CN107964557B - 一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法 - Google Patents
一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107964557B CN107964557B CN201810046083.6A CN201810046083A CN107964557B CN 107964557 B CN107964557 B CN 107964557B CN 201810046083 A CN201810046083 A CN 201810046083A CN 107964557 B CN107964557 B CN 107964557B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- lipopeptide
- bacillus
- yield
- fatty acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 51
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims abstract description 12
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims abstract description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 6
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 claims abstract description 5
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- KEMQGTRYUADPNZ-UHFFFAOYSA-N heptadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O KEMQGTRYUADPNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 108010082754 iturin A Proteins 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims description 4
- XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetic acid;hydrate Chemical compound [OH3+].[O-]C(=O)C(F)(F)F XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- UHNSRFWQBVXBSK-UHFFFAOYSA-N methanol;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound OC.OC(=O)C(F)(F)F UHNSRFWQBVXBSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000013535 sea water Substances 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- NJGWOFRZMQRKHT-WGVNQGGSSA-N surfactin C Chemical compound CC(C)CCCCCCCCC[C@@H]1CC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O1 NJGWOFRZMQRKHT-WGVNQGGSSA-N 0.000 description 21
- AFWTZXXDGQBIKW-UHFFFAOYSA-N C14 surfactin Natural products CCCCCCCCCCCC1CC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)O1 AFWTZXXDGQBIKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- NJGWOFRZMQRKHT-UHFFFAOYSA-N surfactin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC1CC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)O1 NJGWOFRZMQRKHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 244000197813 Camelina sativa Species 0.000 description 8
- 235000014595 Camelina sativa Nutrition 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000813090 Rhizoctonia solani Species 0.000 description 2
- 108010019477 S-adenosyl-L-methionine-dependent N-methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 108010002015 fengycin Proteins 0.000 description 2
- CUOJDWBMJMRDHN-VIHUIGFUSA-N fengycin Chemical compound C([C@@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)OC2=CC=C(C=C2)C[C@@H](C(N[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1)[C@@H](C)O)=O)NC(=O)[C@@H](CCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 CUOJDWBMJMRDHN-VIHUIGFUSA-N 0.000 description 2
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010000785 non-ribosomal peptide synthase Proteins 0.000 description 2
