和精氨酸即可，简单快速，合成成本经济，合成的抗菌肽对多种菌具有高抗菌活性，可大规模生产及应用。

本发明的另一个目的是提供所得抗菌肽在抗菌方面的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种抗菌肽的合成方法，包括以下步骤：

S1.取适量氨基酸原料，加入溶剂和磷酸，在150～180℃烘2～6h，所述溶剂和磷酸比例为3～16:1；

S2.取出烘干反应物用无水乙醇洗涤、离心、晾干，得到产物抗菌肽；

所述溶剂为环丁砜或植物油；

溶剂为环丁砜时，所述氨基酸原料含有赖氨酸或/和精氨酸；

溶剂为植物油时，所述氨基酸原料含有赖氨酸，或含有精氨酸并添加亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的一种或多种。

优选地，当所述溶剂为环丁砜时，所述氨基酸原料中还添加亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的一种或多种；当所述溶剂为植物油时，所述氨基酸原料含有赖氨酸的同时还添加亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的一种或多种。

优选地，当所述溶剂为植物油时，所述氨基酸原料为精氨酸和亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的多种，精氨酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸的每一种＝1:4～6:1；或者所述氨基酸原料为精氨酸和异亮氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸，精氨酸：异亮氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸＝1:2；或者氨基酸原料为精氨酸和亮氨酸或丙氨酸，精氨酸：亮氨酸或丙氨酸＝2:1；所述比值均为重量比。更优选地，例如，所述氨基酸原料的组成和比例为精氨酸：亮氨酸：天冬氨酸＝1:4:1，或者所述氨基酸原料的组成和比例为精氨酸：亮氨酸：异亮氨酸：缬氨酸＝6:1:1:1。

优选地，当所述溶剂为环丁砜时，所述氨基酸原料为赖氨酸或/和精氨酸和亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸；所述赖氨酸或/和精氨酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸＝1～4:1；所述比值均为重量比。

优选地，当所述溶剂为环丁砜时，所述氨基酸原料为赖氨酸或/和精氨酸和亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的多种；赖氨酸或/和精氨酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸的每一种＝1～16:1；所述比值均为重量比。更优选地，例如，所述氨基酸原料的组成和比例为赖氨酸：亮氨酸：丝氨酸：苏氨酸＝16:8:1:1。

优选地，当所述溶剂为植物油时，所述氨基酸原料为赖氨酸和亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸；所述赖氨酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸＝1:2～4:1；所述比值均为重量比。

优选地，当所述溶剂为植物油时，所述氨基酸原料为赖氨酸和亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的多种；所述赖氨酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸的每一种＝1:6～6:1；所述比值均为重量比。更优选地，例如，所述氨基酸原料的组成和比例为赖氨酸：丝氨酸：缬氨酸：异亮氨酸＝3:2:2:8，或者所述氨基酸原料的组成和比例为赖氨酸：精氨酸：亮氨酸＝1:1:6，或者所述氨基酸原料的组成和比例为赖氨酸：缬氨酸：异亮氨酸：亮氨酸＝6:1:1:1。

更优选地，当溶剂为植物油时，所述氨基酸原料全为赖氨酸时，合成的抗菌肽的抗菌效果最好。

优选地，当合成用氨基酸原料总量≧50克时，S1所述烘干反应物会分上、中、下3层，取中层的烘干反应物，用无水乙醇洗涤、离心、晾干，得到产物抗菌肽。因为中层的抗菌肽比较多。当合成用氨基酸原料总量<50克时，S1所述烘干反应物不会分层，取所有上清液用水乙醇洗涤、离心、晾干，得到产物抗菌肽。

