CN109628334A - 利用l-脯氨酸诱导培养提高酵母抑制果实病害效力的方法、制剂及所用培养基 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高生防酵母对果实病害防治效力的培养基，包括活化培养基和种子培养基；活化培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、琼脂20g、L‑脯氨酸0～1000mg(优选100mg)，加水定容至1000mL，灭菌后得NYDA活化培养基；种子培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、L‑脯氨酸0～1000mg(优选100mg)，加水定容至1000mL，灭菌后得NYDB种子培养基。本发明还提供一种诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的制剂，包括活化、液体培养和离心分离；本发明使用L‑脯氨酸培养罗伦隐球酵母控制梨果实青霉病的发病率，使用方法简单，操作方便，效果好，成本低。

Description

利用L-脯氨酸诱导培养提高酵母抑制果实病害效力的方法、 制剂及所用培养基

技术领域

本发明涉及的是果实采后病害防治技术领域，具体的是一种通过L-脯氨酸提高酵母对梨果实病害防治效力的生物防腐保鲜技术。

背景技术

水晶梨果实为圆球形或扁圆形，成熟时果皮呈乳黄色，果肉白色，肉质细腻，石细胞极少，味道可口，深受消费者的喜爱。梨果实含有丰富的营养成分，素有“百果之宗”的美誉，包含人体所需的维生素、有机酸、矿物质和抗氧化成分等多种营养物质，具有极高的经济、营养保健价值和鲜食、加工等多种用途。我国是梨属植物中心发源地之一，每年产量巨大。据统计，梨果实在我国栽种面积达100多万公顷，主要分布在中西部，西部以及华北地区。但由于其水分含量高，皮薄肉脆，在储藏和运输过程中易受到病原菌侵染，尤其是一些真菌的侵染，如扩展青霉(Penicillium expansum)引发的青霉病能造成大量的梨果实腐烂，严重的影响了其市场供应和农民的经济收益。这些病原菌主要依赖果实伤口或气孔、皮孔等天然开口而侵染。而且，许多病原真菌分泌产生有毒的次生代谢产物，如曲霉菌产生的黄曲霉毒素，扩展青霉产生的棒曲霉素，灰葡萄孢产生的葡双醛霉素等，将会引起严重的食品安全问题。

目前控制果实采后病害的主要方法有低温储藏和使用化学杀菌剂。低温储藏技术虽能在一定程度上延长果蔬货架期，但我国运输中的冷链技术非常不完善，且果实在冷藏过程中易发生冷害现象，严重影响果蔬的保鲜效果。长期以来，国内外对采后病害的控制主要依赖于化学杀菌剂。化学杀菌剂具有作用机理明确、效价高且效果稳定，并能控制采前潜伏感染等优点，所以直到现在仍然是控制采后病害的主要方法。但是，化学杀菌剂的长期和大量使用，严重污染环境，有损于人类健康。另一方面，长期使用单一的化学杀菌剂，病原菌可能进化形成抗药性，直接导致目前允许使用的一些杀菌剂对病害的防治效果越来越差，如thiabendazole和imazalil类杀菌剂。因此，寻找毒性低，防效高，低残留和环保的杀菌剂的替代品非常迫切。

近年来，利用拮抗酵母进行采后生物防治，被认为是一种很有希望替代化学杀菌剂的方法之一。利用拮抗酵母进行水果采后病害的生物防治具有许多其他方法无法比拟的优点：遗传稳定、抑菌谱光、安全性高、一般不产生对人体及环境有害的代谢产物；并且生长迅速、对环境条件的要求不苛刻；对多种逆境，如低温、干燥、热等具有较强的耐受能力；能与大多数的果蔬采后物理和化学处理方法相结合；可以耐受多数的化学杀菌剂。此外，拮抗酵母菌还能分解真菌毒素。因此，研究人员大多选择酵母菌作为果蔬采后防病保鲜的生防拮抗菌。目前报道的拮抗酵母菌主要集中于假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)、梅奇氏酵母属(Metschnikowia)。目前国内外已报道，甚至已商业化开发的拮抗酵母对果实病害的生物防治的效果和稳定性还远远达不到化学农药的水平，主要原因是生防活菌制剂中微生物的生活力在挤型加工、贮藏和使用过程中容易受到周围环境中不利因素的影响而降低。而拮抗菌对伤口病原菌的防治效果直接与伤口处的拮抗酵母菌数量相关，必须使用较高浓度的拮抗酵母菌才能得到较好的防治效果。此外，相对于化学杀菌剂，拮抗菌的生产成本比较高，这些因素都影响了拮抗酵母菌作为果蔬保鲜剂在生产中的应用。