- ISYWECDDZWTKFF-UHFFFAOYSA-N nonadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O ISYWECDDZWTKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000266342 Alternaria longissima Species 0.000 description 1
- 241000079253 Byssochlamys spectabilis Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- 240000008790 Musa x paradisiaca Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 241000179039 Paenibacillus Species 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000221696 Sclerotinia sclerotiorum Species 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- -1 agriculture Substances 0.000 description 1
- 150000001334 alicyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003876 biosurfactant Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 150000001923 cyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- YAQXGBBDJYBXKL-UHFFFAOYSA-N iron(2+);1,10-phenanthroline;dicyanide Chemical compound [Fe+2].N#[C-].N#[C-].C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1.C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 YAQXGBBDJYBXKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M sodium bicarbonate Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Abstract
一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法，涉及发酵技术领域。利用芽孢杆菌(Bacillus sp.)Pc3在LB液体培养基发酵，在发酵过程中添加脂肪酸；将抗菌脂肽分离，所述分离的方法为：发酵液离心，除去菌体，收集发酵上清；用盐酸调节发酵上清pH值至2.0进行酸沉淀，4℃过夜后再离心，收集沉淀；沉淀物冷冻干燥后利用甲醇浸提，对甲醇浸提物减压浓缩获得脂肽粗提物；然后对脂肽粗提物分离，收集色谱峰，再分离活性峰，收集色谱峰，进行质谱鉴定；经质谱鉴定。与现有其他提高脂肽产量的发酵技术相比，在发酵过程中添加少量的脂肪酸，可以显著提高脂肽的产量，且方法简单，适用于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，尤其是涉及一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法。
背景技术
脂肽(lipopeptides)是一类由疏水性脂肪酸链和亲水性氨基酸链两部分组成的线性或环形的化合物。细菌来源的脂肽主要由芽孢杆菌属及类芽孢杆菌属的菌株通过非核糖体肽合成酶(NRPSs)催化合成。在生物防治的背景下，根据合成基因簇和化学结构的差异将芽孢杆菌属来源的脂肽主要分为三个家族：伊枯草菌素、芬荠菌素和表面活性菌素。伊枯草菌素由环七肽(氨基酸顺序LDDLLDL)和β-氨基脂肪酸组成，具有抗真菌活性和较强的溶血活性，但对细菌和病毒的抑制活性较弱。芬荠菌素由10个氨基酸的多肽链通过酯键与β-羟基脂肪酸构成内脂环化合物，相比伊枯草菌素具有较弱溶血性，表现强烈的抗真菌活性和弱的抗细菌和抗病毒活性。表面活性菌素由环七肽(LLDLLDL)和β-羟基脂肪酸构成，是一种优异的生物表面活性剂，具有多种生物活性如抗细菌、抗病毒、抗肿瘤、抗支原体和较弱的抗真菌活性。脂肽化合物具有的多种活性，使其在医药、化妆品、农业、石油开采等领域具备重要的应用前景。
发酵过程中，菌体合成脂肽化合物的过程受到周围环境条件影响，因此发酵条件的差异，发酵获得的脂肽化合物的组成及含量差异显著。钱世全等人以枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株，利用菊粉作为碳源，在优化后的Landy培养基和发酵条件下，脂肽化合物bacillomycin D的产量达到1227.49mg/L。金虎等人利用两步添加葡萄糖的发酵策略，可提高枯草芽孢杆菌伊枯草菌素A的产量2倍。陆兆新等以枯草芽孢杆菌fmb-60作为出发菌株，研究果糖对芬荠菌素产量的影响，优化条件后相比对照组，芬荠菌素的产量提高了76％。以上研究虽提高了脂肽化合物的产量，但一般仅为一种脂肽化合物且较少考虑生成脂肽同系物的组成变化及其对抑菌活性的影响。
本申请人在申请号为201310637219.8的中国发明专利申请中提供了用于本发明提高芽孢杆菌脂肽产量的发酵方法的芽孢杆菌(Bacillus sp.)Pc3，该菌株分离自南极海水，并已于2013年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2013470。该菌株对多种植物病原真菌具有良好抑制活性，防治的植物致病真菌包括：香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌和镰刀菌等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法。
本发明包括以下步骤：
1)利用芽孢杆菌(Bacillus sp.)Pc3在LB液体培养基发酵，在发酵过程中添加脂肪酸；
在步骤1)中，所述LB液体培养基的配方可为：酵母粉1％，蛋白胨0.5％，氯化钠1％，pH为7.0～7.2；所述发酵的条件可为：发酵温度为28℃，摇床转速为180r/min，发酵时间为96min；所述脂肪酸可选自十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、十九烷酸等中的一种，脂肪酸的质量与体积浓度可为0.01～0.5g/L，所述添加的时间为起始发酵24～48min。