优选地，S2所述用无水乙醇洗涤、离心的方式为用3倍体积的无水乙醇洗三次再离心或者用3倍体积的无水乙醇洗涤后离心，再重复两次。

更优选地，S2所述离心方法为6000r/min，离心5-10min。

优选地，所述氨基酸原料为进口、国产分析纯或化学纯氨基酸。

优选地，所述氨基酸原料为L型、D型或DL型。

优选地，所述植物油为任意的植物油。更优选的，所述植物油选自花生油、葵花籽油、玉米油或芝麻油中的一种或多种。

本发明还提供上述方法制备得到的抗菌肽。

本发明还提供所述抗菌肽在制备抗大肠杆菌、嗜水气单胞菌、枯草杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、耻垢分枝杆菌、溶藻弧菌、多杀巴斯德杆菌、多重耐药金黄色葡萄球菌、酿酒酵母或/和黄曲霉药物中的应用。

本发明合成的抗菌肽具有抗大肠杆菌(MG1655，DH5α)，耻垢分枝杆菌(1.562，北京中国普通微生物菌种保藏管理中心)，绿脓杆菌(1.2464，北京中国普通微生物菌种保藏管理中心)，溶藻弧菌(珠江水产研究所惠赠)，多杀巴斯德杆菌(珠江水产研究所惠赠)，金黄色葡萄球菌(ATCC6538)，多重耐药金黄色葡萄球菌Y5(张颖等，一起食物中毒事件的金黄色葡萄球菌分子分型研究，中华预防医学杂志，2008，42(9):672-676)，嗜水气单胞菌(珠江水产研究所惠赠)，酿酒酵母(INVSc1)和黄曲霉NRRL3357等的效果。抑菌圈大小与抗菌肽用量密切相关。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明在合成抗菌肽时使用的氨基酸原料仅需赖氨酸或/和精氨酸即可，或者与特定种类的氨基酸及其配比合成抗菌肽，生产工序简单，合成时间短，成本低，可大规模生产，合成得到的抗菌肽具有广谱抗菌活性。

(2)本发明合成的抗菌肽可以在医院消毒、农业、养殖业等领域得到应用。所述抗菌肽对多重耐药的金黄色葡萄球菌也具有抗菌活性，解决了目前医院和农业上针对该菌只剩万古霉素可用的现状。

(3)本发明方法适用于生产需大量使用抑菌消毒剂的产品，如表面消毒液、饲料添加剂、产品抑菌保鲜剂等，更可确保抗菌肽无污染无残留。大规模应用时，可在降低养殖动物发病率的同时，降低肉类中的抗生素残留，减少人体的间接摄入抗生素量，对水产养殖业、生猪和肉禽的养殖以及农业种植业产生深远影响。

以下是氨基酸缩写代码，即氨基酸的单字母记号和三字母记号，见表1。

表1 氨基酸缩写代码

Amp：氨苄青霉素。

大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌Y5、耻垢分枝杆菌、溶藻弧菌、多杀巴斯德杆菌的简写分别为MG1655、DH5α、金葡ATCC、嗜水气单胞菌、绿脓杆菌、金葡Y5、耻垢、溶藻菌、巴斯德菌。

附图说明

图1为实施例4赖氨酸与各种氨基酸混合合成的抗菌肽对大肠杆菌DH5α抑菌效果。

图2为实施例4赖氨酸与各种氨基酸混合合成的抗菌肽对耻垢菌抑菌效果。

图3为实施例4赖氨酸与各种氨基酸混合合成的抗菌肽对溶藻菌抑菌效果。

图4为实施例4赖氨酸与各种氨基酸混合合成的抗菌肽对巴斯德菌抑菌效果。

图5为实施例4赖氨酸与各种氨基酸混合合成的抗菌肽对多重耐药金黄色葡萄球菌Y5抑菌效果。

图6为实施例4赖氨酸与各种氨基酸混合合成的抗菌肽对嗜水气单胞菌抑菌效果。

图7为实施例5精氨酸与各种氨基酸混合合成的抗菌肽对嗜水气单胞菌抑菌效果。

图8为实施例7合成的抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。

图9为实施例7合成的抗菌肽对绿脓杆菌的抑菌效果。

图10为实施例9合成的抗菌肽对酿酒酵母INVSc1的抑菌效果。

图11为实施例10合成的抗菌肽对酿酒酵母INVSc1的抑菌效果。

图12为实施例10合成的抗菌肽对金黄葡萄球菌的抑菌效果。

图13为实施例12合成的抗菌肽对金黄葡萄球菌ATCC6538的抑菌效果。

图14为实施例12合成的抗菌肽对酿酒酵母INVSc1的抑菌效果。

图15为实施例12合成的抗菌肽对黄曲霉NRRL3357的抑菌效果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1