近年来，一些研究者通过添加激发子对酵母拮抗菌的生理进行调控，从而提高拮抗酵母对水果采后病害的防治效力，取得了一定的成效。罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)是国内外较广泛研究的采后生物防治微生物菌种。中国发明申请专利《提高生防酵母对果实病害防治效力的方法》，申请号：201310127327.0，公开了一种利用β-葡聚糖提高罗伦隐球酵母对果实病害防治效力的方法。中国发明专利《提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法》，申请公布号CN 102696755 A，公布了一种海藻糖提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法。中国发明专利《诱导提高生防酵母对果实病害防治效力方法及所用培养基》，申请公布号CN 101857843 A，公布了一种利用几丁质作为拮抗酵母活性激发子，从而来诱导培养罗伦隐球酵母获得对果实病害更高活性的方法。中国发明专利《提高粘红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法》，申请公布号CN 101911968 A，公布了一种利用壳聚糖诱导培养粘红酵母菌种(Rhodotorulaglutinis)，进行水果采后病害防治及贮藏保鲜的方法。中国发明专利《一种提高胶红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法》，申请号201110166697.6，公布了一种利用植酸增强胶红酵母菌种(Rhodotorula mucilaginosa)对水果采后病害防治效力的方法。

上述专利中涉及的罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏为CGMCC No.3590；粘红酵母菌种(Rhodotorulaglutinis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏为CGMCC No.3589；胶红红酵母菌种(Rhodotorula mucilaginosa)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏为CGMCC No.3617。

L-脯氨酸又称吡咯烷酮羧酸，是明胶、麸蛋白(麦醇溶蛋白)、玉米醇溶蛋白、鲱精蛋白、酪蛋白等多种蛋白的组成成分，为非必须氨基酸，在生物体内经谷氨酸被代谢。L-脯氨酸是合成人体蛋白质的重要氨基酸之一，是氨基酸输液的重要原料，也是多种食品药品的原料，已被广泛应用于食品与医药行业。此外，在逆境条件下(旱、盐碱、热、冷、冻)，植物体内脯氨酸的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性。在生物体内，脯氨酸不仅仅是理想的渗透调节物质，而且还可作为膜和酶的保护物质及自由基清除剂，从而对植物在渗透胁迫下的生长起到保护作用，对于钾离子生物体内另外一种重要的渗透调节物质在液泡中的积累情况，脯氨酸又可起到对细胞质渗透平衡的调节作用。中国申请发明专利《L-脯氨酸提取新工艺》，申请号201710377903.5，公开了一种从发酵液中提取L-脯氨酸的新工艺。中国发明专利《一种提纯脯氨酸的方法》，申请号：200810198242.0，公开了一种从发酵液中提取、分离、纯化脯氨酸的方法。

因此，需要对现有技术进行改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，采用本发明中所提供的培养基能诱导提高生防酵母(罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590)对果实病害防治效力。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种提高生防酵母对果实病害防治效力的培养基，包括活化培养基和种子培养基；

活化培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、琼脂20g、L-脯氨酸0～1000mg(优选100mg)，加水定容至1000mL，灭菌后得NYDA活化培养基；

种子培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、L-脯氨酸0～1000mg(优选100mg)，加水定容至1000mL，灭菌后得NYDB种子培养基。

本发明还提供一种诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的制剂，包括以下步骤：

1)、活化：

①、生防酵母在NYPA活化培养基中25±2℃(优选25℃)培养48±4h(优选48h)，然后在相同条件下重复传代培养2次；

②、将重复传代培养2次所得的生防酵母用接种环接入到NYDB种子培养基中，于200±20rpm(优选200rpm)、28±2℃(优选28℃)的条件下培养24±2h(优选24h)；然后在上述相同条件下重复培养1次；