2)将抗菌脂肽分离，所述分离的方法为：发酵液离心，除去菌体，收集发酵上清；用盐酸调节发酵上清pH值至2.0进行酸沉淀，4℃过夜后再离心，收集沉淀；沉淀物冷冻干燥后利用甲醇浸提，对甲醇浸提物减压浓缩获得脂肽粗提物；然后对脂肽粗提物分离，收集色谱峰，再分离活性峰，收集色谱峰，进行质谱鉴定；
在步骤2)中，所述发酵液离心可在室温条件下，发酵液8500r/min离心10min；所述4℃过夜后再离心可采用9500r/min离心15min；所述浸提可浸提三次；所述对脂肽粗提物分离可利用GE
prime plus蛋白分离纯化系统：HiprepTM 16/60Sephacryl TM S-100HR预装柱对脂肽粗提物分离；所述再分离活性峰，收集色谱峰，可利用反相高压液相色谱进一步分离活性峰，高效液相色谱法条件如下：仪器：安捷伦1260HPLC，InertSustainC18column，5μm,4.6×250mm，流动相包括A液和B液，所述A液为0.1％三氟乙酸水溶液，所述B液为0.1％三氟乙酸甲醇溶液，洗脱程序：0～3min，70％B～75％B；3～8min，75％B～85％B；8～30min，85％B～95％B；30～40min，95％B；流速：0.8mL/min，检测波长：220nm；所述质谱鉴定可利用MALDI-TOF-MS进行质谱鉴定。
3)经质谱鉴定。
在步骤3)中，所述质谱鉴定的具体方法可为：抗菌脂肽包含4种同系物的伊枯草菌素A(C14～17)、4种同系物的芬荠菌素B(C14～C17)和3种同系物的表面活性菌素(C14～16)；在培养过程中添加终浓度为0.01～0.5g/L的十四-十九烷酸中的一种，可提高伊枯草菌素A的产量0.2～1.3倍，其中伊枯草菌素A(C14)的产量提高0.2～3.3倍，伊枯草菌素A(C15)的产量提高0.17～1.0倍，伊枯草菌素A(C16)的产量提高0～1.29倍，伊枯草菌素A(C17)的产量提高0.39～4.0倍；同时提高芬荠菌素B的产量0.16～3.0倍，其中芬荠菌素B(C14)的产量提高0～1.57倍，芬荠菌素B(C15)的产量提高0-4.0倍，芬荠菌素B(C16)的产量提高0～2.5倍，芬荠菌素B(C17)的产量提高0.15～4.76倍；同时提高表面活性菌素的产量0～1.0倍，其中同系物表面活性菌素(C14)的产量提高0.2～1.7倍，同系物表面活性菌素(C15)的产量提高0～1.83倍，同系物表面活性菌素(C16)的产量提高0～0.8倍。
与现有其他提高脂肽产量的发酵技术相比，本发明在发酵过程中添加少量的脂肪酸，可以显著提高脂肽的产量，且方法简单，适用于规模化生产。
附图说明
图1为高效液相色谱分离脂肽同系物色谱峰。
图2为添加十七烷酸提高芽孢杆菌Pc3合成脂肽产量。
图3为添加十七烷酸对芽孢杆菌Pc3合成伊枯草菌素A各同系物的影响。
图4为添加十七烷酸对芽孢杆菌Pc3合成芬荠菌素B各同系物的影响。
图5为添加十七烷酸对芽孢杆菌Pc3合成表面活性菌素各同系物的影响。
具体实施方式
下面将结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但本发明不局限于此。
实施例1、芽孢杆菌Pc3脂肽化合物的分离纯化及鉴定
将芽孢杆菌Pc3接种到5mLLB液体试管中，28℃，180r/min培养过夜，后按1％接种量接种到LB培养基中发酵，28℃，180r/min培养96min。LB培养基配方如下：酵母粉1％，蛋白胨0.5％，氯化钠1％，pH为7.0～7.2左右。发酵结束后，发酵液在常温下8500r/min离心10min去除菌体收集发酵上清液，利用6M的盐酸调节上清的pH至2.0，4℃过夜沉淀，在4℃条件下9500r/min离心15min收集酸沉淀，对酸沉淀冷冻干燥，甲醇浸提酸沉淀三次，合并浸提物，使用旋转蒸发仪浓缩甲醇浸提物获得粗提物。使用1g/L的NaHCO3水溶液溶解粗提物，检验抑制立枯丝核菌的活性；以1g/L的NaHCO3水溶液为流动相，采用HiprepTM 16/60Sephacryl TM S-100HR进一步分离，收集各组分减压旋转蒸发浓缩，并检验活性。对活性组分进行小分子蛋白凝胶电泳分析其大小。对大小在2kD且有抑菌活性的组分，进一步采用RP-HPLC分离纯化。RP-HPLC条件：流动相A：0.1％TFA水，流动相B：0.1％TFA甲醇；InertSustain C18柱(5μm,4.6×250mm)；检测波长220nm；洗脱体系：0～3min，70％B～75％B；3～8min，75％B～85％B；8～30min，85％B～95％B；30～40min，95％B。对收集到的18个色谱峰(图1)利用MALDI-TOF-MS质谱鉴定。确定到11个脂肽化合物(各色谱峰对应脂肽化合物的MALDI-TOF-MS质谱数据参见表1)，分别为：氨基酸骨架为Asn-Tyr-Asn-Gln-Pro-Asn-Ser的伊枯草菌素A(C14～17)，氨基酸骨架为Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Val-Pro-Glu-Tyr-Ile的芬荠菌素B(C14～17)，以及氨基酸骨架为Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu的表面活性菌素(C14～16)。
表1
实施例2、添加十七烷酸可提高芽孢杆菌Pc3发酵生产脂肽的产量
芽孢杆菌Pc3菌株接种到LB液体培养基，在28℃、180r/min条件下培养36min后在培养基中添加十七烷酸，终浓度为0.01g/L，继续培养60min。发酵结束后经离心除菌体，盐酸酸化上清液，离心收集酸沉淀，冷冻干燥，甲醇浸提和旋转蒸发获取脂肽粗提物，利用RP-HPLC分析脂肽含量的变化。RP-HPLC分析结果表明添加十七烷酸提高伊枯草菌素A的产量1.1倍，其中对伊枯草菌素A(C14)提高3.3倍，伊枯草菌素A(C15)提高0.85倍，伊枯草菌素A(C17)提高约1.33倍(图2、3)；添加十七烷酸提高芬荠菌素B的合成2.6倍，其中芬荠菌素B(C14)提高0.41倍，芬荠菌素B(C15)提高3.51倍，芬荠菌素B(C16)提高2.46倍，芬荠菌素B(C17)提高3.39倍(图2、4)；添加十七烷酸提高表面活性菌素的合成1.0倍，其中表面活性菌素(C14)提高约1.70倍，表面活性菌素(C15)提高约1.83倍，表面活性菌素(C16)提高约0.8倍(图2、5)。
Claims (6)
1.一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法，其特征在于包括以下步骤：