赖氨酸或精氨酸分别和亮氨酸(AMRESCO生产，L型)按照不同比例混合，先热聚合4小时后，再加亮氨酸或不加亮氨酸热聚合交联1小时，研究各抗菌肽对大肠杆菌DH5α，金黄色葡萄球菌ATCC6538的抑菌效果。

一、抗菌肽的合成方法：

S1.按照1:1，2:1，3:1，4:1的质量比分别称取赖氨酸(或精氨酸)和亮氨酸，或者只称取适量赖氨酸，分别放入10毫升烧杯中，向各烧杯中加入体积比为16:1的环丁砜和磷酸，环丁砜和磷酸刚好浸没氨基酸原料，在150℃烘4小时后取出；

S2.一部分加入适量亮氨酸再在150℃烘1小时，另一部分不加亮氨酸再在150℃烘1小时后取出；

S3.用3倍体积的无水乙醇洗三次，6000转/分钟离心10分钟，60℃烘箱烘干，4℃冰箱保存备用。

二、抗菌肽的抑菌圈实验：

将37℃摇床过夜培养11小时的DH5α和ATCC6538加入到50℃左右融化的LB固体培养基中，使菌液浓度约为1×10⁸cfu(菌落形成单位/毫升)，倒入培养皿，冷却后用直径为5毫米打孔器打孔，称取20毫克上述合成的抗菌肽加到每个孔里，然后每孔加入30微升水；37℃培养过夜后观察各抗菌肽是否有抑菌效果、记录抑菌圈直径并拍照，结果见表2。(注：以下抑菌圈直径不包括打孔器直径，直径以毫米为单位，下同)

表2 实施例1合成的抗菌肽的抑菌效果

抑菌圈直径为0：无抑菌圈(无)，无效果，下同。

实施例2

赖氨酸或精氨酸分别和亮氨酸(AMRESCO生产，L型)按照不同比例混合，热聚合6小时。研究合成的抗菌肽对大肠杆菌MG1655、金黄色葡萄球菌Y5、耻垢菌、绿脓杆菌、溶藻菌、嗜水气单胞菌、巴斯德菌的抑菌效果。

一、抗菌肽的合成方法：

S1.按照1:1，2:1，3:1，4:1的质量比分别称取赖氨酸(或精氨酸)和亮氨酸，或者只称取适量赖氨酸，分别放入10毫升烧杯中，向各烧杯中加入体积比为3:1的环丁砜和磷酸，150℃烘6小时后取出。

S2.用3倍体积的无水乙醇洗三次，6000转/分钟离心10分钟，60℃烘箱烘干，4℃冰箱保存备用。

二、抗菌肽的抑菌圈实验：

抑菌圈实验步骤同实施例1。称取10或20毫克上述合成的抗菌肽加到每个孔里，然后每孔加入30微升左右的水，实验结果见表3。

表3 实施例2合成的抗菌肽的抑菌效果

实施例3

一、抗菌肽的合成方法：

S1.按照2:1的质量比称取赖氨酸(或精氨酸)和亮氨酸(AMRESCO生产，L型；国产化学纯)，分别放入10毫升烧杯中，向各烧杯中加入体积比为4:1的环丁砜和磷酸，160℃烘3小时后取出；上述氨基酸原料选自国产化学纯或进口氨基酸。

