CN105567769B - 一种可发酵产抗菌肽的枯草芽孢杆菌用增效剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可发酵产抗菌肽的枯草芽孢杆菌用增效剂及其使用方法，所述增效剂由以下成分按重量比组成：牛磺酸0.03‑1.0、硒0.008‑0.019、羟脯氨酸0.02‑0.8、木糖0.3‑2.0、尿素0.002‑0.01。将增效剂添加于LB培养基中，再接种产抗菌肽的枯草芽孢杆菌进行发酵。本发明增效剂各组分原料易得，采购成本低，使用方法简单。实验表明本发明增效剂能明显提高枯草芽孢杆菌的抗菌肽产量，增效明显，从而降低抗菌肽的生产成本、缩短生产周期，提高生产效率。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种可发酵产抗菌肽的枯草芽孢杆菌用增效剂及其使用方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是自然界中广泛存在的一种非致病性细菌，对酸碱度要求不高，热稳定性好，有机溶剂对其活性影响不大，在生长代谢过程中能够产生多种抗菌物质，包括非核糖体合成的羊毛硫抗生素、脂肽类抗生素。这些抗菌物质可以抑制细菌、真菌和酵母菌，在食品防腐方面有重要的应用价值。目前，化学防腐剂或合成防腐剂仍是一类重要的食品添加剂，但与工业防腐剂不同，食品防腐剂的安全卫生关系到国民健康安危。理想的食品防腐剂必须具备抑菌效果好、抗菌谱广、稳定性好、毒性低、无色、无臭、无刺激性、不影响食品风味等性能。尽管食品在生产工艺、质量控制、卫生标准等有很大的进步，但食品安全问题依旧不容忽视，微生物污染造成的食源性疾病问题十分突出。我国食品中毒事件中常见的重要致病菌为：沙门氏菌、单核增生李斯特氏菌、蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌、肉毒杆梭菌、大肠杆菌。开发微生物天然防腐剂因其抗菌谱广、稳定性好、毒性低、无色、无臭、无刺激性，不影响食品风味等性能而日益成为防腐研究的重点。
抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽具有强碱性、热稳定性及光谱抗菌等特点，称为抗菌肽。随着人们研究工作的深入，发现抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均有强有力的杀伤作用，天然抗菌肽还具有选择性免疫激活和调节功能，对败血症有良好的预防和保护作用。虽然抗菌肽有良好的前景，但是抗菌肽的来源有限，而且提取工艺繁琐复杂，生产效率低。如专利号为201310119518.2的一株枯草芽孢杆菌及其在生产抗菌肽中的应用中记载了一种保藏编号为CGMCC No.7200的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BF168，其能提高抗菌肽或抗菌物质的生产效率。在培养条件不变的情况下，它可能比别的产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌种的抗菌肽产量稍高，但对于其自身而言，抗菌肽的产生量是有极限的，采用现有方法，难以突破自身抗菌肽产量的极限。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种可大幅提高枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽的能力，同时减缓枯草芽孢杆菌的衰亡，抗菌肽的生产量大的可发酵产抗菌肽的枯草芽孢杆菌用增效剂。
本发明还提供一种方法简单、实用的增效剂的使用方法。
本发明增效剂由以下成分按重量比组成：
牛磺酸0.03-1.0、硒0.008-0.019、羟脯氨酸0.02-0.8、木糖0.3-2.0、尿素0.002-0.01。
进行一步，所述增效剂优选为牛磺酸0.3-0.8、硒0.01-0.015、羟脯氨酸0.2-0.6、木糖0.6-1.5、尿素0.005-0.008