1)利用芽孢杆菌(Bacillus sp.)Pc3在LB液体培养基发酵，在发酵过程中添加脂肪酸；所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)Pc3分离自南极海水，已于2013年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2013470；所述LB液体培养基的配方为：酵母粉1％，蛋白胨0.5％，氯化钠1％，pH为7.0～7.2；所述脂肪酸为十七烷酸，所述脂肪酸的质量与体积浓度为0.01g/L；所述添加的时间为起始发酵36min；
2)将抗菌脂肽分离，所述分离的方法为：发酵液离心，除去菌体，收集发酵上清；用盐酸调节发酵上清pH值至2.0进行酸沉淀，4℃过夜后再离心，收集沉淀；沉淀物冷冻干燥后利用甲醇浸提，对甲醇浸提物减压浓缩获得脂肽粗提物；然后对脂肽粗提物分离，收集色谱峰，再分离活性峰，收集色谱峰，进行质谱鉴定；
3)经质谱鉴定。
2.如权利要求1所述一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法，其特征在于在步骤1)中，所述发酵的条件为：发酵温度为28℃，摇床转速为180r/min，发酵时间为96min。
3.如权利要求1所述一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法，其特征在于在步骤2)中，所述发酵液离心是在室温条件下，发酵液8500r/min离心10min；所述4℃过夜后再离心采用9500r/min离心15min；所述浸提是浸提3次。
4.如权利要求1所述一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法，其特征在于在步骤2)中，所述对脂肽粗提物分离利用GE
prime plus蛋白分离纯化系统：HiprepTM 16/60Sephacryl TM S-100HR预装柱对脂肽粗提物分离。
5.如权利要求1所述一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法，其特征在于在步骤2)中，所述再分离活性峰，收集色谱峰，利用反相高压液相色谱进一步分离活性峰，高效液相色谱法条件如下：仪器：安捷伦1260HPLC，InertSustainC18 column，5μm,4.6×250mm，流动相包括A液和B液，所述A液为0.1％三氟乙酸水溶液，所述B液为0.1％三氟乙酸甲醇溶液，洗脱程序：0～3min，70％B～75％B；3～8min，75％B～85％B；8～30min，85％B～95％B；30～40min，95％B；流速：0.8mL/min，检测波长：220nm；所述质谱鉴定利用MALDI-TOF-MS进行质谱鉴定。
6.如权利要求1所述一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法，其特征在于在步骤3)中，所述质谱鉴定的结果为：抗菌脂肽包含4种脂肪酸链长为C14～17的伊枯草菌素A的同系物、4种脂肪酸链长为C14～C17的芬荠菌素B的同系物和3种脂肪酸链长为C14～16的表面活性菌素的同系物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810046083.6A CN107964557B (zh) | 2018-01-17 | 2018-01-17 | 一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810046083.6A CN107964557B (zh) | 2018-01-17 | 2018-01-17 | 一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107964557A CN107964557A (zh) | 2018-04-27 |
| CN107964557B true CN107964557B (zh) | 2020-11-20 |
Family
ID=61993512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810046083.6A Expired - Fee Related CN107964557B (zh) | 2018-01-17 | 2018-01-17 | 一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107964557B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111713607B (zh) * | 2020-04-22 | 2023-09-22 | 南京益纤生物科技有限公司 | 一种基于芽孢杆菌固态发酵制备的含抗菌肽饲料及其制备工艺和发酵菌株 |
| CN113480623B (zh) * | 2021-08-09 | 2022-12-27 | 广州天赐高新材料股份有限公司 | 一种脂肽组合物及其制备方法和应用 |
| CN114806935A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-07-29 | 上海国龙生物科技有限公司 | 地衣芽孢杆菌培养基及其应用 |
| CN114854810B (zh) * | 2022-06-17 | 2024-01-26 | 南京农业大学 | 一种通过脂肪酸代谢调控提高抗菌脂肽bacillomycin D产量的方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1051200A (zh) * | 1984-10-09 | 1991-05-08 | 伊莱利利公司 | 制备抗菌素a-21978c复合物或因子的方法 |
| US20090269832A1 (en) * | 2007-11-05 | 2009-10-29 | Modular Genetics, Inc. | Growth of Microorganisms in Media Containing Crude Glycerol |
| CN101851654A (zh) * | 2009-04-03 | 2010-10-06 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种分离纯化抗真菌脂肽的方法 |
| CN102851242B (zh) * | 2012-09-07 | 2014-04-09 | 南京工业大学 | 枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用 |