S2.用3倍体积的无水乙醇洗三次，6000转/分钟离心10分钟，晾干，保存在4℃冰箱。

二、抗菌肽的抑菌圈实验：抑菌圈实验步骤同实施例1，实验结果见表4。

表4 实施例3合成的抗菌肽的抑菌效果

a表示：国产赖氨酸和国产亮氨酸2:1比例合成抗菌肽；

b表示：进口赖氨酸和国产亮氨酸2:1比例合成抗菌肽；

c表示：国产赖氨酸和进口赖氨酸2:1比例合成抗菌肽；

d表示：国产精氨酸和国产亮氨酸2:1比例合成抗菌肽；

e表示：进口精氨酸和国产亮氨酸2:1比例合成抗菌肽；

f表示：国产精氨酸和进口亮氨酸2:1比例合成抗菌肽；

amp:表示加了1.5微升5毫克/毫升氨苄青霉素；

b*:进口赖氨酸与进口亮氨酸按照2:1比例合成抗菌肽；

h*：进口精氨酸与进口亮氨酸按照2:1比例合成抗菌肽。

本实施例合成抗菌肽的氨基酸原料可用进口(AMRESCO LLC，Solon，OH，USA)或化学纯氨基酸(郑州市二七区中成食化商行，河南正兴食品添加剂有限公司，洛阳市西工区腾翼物资供应站，郑州市二七区创新食化商行，河南九天世纪食品添加剂有限公司)。

实施例4

赖氨酸与不同氨基酸(AMRESCO生产)混合合成抗菌肽的抗菌效果。

一、抗菌肽的合成方法：

S1.按照2:1的质量比分别称取0.4克L-赖氨酸和0.2克L-亮氨酸、DL-亮氨酸、L-异亮氨酸、DL-异亮氨酸、L-缬氨酸、DL-缬氨酸、L-苯丙氨酸或DL-苯丙氨酸，分别放入10毫升烧杯中，加入0.96毫升环丁砜和0.12毫升磷酸(二者体积比为8:1)，150℃烘4小时后取出，转移到50毫升离心管中。

S2.用3倍体积的无水乙醇纯化，6000转/分钟离心10分钟。

S3.重复步骤S2两次。

S4.60℃烘箱烘干，转移到2毫升Eppendorf管中，4℃冰箱保存备用。

二、抗菌肽的抑菌圈实验：

抑菌圈实验步骤同实施例1，实验结果见表5及图1-6。

合成抗菌肽的氨基酸原料的配比及在图中的字母表示为：

L-赖氨酸盐酸盐：L-亮氨酸＝2:1-产物抗菌肽A
	L-赖氨酸盐酸盐：DL-亮氨酸＝2:1-产物抗菌肽B
L-赖氨酸盐酸盐：L-异亮氨酸＝2:1-产物抗菌肽C
	L-赖氨酸盐酸盐：DL-异亮氨酸＝2:1-产物抗菌肽D
L-赖氨酸盐酸盐：L-缬氨酸＝2:1-产物抗菌肽E
	L-赖氨酸盐酸盐：DL-缬氨酸＝2:1-产物抗菌肽F
L-赖氨酸盐酸盐：L-苯丙氨酸＝2:1-产物抗菌肽G
	L-赖氨酸盐酸盐：DL-苯丙氨酸＝2:1-产物抗菌肽H

表5 实施例4合成抗菌肽的抑菌效果

实施例5

精氨酸与不同氨基酸(AMRESCO生产)混合合成抗菌肽对大肠杆菌MG1655、绿脓杆菌ATCC2464、嗜水气单胞菌、多重耐药金黄色葡萄球菌Y5的抑菌效果。

一、抗菌肽的合成方法：

S1.按照2:1的质量比分别称取0.4克L-精氨酸和0.2克L-亮氨酸、DL-亮氨酸、L-异亮氨酸、DL-异亮氨酸、L-缬氨酸、DL-缬氨酸、L-苯丙氨酸或DL-苯丙氨酸，分别放入10毫升烧杯中，向各烧杯中加入0.96毫升环丁砜和0.12毫升磷酸(二者体积比为8:1)，160℃烘4小时后取出，转移到50毫升离心管中。