所述枯草芽孢杆菌为可发酵产抗菌肽的枯草芽孢杆菌，如从中国南海柳珊瑚中分离的海洋枯草芽孢杆菌3512A对多种动植物病原菌都有显著抑制作用，其特别对黄瓜枯萎病菌有强的拮抗活性、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis B47菌株为番茄内生细菌,也是玉米小斑病拮抗菌,能产生对玉米小斑病菌有强烈抑制作用的抗菌物质、从烟草青枯病(菌)流行区的健康烟草植株茎内分离到1株内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subdlis)拮抗菌B-001，通过纯化的抗菌肽H16证明了枯草芽孢杆菌B-001菌株对烟草青枯病的抗病作用是其产生的抗菌肽所致。同时，证实B-001菌株对烟草具有促生作用，对多种病原真菌和细菌具有良好的拮抗作用，特别优选保藏号为CGMCC NO 1.3358的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis subsp.subtilis)，该枯草芽孢杆菌产生的抗菌肽有效抑制引起植物病害的植物病原真菌，且对人畜无害，不污染环境等特点，特别适用于本发明增效剂，能够大幅提高抗菌肽的生产量。
上述增效剂的使用方法，包括以下步骤：
(1)配制LB培养基；
(2)向所述LB培养基中加入所述增效剂，加入量为所述LB培养基质量的0.3％-3.8％；
(3)将枯草芽孢杆菌接种到步骤(2)得到的LB培养基中进行培养得到培养菌液，所述枯草芽孢杆菌的接种量为LB培养基质量的1.0％-1.5％；
所述步骤(3)中的培养方法采用摇瓶培养，控制转速为180-200r/min，培养温度为30-37℃，培养时间60-72h；
本发明基于发酵过程中可产生抗菌肽的枯草芽孢杆菌，通过向其培养基中添加增效剂，以促进进枯草芽孢杆菌的生产，提高抗菌肽的生产量，减少培养时间，提高生产效率，以降低生产成本。所述增效剂中牛磺酸具有促进微生物产生菌体蛋白，为微生物的的生长提供硫源，同时牛磺酸被枯草芽孢杆菌利用并参与蛋白合成，提高抗菌肽的抑菌作用，添加量为0.03-1.0，更为优选为0.3-0.8，过多会抑制枯草芽孢杆菌的生长和对硒的富集，过少会降低抗菌肽的活性；硒具有促进枯草芽孢杆菌的生长，增强枯草芽孢杆菌的抑菌能力，添加量为0.008-0.019，更为优选为0.01-0.015，过多会抑制微生物生长，过少会没有明显的抑菌效果；羟脯氨酸对枯草芽孢杆菌有强的增值作用，其作为氮源有助于枯草芽孢杆菌的吸收利用，与牛磺酸共同促进枯草芽孢杆菌产抗菌肽，添加量为0.02-0.8，更为优选为0.2-0.6，过多会抑制牛磺酸的吸收利用，抑制枯草芽孢杆菌产抗菌肽能力，过少会导致枯草芽孢杆菌菌体数的减少；木糖具有与硒协同促进枯草芽孢杆菌的生长，延缓枯草芽孢杆菌的衰亡，在提供碳源的同时与牛磺酸、羟脯氨酸共同促进抗菌肽的产生，添加量为0.3-2.0，更为优选为0.6-1.5，过多会抑制枯草芽孢杆菌的生长，过少会导致枯草芽孢杆菌的菌体数减少和抗菌肽活力下降；尿素具有刺激抗菌肽的活性的作用，添加量为0.002-0.01，更为优选为0.005-0.008，过多会抑制枯草芽孢杆菌的生长和抗菌肽活性，过少会降低抗菌肽活力。
本发明增效剂用于枯草芽孢杆菌发酵培养时，将其加入到LB培养基中混合均匀，其加入量为LB培养基质量的0.3％-3.8％，在此加入量作用下，能够促进增效剂之间的协同作用，枯草芽孢杆菌对其有良好的富集作用，从而促进枯草芽孢杆菌自身的生长，延迟生长衰亡期；在添加增效剂的培养条件下，枯草芽孢杆菌产生的抗菌肽增多，其抗菌能力也得到大大的增强。
有益效果：
(1)本发明针对可发酵产抗菌肽的枯草芽孢杆菌研制出一种增效剂，可大幅提高枯草芽孢杆菌培养过程中抗菌肽的产生量，提高枯草芽孢杆菌的代谢，延迟其生长衰亡，从而降低生产成本、缩短生产周期，提高生产效率。
(2)本发明增效剂各组分原料易得，采购成本低、通过简单混合后加入LB培养基中混匀即可，使用方法极为简单可靠、可控性好、具有广阔的市场应用前景。
(3)同一枯草芽孢杆菌在相同培养条件下，采用本发明增效剂与未使用增效剂的普通培养过程相比，枯草芽孢杆菌代谢更为旺盛，能够突破枯草芽孢杆菌自身的抗菌肽产量极限，可提高抗菌肽产量达50％以上，降低40％的生产成本。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
一，增效剂配方实施例1-5例见表1。
表1 增效剂实施例配方(重量比)
| 牛磺酸 | 硒 | 羟脯氨酸 | 木糖 | 尿素 | |
| 增效剂1 | 1.0 | 0.019 | 0.8 | 2.0 | 0.01 |
| 增效剂2 | 0.03 | 0.008 | 0.02 | 0.3 | 0.002 |
| 增效剂3 | 0.5 | 0.009 | 0.4 | 0.9 | 0.006 |
| 增效剂4 | 0.3 | 0.01 | 0.2 | 0.6 | 0.005 |
