CN102851242B - 枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用 - Google Patents
枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102851242B CN102851242B CN201210327994.9A CN201210327994A CN102851242B CN 102851242 B CN102851242 B CN 102851242B CN 201210327994 A CN201210327994 A CN 201210327994A CN 102851242 B CN102851242 B CN 102851242B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- subtilis
- bacillus subtilis
- hours
- inoculated
- seed culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title claims abstract description 19
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims abstract description 19
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title abstract 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 16
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 14
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 14
- 239000003876 biosurfactant Substances 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 5
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 24
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 239000003350 kerosene Substances 0.000 description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 8
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 8
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- JBTHDAVBDKKSRW-UHFFFAOYSA-N chembl1552233 Chemical compound CC1=CC(C)=CC=C1N=NC1=C(O)C=CC2=CC=CC=C12 JBTHDAVBDKKSRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 229940073450 sudan red Drugs 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 4
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L Malonate Chemical compound [O-]C(=O)CC([O-])=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 3
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000726221 Gemma Species 0.000 description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 150000002475 indoles Chemical class 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N keto-phenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=CC=C1 BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 lipopeptid class Chemical class 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000009671 shengli Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- NEPWWHQLHRGVQL-UHFFFAOYSA-N 1-n,4-n-dimethylbenzene-1,4-diamine;hydron;chloride Chemical compound Cl.CNC1=CC=C(NC)C=C1 NEPWWHQLHRGVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001903 2-oxo-3-phenylpropanoic acid Substances 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical class O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- DYUQAZSOFZSPHD-UHFFFAOYSA-N Phenylpropyl alcohol Natural products CCC(O)C1=CC=CC=C1 DYUQAZSOFZSPHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxycinnamic acid Natural products OC(=O)C(O)=CC1=CC=CC=C1 DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- HCPOCMMGKBZWSJ-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-hydrazinyl-3-oxopropanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(=O)NN HCPOCMMGKBZWSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009969 flowable effect Effects 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用。本发明的菌株分类命名为枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723，保藏号为CCTCCNO：M2012285。枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723具有产量高、发酵周期短的优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一株枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用。
背景技术
生物表面活性剂是由微生物产生的天然表面活性化合物。生物表面活性剂与化学合成表面活性剂性能相似，具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等功能。但相比之下，生物表面活性剂还有其自身的许多优势：可生物降解，不会造成再污染；无毒或低毒；一般不致敏、可消化，因此可用于化妆品和食品的添加剂；可以从工业废物中生产，用于生物环境治理；具有更好的环境相容性，更高的起泡性，在极端温度、PH、盐浓度下的更好选择性和专一性；结构多样，有可能适用于特殊领域。
生物表面活性剂主要分为糖脂类，脂肽类，脂肪酸，磷脂，多聚表面活性剂等。目前，脂肽类表面活性剂的产量比较低，国内外脂肽类表面活性剂通过批次发酵的产量均低于5g/L。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可以产生生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌。
为了实现本发明的技术目的，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌, 其分类命名为枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723, 其保藏编号为：CCTCC NO：M 2012285。
本发明还提供了枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723的培养方法，所述培养方法包括：将所述枯草芽孢杆菌接种于活化培养基中培养以得到种子培养液；和将所述种子培养液接种于发酵培养基中以得到脂肽类表面活性剂。
进一步地，所述培养方法包括：将经斜面培养12小时-24小时的所述枯草芽孢杆菌接种于活化培养基中，并在30摄氏度-37摄氏度的条件下培养12小时-24小时以得到所述种子培养液；和将所述种子培养液按照2%-4%的接种量接种于所述发酵培养基中，并在30摄氏度-37摄氏度的条件下培养24小时-48小时以得到脂肽类表面活性剂。
所述发酵培养基配方为：葡萄糖15-25g/L，油15-25g/L,尿素3-5g/L,硫酸铵3-5g/L，磷酸二氢钾3g/L，无机离子0.01g/L。
所述油包括食用油、甘油、石蜡、煤油和正己烷中的一种或多种。
所述食用油为豆油。
本发明还提供了枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723在发酵生产脂肽类表面活性剂中的应用。
本发明的有益效果在于：
枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723的发酵液CMC值仅为25mg/L,远远低于一般化学表面活性剂的CMC值。枯草芽孢杆菌723发酵24h后脂肽类表面活性剂的产量即可以达到15g/L。因此，枯草芽孢杆菌723具有产量高、发酵周期短的优点。枯草芽孢杆菌723可以利用食用油、甘油、石蜡、煤油、正己烷、废弃油来生产生物表面活性剂，因此不但可以应用于石油开采工业，而且可以用来分解环境中的废弃油以避免污染，具有多种功效。
本发明的生物材料枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723的保藏日期为2012年7月13日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO: M 2012285。
具体实施方式
本发明的生物材料枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723的保藏日期为2012年7月13日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO: M 2012285。
本发明的枯草芽孢杆菌723为高产脂肽类表面活性剂的菌株。本发明的枯草芽孢杆菌723具有如下生理学特征：
1、菌株的形态特征：菌株是革兰氏染色阳性杆菌，形成芽孢，芽孢较大，圆柱形，居中。半固体穿刺运动，有鞭毛，无荚膜。平板生长茁落形状不规则，边缘不整齐，菌落表面皱褶、粗糙、较干燥等，是典型的芽孢杆菌菌落特征。
2、菌株的生理生化特征：对接触酶，可溶性淀粉水解，V-P，柠檬酸盐利用，丙二酸盐利用，葡萄糖，反硝化试验呈阳性反应。对氧化酶，吲哚，苯丙氨酸脱氨酶呈阴性反应。可以在55℃的高温下下生长。该菌在最佳条件下发酵表面张力可以由72mN/m降至26mN/m，临界胶束浓度（CMC）值为25mg/L，远远低于一般的化学表面活性剂的CMC值。在24小时发酵产物的产量最高，达到15g/L。