S2.用3倍体积的无水乙醇纯化，6000转/分钟离心10分钟。

S3.重复步骤S2两次。

S4.60℃烘箱烘干，转移到2毫升Eppendorf管中，保存在4℃冰箱备用。

二、抗菌肽的抑菌圈实验：

抑菌圈实验步骤同实施例1，实验结果见表6和图7。

合成抗菌肽的氨基酸原料的配比及在图中的字母表示为：

L-精氨酸盐酸盐：L-亮氨酸＝2:1比例-产物抗菌肽A
	L-精氨酸盐酸盐：DL-亮氨酸＝2:1比例-产物抗菌肽B
L-精氨酸盐酸盐：L-异亮氨酸＝2:1比例-产物抗菌肽C
	L-精氨酸盐酸盐：DL-异亮氨酸＝2:1比例-产物抗菌肽D
L-精氨酸盐酸盐：L-缬氨酸＝2:1比例-产物抗菌肽E
	L-精氨酸盐酸盐：DL-缬氨酸＝2:1比例-产物抗菌肽F
L-精氨酸盐酸盐：L-苯丙氨酸＝2:1比例-产物抗菌肽G
	L-精氨酸盐酸盐：DL-苯丙氨酸＝2:1比例-产物抗菌肽H

表6 实施例5合成的抗菌肽的抑菌效果

实施例6

一、抗菌肽的合成方法：

按照表7氨基酸质量比配方，分别称取氨基酸原料(均为国产化学纯)，再分别加入植物油600微升和磷酸75微升(二者体积比为8:1)，在160℃烘2小时后取出，转移至离心管，用3倍乙醇洗3次，晾干。同时，仅以亮氨酸为合成原料作为对照，还设Amp为结果对照。合成实验结果见表7。

表7 实施例6合成抗菌肽实验结果

本实施例的植物油的产地分别为：花生油由广东中粮食品营销有限公司生产；金龙鱼葵花籽油由益海嘉里食品营销有限公司生产；鲁花压榨玉米油和芝麻香油由山东鲁花浓香花生油有限公司生产。

(2)抗菌肽的抑菌圈实验：

抑菌圈实验步骤同实施例1，实验结果见表8。

表8 实施例6合成的抗菌肽的抑菌效果

实施例7

一、抗菌肽的合成方法

按表9的质量比配方取氨基酸原料，并使每组氨基酸原料总量为0.6克，向每组分别加入花生油960微升和磷酸60微升(二者体积比为16:1)，在150℃烘4小时后取出。抗菌肽的其它步骤同实施例6。氨基酸原料均为国产化学纯氨基酸。

表9 实施例7抗菌肽氨基酸配比

(2)抗菌肽的抑菌圈实验：

将抗菌肽产物溶于5毫升无菌水中，混匀。每孔上样50微升抗菌肽，37℃保温24小时。其他步骤同实施例1，实验结果见表10和图8-9。

表10 实施例7合成的抗菌肽的抑菌效果

实施例8

一、抗菌肽的合成方法：

S1.A组合：赖氨酸＝40克，亮氨酸＝10克，均为国产化学纯氨基酸；

B组合：赖氨酸＝50克，国产化学纯氨基酸。

S2.向上述组合中分别加入80毫升芝麻油和27毫升磷酸(二者体积比为3:1)。

S3.在150℃烘箱烘6小时后取出，发现分为上、中、下三层。

(1)上层(U)，液体

取1毫升上层液体，加入1毫升无水乙醇，上下颠倒混匀，6000转/分钟离心5分钟，重复一次，取上清，将其少量的沉淀晾干。取1毫升离心后的上清液，做抑菌效果实验。

(2)中层(M)，粘稠的固体

取一块中层粘稠的固体，称重(A组合30毫克，B组合60毫克)。加无水乙醇1毫升，洗两次，晾干。各取20毫克做抑菌效果实验。

(3)下层(D)，残留在底部难以转移的固体，能完全水溶

将固体溶至1毫克/微升。各取20微升做抑菌效果实验。

二、抗菌肽的抑菌圈实验：

实验步骤同实施例1抗菌肽的抑菌圈实验。对照实验为Amp2微升，纯赖氨酸或亮氨酸(非聚合)20毫克。实验结果见表11。

表11 实施例8抗菌肽的抑菌效果

实施例9

一、抗菌肽的合成方法：

按表12的质量比配方取氨基酸原料，向每组氨基酸原料中分别加入1.8毫升环丁砜和0.4毫升磷酸(两者比例为4.5:1)，混匀，在155℃烘箱烘6小时。其它步骤同实施例6。