| CN103589674B (zh) * | 2013-12-02 | 2015-07-01 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 枯草芽孢杆菌Pc3及其在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用 |
| WO2016131801A1 (en) * | 2015-02-19 | 2016-08-25 | Evonik Degussa Gmbh | Rhamnolipid synthesis |
| CN104725477B (zh) * | 2015-03-31 | 2019-07-23 | 南京农业大学 | 一种新型抗菌脂肽[△Leu3]Surfactin、制备方法及应用 |
| CN105754917B (zh) * | 2016-01-07 | 2019-07-30 | 南京农业大学 | 一种Plipastatin衍生环五脂肽及其产生菌和应用 |
| CN105567769B (zh) * | 2016-01-26 | 2019-02-05 | 湖北工业大学 | 一种可发酵产抗菌肽的枯草芽孢杆菌用增效剂及其使用方法 |
| CN106884031B (zh) * | 2017-04-25 | 2020-12-11 | 江苏省农业科学院 | 对枯草芽孢杆菌t-500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法 |
| CN111732643B (zh) * | 2017-04-26 | 2022-07-19 | 中国科学院海洋研究所 | 一种脂肽分子及其应用 |
-
2018
- 2018-01-17 CN CN201810046083.6A patent/CN107964557B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107964557A (zh) | 2018-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107964557B (zh) | 一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法 | |
| Nanjundan et al. | Antimicrobial activity and spectroscopic characterization of surfactin class of lipopeptides from Bacillus amyloliquefaciens SR1 | |
| CN104513300A (zh) | 一株生防枯草芽胞杆菌表面活性素的分离纯化方法 | |
| Menegatti et al. | Paenibacillus polymyxa associated with the stingless bee Melipona scutellaris produces antimicrobial compounds against entomopathogens | |
| CN111019866B (zh) | 一种普洱茶树叶片内生芽孢杆菌及其应用 | |
| CN103497980A (zh) | 尼日利亚菌素的制备方法 | |
| CN105331562B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌q-426及其脂肽的分离方法 | |
| CN110172415B (zh) | 一种北极拟诺卡氏菌及其发酵产物优化方法 | |
| CN102994418A (zh) | 一株产表面活性素和伊枯草菌素a类化合物的甲基营养型芽孢杆菌及其应用 | |
| CN109053638B (zh) | 一种烟曲霉素的提取纯化方法 | |
| CN112079899B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽的分离方法 | |
| CN110885359B (zh) | 一种嗜酸乳杆菌产细菌素及其分离纯化方法 | |
| CN105713069B (zh) | 一种溶杆菌素的纯化方法 | |
| CN114982763A (zh) | 格尔德霉素及其类似物的新用途 | |
| US9624266B2 (en) | Brachiatin D and process for production thereof | |
| CN107021996B (zh) | 一种短肽、其应用以及由其得到的抗菌组合物 | |
| CN103524600B (zh) | 新环脂肽抗生素罗克霉素（locillomycin）A、B、C及其制造方法 | |
| CN109251145B (zh) | 一种邻苯二甲酸酯及其制备方法、菌株与应用 | |
| CN110343639B (zh) | 一株产15(s)-o-乙基雷帕霉素的链霉菌 | |
| CN114009452B (zh) | 交链格孢jtf001的发酵液在抑制瓜列当种子萌发中的应用 | |
| CN113004357B (zh) | 具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷a及制备方法 | |
| CN115043719B (zh) | 一种真菌来源的聚酮类化合物及其制备方法与应用 | |
| RU2801749C1 (ru) | Новый штамм-продуцент ванкомицина amycolatopsis keratiniphila | |
| CN114164132B (zh) | 一种无色杆菌及其应用与制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的方法 | |
| CN104098660A (zh) | 一株生防枯草芽胞杆菌泛革素的分离纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 361005 Fujian Province University of Siming District of Xiamen City Road No. 178 Applicant after: THIRD INSTITUTE OF OCEANOGRAPHY, MINISTRY OF NATURAL RESOURCES Address before: 361005 Fujian Province University of Siming District of Xiamen City Road No. 178 Applicant before: Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20201120 |