2)、液体培养：

将步骤1)所得的活化酵母以体积计1/4-1/6(优选1/5)的接种量接到NYDB种子培养基中，于200±20rpm(优选200rpm)、28±2℃(优选28℃)的条件下培养24±2h(24h)；

3)、离心分离：

将步骤2)液体培养后的所得物在3000±100g(优选3000g)离心10±1min(优选10min)，并用灭菌蒸馏水洗三次；用无菌蒸馏水调节酵母细胞浓度为1×10⁷cell/mL得到制剂。

作为对诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的制剂的改进：

生防酵母采用保藏编号为CGMCC NO.3590的罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)ZJU10。

本发明还提供一种诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的方法：

将制剂接种于果实的伤口处，使其完全覆盖果实伤口，待果实伤口处制剂自然风干后，将该果实放入容器中于密封状态下保存。

利用本发明的培养基对生防酵母，特别是罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590进行培养，所得酵母细胞具有更好的对果实进行防腐保鲜的效果。本发明所得的浓度为1×10⁷cell/mL的菌悬液30μL接种于梨果实伤口处，使其完全覆盖果实伤口，自然晾干后，将果实放入塑料筐中并用保鲜膜密封，25℃下贮藏，即可达到提高控制梨果实采后青霉病的目的。

本发明以打孔的方式模拟果实在运输过程中造成的机械损伤，一般而言，伤口直径5mm，深度2mm时，每个伤口中接入30μL菌悬液，此时刚好可以将伤口填满。同理，当伤口直径3mm，深度2mm时，每个伤口中接入20μL菌悬液。本实验采用的前者打孔和接种方式。

作为对诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的方法的改进：

所述果实为梨果实。

本发明利用L-脯氨酸诱导培养提高酵母抑制果实病害效力的方法、制剂及所用培养基的技术优势为：

(1)本发明使用L-脯氨酸培养罗伦隐球酵母控制梨果实青霉病的发病率，使用方法简单，操作方便，效果好，成本低。

(2)L-脯氨酸培养罗伦隐球酵母可以替代化学杀菌剂防治梨果实青霉病，避免了化学杀菌剂对人体健康的危害，具有显著的经济效益和社会效益。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为不同浓度L-脯氨酸诱导的罗伦隐球酵母对梨果实青霉病的抑制效果；结果为处理5天检测而得。其中图(a)为伤口处理发病率，图(b)为伤口处理病斑直径。不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。

图2为不同浓度几丁质诱导的罗伦隐球酵母对梨果实青霉病的抑制效果；结果为处理5天检测而得。其中图(a)为伤口处理发病率，图(b)为伤口处理病斑直径。不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。

图3为不同浓度DL-脯氨酸诱导的罗伦隐球酵母对梨果实青霉病的抑制效果；结果为处理5天检测而得。其中图(a)为伤口处理发病率，图(b)为伤口处理病斑直径。不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。

图4为不同浓度D-脯氨酸诱导的罗伦隐球酵母对梨果实青霉病的抑制效果；结果为处理5天检测而得。其中图(a)为伤口处理发病率，图(b)为伤口处理病斑直径。不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。

图5为不同浓度L-甘氨酸诱导的罗伦隐球酵母对梨果实青霉病的抑制效果；结果为处理5天检测而得。其中图(a)为伤口处理发病率，图(b)为伤口处理病斑直径。不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。

本发明采用的生防酵母为罗伦隐球酵母，罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCCNO.3590的罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii ZJU 10。该菌株已经在申请号为2010101521084的专利中被公开。

实施例1：

活化培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、琼脂20g、L-脯氨酸0～1000mg，加水定容至1000mL，灭菌(0.1MPa，121℃，20min)后得NYDA活化培养基。

种子培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、L-脯氨酸0～1000mg，加水定容至1000mL，灭菌(0.1MPa，121℃，20min)后得NYDB种子培养基。

本发明实施过程如下：

(1)、活化

1)、菌种固体活化：罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590在NYDA活化培养基25℃培养48h；然后在相同条件下重复传代培养2次；

2)、菌种液体培养：在250mL的三角瓶中装入50mL的NYDB种子培养基用接种环接入上述重复传代培养2次所得的活化后的酵母(C.laurentii)，在200rpm、28℃条件下培养24h；重复培养1次，得到活化酵母；