二、抗菌肽的抑菌圈实验

培养20小时，做酿酒酵母抑菌效果实验，抑菌效果实验步骤同实施例1，实验结果见表12及图10。

表12 实施例9合成的抗菌肽的抑菌效果

上表中各种氨基酸为：赖氨酸:DL-赖氨酸；丝氨酸:L-丝氨酸；精氨酸：DL-精氨酸；苏氨酸：L-苏氨酸；亮氨酸：DL-亮氨酸。

实施例10

一、抗菌肽的合成方法：

按照如下氨基酸质量比配方，分别称取氨基酸(AMRESCO)使氨基酸总质量为2.8克，分别放入10毫升烧杯中，向各烧杯中加入4.8毫升花生油和0.6毫升磷酸，在180℃烘2小时后取出，转移到50毫升离心管中。其它步骤同实施例6。

合成抗菌肽的氨基酸原料的配比及在图中的数字表示为：

产物序号	氨基酸配方
		1	赖氨酸:丝氨酸:缬氨酸＝2:1:1
2	赖氨酸:苏氨酸:缬氨酸＝2:1:1
		3	精氨酸:苏氨酸:缬氨酸＝2:1:1
4	赖氨酸:亮氨酸:异亮氨酸:缬氨酸＝2:1:1:1
		5	精氨酸:亮氨酸:异亮氨酸:缬氨酸＝2:1:1:1
6	赖氨酸:亮氨酸:D＝2:1:1
		7	赖氨酸:亮氨酸:E＝2:1:1
8	赖氨酸:苯丙氨酸＝2:1

9	赖氨酸:苯丙氨酸＝1:2
		10	赖氨酸:苯丙氨酸＝1:4
11	赖氨酸:苯丙氨酸＝1:6
		12	赖氨酸:亮氨酸＝1:2
13	赖氨酸:亮氨酸＝1:4
		14	赖氨酸:亮氨酸＝1:6
15	精氨酸:亮氨酸＝1:2
		16	精氨酸:亮氨酸＝1:4
17	精氨酸:亮氨酸＝1:6
		18	赖氨酸:精氨酸:亮氨酸＝1:1:2
19	赖氨酸:精氨酸:亮氨酸＝1:1:4
		20	赖氨酸:精氨酸:亮氨酸＝1:1:6
21	赖氨酸:缬氨酸＝2:1
		22	赖氨酸:异亮氨酸＝2:1
23	赖氨酸:亮氨酸＝2:1
		24	精氨酸:亮氨酸＝2:1
25	赖氨酸:亮氨酸:丝氨酸:苏氨酸＝2:1:1:1
		26	精氨酸:甘氨酸:亮氨酸＝2:1:1
27	精氨酸:亮氨酸:天冬氨酸＝1:4:1

上表中各种氨基酸为：赖氨酸:L-赖氨酸盐酸盐；缬氨酸：DL-缬氨酸；丝氨酸：L-丝氨酸；精氨酸：L-精氨酸盐酸盐；苏氨酸：L-苏氨酸；异亮氨酸：L-异亮氨酸；亮氨酸：DL-亮氨酸；天冬氨酸：L-天冬氨酸；谷氨酸：L-谷氨酸；苯丙氨酸：L-苯丙氨酸；甘氨酸：甘氨酸。

二、抗菌肽的抑菌圈实验：

S1.金黄葡萄球菌在37℃、200转/分钟的摇床里过夜培养11小时；酵母菌在30℃、200转/分钟的摇床里过夜培养11小时。

S2.将400微升金黄葡萄球菌的菌液分别加入到300毫升LB固体培养基混匀，倒入培养皿；将500微升酵母菌的菌液分别加入到300毫升YPD固体培养基混匀；固体培养基均为融化至50℃左右。