| 增效剂5 | 0.8 | 0.015 | 0.6 | 1.5 | 0.008 |
二、枯草芽孢杆菌发酵实施例1-5，其中，所述枯草芽孢杆菌为保藏号为CGMCC NO1.3358的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis)。
(1)、配制LB培养基置于三角瓶中，LB培养基配方为1.0g蛋白胨、0.5g酵母浸膏、1.0g氯化钠、100mL水；
(2)、向LB培养基加入增效剂，加入量见表2；
(3)、将枯草芽孢杆菌接种到上述灭菌后的LB培养基中，接种量见表2，进行摇瓶培养，控制转速为180-200r/min，培养温度为30-35℃，培养时间60-72h，分别得到培养菌液1-5。
表2 枯草芽孢杆菌的发酵实施例1-5
上述百分比以步骤(1)中LB培养基总质量为100％计。
对比实施例：
对比发酵实施例1：步骤(2)中的增效剂中不含有牛磺酸和硒，其余同发酵实施例1，得到对比培养菌液1；
对比发酵实施例2：步骤(2)中的增效剂中不含有羟脯氨酸和木糖，其余同实施例1，得到对比培养菌液2；
对比发酵实施例3：步骤(2)中不添加增效剂，其余同实施例1，得到对比培养菌液3。
对比实验方法：
(1)将培养菌液在常温8000r/min下离心30min，弃沉淀，上清液经切向流超滤系统超滤浓缩后，离心取上清液，即得到抗菌肽粗提液备用；
(2)取生长量为107CFU/mL的黑曲霉(CGMCC NO 3.6469)培养液作为指示菌悬液，将经灭菌后的指示菌生长培养基倒入直径9cm的培养皿中，每皿15mL，待冷却凝固后加入0.2mL指示菌悬液涂匀，待干燥后用无菌镊子放置牛津杯(内径6.0±0.1mm，高8.0±0.1mm)。静置20min后取步骤(1)中得到的0.2mL抗菌肽粗提液加入牛津杯内。将牛津杯小心放入培养箱，使杯内的发酵液充分扩散到培养基中，28℃培养72h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，每组做3个重复，取平均值。
将培养菌液1-5和对比培养菌液1-3分别采用上述实验方法进行对比实验，通过杯碟法测试枯草芽孢杆菌(保藏号为CGMCC NO 1.3358)所产抗菌肽的抑菌能力，并对培养液稀释10倍，使用紫外分光光度测量OD值(测量波长为600nm)计结果见表3。
表3，对比实验结果。
由表3可知，牛磺酸、硒、羟脯氨酸、木糖、尿素对枯草芽孢杆菌的生长有明显的促进作用，而且显著增强了枯草芽孢杆菌所产抗菌肽的抑菌活力。本发明提供一组可增强枯草芽孢杆菌抗菌能力的增效剂，这一组增效剂协同作用，提高了枯草芽孢杆菌的抑菌能力，为枯草芽孢杆菌用于抑制植物病原真菌奠定了基础。
Claims (5)
1.一种可发酵产抗菌肽的枯草芽孢杆菌用增效剂，其特征在于，所述增效剂由以下成分按重量比组成：
牛磺酸0.03-1.0、硒0.008-0.019、羟脯氨酸0.02-0.8、木糖0.3-2.0、尿素0.002-0.01。
2.如权利要求1所述的可发酵产抗菌肽的枯草芽孢杆菌用增效剂，其特征在于，所述增效剂由以下成分按重量比组成：
牛磺酸0.3-0.8、硒0.01-0.015、羟脯氨酸0.2-0.6、木糖0.6-1.5、尿素0.005-0.008。
3.如权利要求1或2所述的可发酵产抗菌肽的枯草芽孢杆菌用增效剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为可发酵产抗菌肽的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.subtilis)，其保藏号为CGMCC NO 1.3358。
4.如权利要求1-3任一项所述的增效剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制LB培养基；
(2)向所述LB培养基中加入所述增效剂，加入量为所述LB培养基质量的0.3％-3.8％；
(3)将枯草芽孢杆菌接种到步骤(2)得到的含有增效剂的LB培养基中进行培养得到培养菌液，所述枯草芽孢杆菌的接种量为LB培养基质量的1.0％-1.5％。
5.如权利要求4所述的增效剂的使用方法，其特征在于，所述步骤(3)中的培养采用摇瓶培养，控制转速为180-200r/mi n，培养温度为30-35℃，培养时间60-72h。
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