(2)液体培养：在250mL的三角瓶中装入50mL的NYDB种子培养基(L-脯氨酸浓度分别为0、1、10、100、1000ppm，即为每升NYDB种子培养基中L-脯氨酸分别为0、1、10、100、1000mg)，并加入上述菌种液体培养所得的活化酵母10mL，即为活化酵母以体积计1/5的接种量接到NYDB种子培养基中，然后在200rpm，28℃条件下培养24h；

(3)离心分离再悬浮：上述酵母培养混合物在3000g条件下，离心10min，并用无菌蒸馏水洗涤3次，以去除培养介质，用无菌蒸馏水重新再悬浮，并用血球计数板调节酵母细胞浓度为1×10⁷cell/mL。

实验1：L-脯氨酸诱导培养罗伦隐球酵母对梨青霉病的控制

以相同品种及成熟度的梨果实作为实验对象，用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深度的伤口。

先加入30μL不同的试剂，加入试剂2小时后在每个伤口加入等量(30μL)的P.expansum孢子悬浮液，浓度为1×10⁴spores/mL。处理完毕后在常温下(20-25℃)贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。每天定时对果实伤口处病害发生和发展情况进行观察和记录，结果以平均病害发生率(％)和平均病斑直径(mm)表示。每处理重复3次，每个重复24个果实。整个实验重复2次以上。发病率和病斑直径的计算公式如下：

每个伤口处加入的30μL试剂具体如下：

CK：果实伤口处加入30μL无菌水；即对照。

NYDB：果实伤口处加入30μL实施例1所得的浓度为1×10⁷cell/mL的酵母悬浮液(培养基中无L-脯氨酸，即为每升培养基中L-脯氨酸为0mg)；

1：果实伤口处加入30μL实施例1所得的浓度为1×10⁷cell/mL的酵母悬浮液(每升培养基中L-脯氨酸为1mg)；

10：果实伤口处加入30μL实施例1所得的浓度为1×10⁷cell/mL的酵母悬浮液(每升培养基中L-脯氨酸为10mg)；

100：果实伤口处加入30μL实施例1所得的浓度为1×10⁷cell/mL的酵母悬浮液(每升培养基中L-脯氨酸为100mg)；

1000：果实伤口处加入30μL实施例1所得的浓度为1×10⁷cell/mL的酵母悬浮液(每升培养基中L-脯氨酸为1000mg)；

试验结果如图1所述。

按照上述步骤试验，L-脯氨酸诱导培养罗伦隐球酵母对梨果实青霉病的控制效果如下：

从图1可以看出，试验中接种罗伦隐球酵母的所有处理均能降低扩展青霉引起的青霉病的发病率(％)和果实的病斑直径(mm)。当培养基中L-脯氨酸浓度为100ppm(每升培养基中L-脯氨酸为100mg)时，其对梨果实青霉病的抑制效果最为显著。NYDB培养的罗伦隐球酵母处理组青霉病的发病率为50.0％，而经过100ppm诱导培养罗伦隐球酵母(每升培养基中L-脯氨酸为100mg)处理的梨青霉病的发病率为16.6％，为NYDB组的33.2％。

对比例1：

将本发明的“L-脯氨酸”替换成“几丁质”，其余等同于实施例1。

对比实验1、

将实施例1中活化培养基和种子培养基中的L-脯氨酸替换为几丁质，所得的悬浮液作为试剂(浓度均为1×10⁷cell/mL)，其余分别如同实验1进行检测。

所得结果如图2(a)和(b)所示。

几丁质为1000ppm(每升培养基中几丁质为1000mg)时培养的罗伦隐球酵母的生防作用显著高于0、1、10、100ppm时的效果。与NYDB组相比，几丁质浓度为1000ppm时的果实发病率降低33.33％，病斑直径降低2.46mm。但是，其效果不及L-脯氨酸在100ppm的生防作用。