S3.LB培养基冷却后，分别称取20毫克合成的抗菌肽加到每个孔里，然后每孔加入40微升水；YPD固体培养基冷却后，分别称取50毫克合成的抗菌肽加到每个孔里，然后每孔加入100微升水。

S4.金黄色葡萄球菌在37℃，酵母菌在30℃，各培养18小时，实验结果见表13和图11-12。

表13 实施例10合成的抗菌肽的抑菌效果

实施例11

一、抗菌肽的合成方法：

S1.按一定比例称取氨基酸原料如下：赖氨酸：丝氨酸：缬氨酸：异亮氨酸＝3:2:2:8。上述氨基酸原料均为组合国产分析纯，DL型。以上氨基酸原料总量为1克。葵花籽油磷酸比例和抑菌圈实验步骤同实施例6。

S2.放入到150℃烘箱中烘3小时。其他实验步骤同实施例6。

二、抗菌肽的抑菌圈实验，步骤同实施例6，实验结果见表14。

表14 实施例11合成的抗菌肽的抑菌效果与抗生素的比较

本实施例合成抗菌肽的氨基酸原料用国产分析纯(广州威佳科技有限公司，生工生物工程(上海)股份有限公司)。

实施例12

一、抗菌肽的合成方法：

S1.按照以下氨基酸(AMRESCO生产)的质量比配方分别称取氨基酸使每组氨基酸总质量为1.5克，分别放入10毫升烧杯中，向各烧杯中加入3.2毫升花生油和0.4毫升磷酸(两者比例为8:1)，150℃烘4小时后取出，转移到50毫升离心管中，称重。

1号：赖氨酸：缬氨酸：丝氨酸＝2:0.5:0.5；

2号：精氨酸：缬氨酸：丝氨酸＝2:0.5:0.5；

3号：赖氨酸：缬氨酸：苏氨酸＝2:0.5:0.5；

4号：精氨酸：缬氨酸：苏氨酸＝2:0.5:0.5；

5号：赖氨酸：缬氨酸：异亮氨酸：亮氨酸＝2:0.33:0.33:0.33；

6号：精氨酸：缬氨酸：异亮氨酸：亮氨酸＝2:0.33:0.33:0.33；

7号：赖氨酸：亮氨酸：天冬氨酸＝2:0.5:0.5；

8号：赖氨酸：亮氨酸：谷氨酸＝2:0.5:0.5；

9号：赖氨酸：亮氨酸：丝氨酸：苏氨酸＝2:0.33:0.33:0.33；

10号：精氨酸：亮氨酸：甘氨酸＝2:0.5:0.5；

对照肽：亮氨酸。

上面各种氨基酸为：L-赖氨酸盐酸盐、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸。

S2.用3倍体积的无水乙醇纯化，6000转/分钟离心5min。

S3.重复步骤S2两次。

S4.60℃烘箱烘干，再次称重，转移到2毫升管中，4℃冰箱存备用。

二、抗菌肽的抑菌圈实验：

S1.将200微升金黄葡萄球菌ATCC的菌液加入到150毫升LB固体培养基中混匀，倒入培养皿；将170微升酵母菌INVSc1、340微升黄曲霉NRRL3357的菌液分别加入到100毫升YPD、100毫升PDA固体培养基中混匀；固体培养基均为融化至50℃左右。

S2.培养金黄葡萄球菌ATCC的LB培养基，各孔分别加入20毫克的1-10号抗菌肽、5微升浓度为100毫克/毫升的氨苄。

S3.培养酵母INVSc1的YPD培养基和培养黄曲霉NRRL3357的PDA培养基各孔分别加入50毫克的1-10号合成的抗菌肽和对照肽、80微升浓度为50毫克/毫升的卡那霉素、20微升无菌水。

S4.金黄葡萄球菌ATCC置于37℃过夜培养，酵母INVSc1和黄曲霉NRRL3357置于30℃过夜培养，实验结果见表15和图13-15。

表15 实施例12合成的抗菌肽的抑菌效果

	金葡ATCC	酿酒酵母INVSc1	黄曲霉NRRL3357
				1号肽	15	2	2
2号肽	13	3	2
				3号肽	9	0	1
4号肽	12	0	1
				5号肽	15	0	0
6号肽	18	0	0
				7号肽	13	0	0
8号肽	18	0	10
				9号肽	14	9	9
10号肽	12	0	0
				无菌水	0	0	0
对照肽	0	0	0
				氨苄/	内32.5外52.5	0	0
卡那霉素	0	0	0

上述实施例中所用的LB配方为(500ml)：5g蛋白胨，2.5g酵母抽提物，5g氯化钠，蒸馏水，固体培养基加入2％琼脂糖。

所用的酵母YPD培养基配方：1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，固体培养基加入2％琼脂糖。

PDA培养基(广东环瑞微生物科技有限公司)配方：每升粉末中含马铃薯浸出物300克、葡萄糖20克、琼脂15克、氯霉素0.1克。取40.1克该粉末和5克琼脂至1升双蒸水中混合均匀。

Claims

1. 一种抗菌肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 取适量氨基酸原料，加入溶剂和磷酸，在150~180℃烘2~6h，所述溶剂和磷酸比例为3~16:1；

S2. 取出烘干反应物用无水乙醇洗涤、离心、晾干，得到产物抗菌肽；

所述溶剂为环丁砜或植物油；

溶剂为环丁砜时，所述氨基酸原料含有赖氨酸或/和精氨酸；

2.根据权利要求1所述抗菌肽的合成方法，其特征在于，当所述溶剂为环丁砜时，所述氨基酸原料中还添加亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的一种或多种；当所述溶剂为植物油时，所述氨基酸原料含有赖氨酸的同时还添加亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述抗菌肽的合成方法，其特征在于，当所述溶剂为植物油时，所述氨基酸原料为精氨酸和亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的多种，精氨酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸的每一种=1:4~6:1；或者所述氨基酸原料为精氨酸和异亮氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸，精氨酸：异亮氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸=1:2；或者氨基酸原料为精氨酸和亮氨酸或丙氨酸，精氨酸：亮氨酸或丙氨酸=2:1；所述比值均为重量比。

4.根据权利要求2所述抗菌肽的合成方法，其特征在于，当所述溶剂为环丁砜时，所述氨基酸原料为赖氨酸或/和精氨酸和亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸；所述赖氨酸或/和精氨酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸=1~4:1；所述比值均为重量比。

5.根据权利要求2所述抗菌肽的合成方法，其特征在于，当所述溶剂为环丁砜时，所述氨基酸原料为赖氨酸或/和精氨酸和亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的多种；赖氨酸或/和精氨酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸的每一种=1~16:1；所述比值均为重量比。

6.根据权利要求2所述抗菌肽的合成方法，其特征在于，当所述溶剂为植物油时，所述氨基酸原料为赖氨酸和亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸；所述赖氨酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸=1:2~4:1；所述比值均为重量比。

7.根据权利要求2所述抗菌肽的合成方法，其特征在于，当所述溶剂为植物油时，所述氨基酸原料为赖氨酸和亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的多种；所述赖氨酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸的每一种=1:6~6:1；所述比值均为重量比。

8.根据权利要求1所述抗菌肽的合成方法，其特征在于，当合成用氨基酸原料总量≧50克时，S1所述烘干反应物会分上、中、下3层，取中层的烘干反应物，用无水乙醇洗涤、离心、晾干，得到产物抗菌肽。

9.权利要求1~8任一项所述方法制备得到的抗菌肽。

10.权利要求9所述抗菌肽在制备抗大肠杆菌、嗜水气单胞菌、枯草杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、耻垢分枝杆菌、溶藻弧菌、多杀巴斯德杆菌、多重耐药金黄色葡萄球菌、酿酒酵母或/和黄曲霉药物中的应用。