对比例2：

将本发明的“L-脯氨酸”替换成类似的化合物“DL-脯氨酸”，其余等同于实施例1。

对比实验2、

将实施例1中活化培养基和种子培养基中的L-脯氨酸替换为DL-脯氨酸，所得的悬浮液作为试剂(浓度均为1×10⁷cell/mL)，其余分别如同实验1进行检测。

所得结果如图3(a)和(b)所示。

当DL-脯氨酸浓度为1ppm或10ppm(每升培养基中DL-脯氨酸为1mg或10mg)时，生防效果与NYDB对照组相比无显著性差异。但是，当浓度增加至100ppm或1000ppm(每升培养基中几丁质为100mg或1000mg)时，发病率和病斑直径显著性降低，1000ppm时降低的效果最明显。其抑制作用不及L-脯氨酸在100ppm时的生防效果。

对比例3：

将本发明的“L-脯氨酸”替换成类似的化合物“D-脯氨酸”，其余等同于实施例1。

对比实验3、

将实施例1中活化培养基和种子培养基中的L-脯氨酸替换为D-脯氨酸，所得的悬浮液作为试剂(浓度均为1×10⁷cell/mL)，其余分别如同实验1进行检测。

所得结果如图4(a)和(b)所示。

D-脯氨酸诱导培养罗伦隐球酵母后，其诱导效果与NYDB对照组相比，降低幅度比较小，仅在100ppm(每升培养基中D-脯氨酸为100mg)时有小幅度的下降，发病率降低13％，病斑直径降低1.12mm。在浓度0～1000ppm(每升培养基中D-脯氨酸为0～1000mg)范围内，其生防效果远不如L-脯氨酸。

对比例4：

将本发明的“L-脯氨酸”替换成“L-甘氨酸”，其余等同于实施例1。

对比实验4、

将实施例1中活化培养基和种子培养基中的L-脯氨酸替换为L-甘氨酸，所得的悬浮液作为试剂(浓度均为1×10⁷cell/mL)，其余分别如同实验1进行检测。

所得结果如图5(a)和(b)所示。

在L-甘氨酸浓度为0～1000ppm(每升培养基中L-甘氨酸为0～1000mg)范围内时，其诱导培养后的罗伦隐球酵母与普通培养的罗伦隐球酵母(即NYDB组)相比，无论发病率还是病斑直径均无显著性差异。由此说明，L-甘氨酸不能提高罗伦隐球酵母的生防效果。

综上所述，经过L-脯氨酸培养后的罗伦隐球酵母对果实青霉病的生防效果显著性提高。而几丁质、DL-脯氨酸、D-脯氨酸、L-甘氨酸培养后的罗伦隐球酵母和普通罗伦隐球酵母对梨果实的生防效果均不如L-脯氨酸培养后的效果。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.提高生防酵母对果实病害防治效力的培养基，其特征在于：包括活化培养基和种子培养基；

活化培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、琼脂20g、L-脯氨酸0～1000mg，加水定容至1000mL，灭菌后得NYDA活化培养基；

种子培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、L-脯氨酸0～1000mg，加水定容至1000mL，灭菌后得NYDB种子培养基。

2.利用权利要求1所述培养基进行的诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的制剂，其特征在于，包括以下步骤：

1)、活化：

①、生防酵母在NYDA活化培养基中25±2℃培养48±4h，然后在相同条件下重复传代培养2次；

②、将重复传代培养2次所得的生防酵母用接种环接入到NYDB种子培养基中，于200±20rpm、28±2℃的条件下培养24±2h；然后在上述相同条件下重复培养1次；

2)、液体培养：

将步骤1)所得的活化酵母以体积计1/4-1/6的接种量接到NYDB种子培养基中，于200±20rpm、28±2℃的条件下培养24±2h；

3)、离心分离：

将步骤2)液体培养后的所得物在3000±100g离心10±1min，并用灭菌蒸馏水洗三次；用无菌蒸馏水调节酵母细胞浓度为1×10⁷cell/mL得到制剂。

3.根据权利要求2所述诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的制剂，其特征在于：

生防酵母采用保藏编号为CGMCC NO.3590的罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10。

4.利用如权利要求2或3所述制剂的诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的方法：

将制剂接种于果实的伤口处，使其完全覆盖果实伤口，待果实伤口处制剂自然风干后，将该果实放入容器中于密封状态下保存。

5.根据权利要求4所述诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的方法：

所述果实为梨果实。