本发明的枯草芽孢杆菌723可以利用下述的筛选方法进行筛选，所述筛选方法可以包括如下步骤:
其中，步骤（2）中所用的富集培养基组成为：葡糖糖10-20g/L，酵母粉3-5g/L，蛋白胨3-5g/L，七水合硫酸镁2-4g/L。
步骤（3）中所用的血平板的配方为：酵母粉5-10g/L，蛋白胨10-12g/L,氯化钠10-12g/L，脱纤维除菌绵羊血8%，琼脂2%。
步骤（4）中所用的排油圈试验的具体步骤是：取直径为9cm的培养皿，加入20mL的蒸馏水，在水中央加入200μL的用苏丹红
染色的煤油形成一薄层油膜，在煤油中间慢慢加入一滴发酵上清液，测定排油圈的直径。煤油是经过苏丹红染色的，煤油：苏丹红
的比例是200:1。
步骤（4）中所用的乳化值测定的具体步骤是：取一个刻度试管，加入5mL发酵上清液和5mL煤油，在高速下振荡2min，然后在室温下静置24h，测定乳化值。乳化值=乳化层的高度/总高度×100%。
步骤（4）中所用的表面张力的测定的具体方法是：取20mL左右的发酵上清液于小烧杯中，用BZY-3B表面张力仪测定表面张力。
本发明还提供了枯草芽孢杆菌723的培养方法：将枯草芽孢杆菌723接种于活化培养基中培养以得到种子培养液，然后将种子培养液接种于发酵培养基中以得到脂肽类表面活性剂。
具体地，挑一环经斜面培养12-24h的枯草芽孢杆菌723接种于活化培养基中，30-37℃，100-200rpm下培养12-24h以得到种子培养液。然后按2%-4%的接种量将种子培养液接种于发酵培养基中，30-37℃，100-200rpm下培养24-48h以得到脂肽类表面活性剂。
本发明的有益效果在于：
枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723的CMC值仅为25mg/L,远远低于一般化学表面活性剂的CMC值。枯草芽孢杆菌723发酵24h后生物表面活性剂的产量即可以达到15g/L。因此，枯草芽孢杆菌723具有产量高、发酵周期短的优点。枯草芽孢杆菌723可以利用食用油、甘油、石蜡、煤油、正己烷、废弃油来生产生物表面活性剂，因此不但可以应用于石油开采工业，而且可以用来分解环境中的废弃油以避免污染，具有多种功效。
实施例1：菌株筛选
初筛：
取1g胜利油田的土样放入50mL的生理盐水中，在30-37℃,100-200rpm条件下振荡3-5h。静置10-20min,取上清液2-4mL放入50mL富集培养基中，30-37℃,100-200rpm下培养12-24h。将获得的富集培养液2-3mL，梯度稀释成10-5-10-9，涂布于血平板，30-37℃下培养12-24h。选择溶血圈大的菌株进行复筛。
复筛：
1）排油圈筛选：取直径为9cm的培养皿，加入20mL的蒸馏水，在水中央加入200μL的用苏丹红
染色的煤油形成一薄层油膜，在煤油中间慢慢加入一滴发酵上清液，测定排油圈的直径。煤油是经过苏丹红
染色的，煤油：苏丹红
的比例是200:1。
2）乳化值筛选：选择排油圈大于4cm的菌株进行乳化值筛选，取一个刻度试管，加入5mL发酵上清液和5mL煤油，在高速下振荡2min，然后在室温下静置24h，测定乳化值。乳化值=乳化层的高度/总高度×100%。
3）表面张力的测定：挑乳化值最大的几株菌株进行表面张力的测定，取20mL左右的发酵上清液于小烧杯中，用BZY-3B表面张力仪测定表面张力。表面张力最小的菌株就是我们需要的菌株。
实施例2：菌株的生理生化试验
1）接触酶实验：将培养24h的斜面菌种以铂丝接种环取一小环涂抹在已滴有3-10%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。
2）氧化酶实验：滤纸用1%盐酸二甲基对苯二胺溶液浸湿，在室内悬挂风干后，剪裁成适当大小并在有橡皮塞的试管中密封保存，使用前用白金丝接种环将菌苔抹在滤纸上，10s内出现红色的为氧化酶阳性。
3）淀粉水解：在肉汤中加0.2%可溶性淀粉，分装三角瓶，121℃蒸汽灭菌20min，倒平板备用。取新鲜斜面培养物点种于平板，适温培养2-5d，形成明显菌落后，在平板上滴加碘液，平板呈蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈表示淀粉水解阳性，仍是蓝黑色为阴性。
4）柠檬酸盐利用：柠檬酸盐培养基斜面上划线接种，适温培养3-7d。培养基为碱性(指示剂蓝色或桃红色)者为阳性，否则为阴性。
5）丙二酸盐利用：丙二酸盐培养基分装试管，121℃灭菌20min，同时制作不加丙二酸的空白对照。用幼龄菌种接种，适温培养1-2d，培养基由绿色变为蓝色为阳性;培养基颜色不变者为阴性。
6）明胶液化：取培养18-24h的斜面培养物穿刺接种明胶液化培养基，同时有两支未接种的空白对照。20℃温箱中培养2、7、10、14和30d。结果观察：在20℃以下的室温观察生长情况和明胶液化情况，如有菌生长，明胶表面无凹陷且为稳定的凝块，则为明胶水解阴性。如明胶凝块部分或者全部在20℃以下变为可流动的液体，则为明胶水解阳性。
7）V-P测定：接种实验菌于V-P培养液中，每次两个重复，置适温培养2-6d(如为阴性可适当延长培养时间)。操作与结果观察：取培养液和40%氢氧化钠等量混合。加少许肌酸，10min后如培养基出现红色，即为实验阳性反应(有时要放置更长时间才出现红色反应)。
8）丙氨基酸脱氨酶:适当的浓度接种，37℃培养4h或8-24h测定。结果与观察：将试剂4-5滴滴到生长菌的斜面上，当斜面上与冷凝水中产生绿色，则为阳性反应，即表明已形成了苯丙酮酸，不变则为阴性。
生理生化试验的结果如表1所示：
表 1
| 生理生化特征 | 菌株723 | 生理生化特征 | 菌株723 |
| 接触酶 | ＋ | 丙二酸盐利用 | ＋ |
| 氧化酶 | － | 明胶液化 | ＋ |
| 淀粉水解 | ＋ | V-P测定 | ＋ |
| 柠檬酸盐利用 | ＋ | 苯丙氨基酸脱氨酶 | － |
| 葡萄糖 | ＋ | 吲哚 | － |
注:“+”表示结果是阳性;“一”表示阴性结果。
实施例3：枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723对碳源的利用
枯草芽孢杆菌723可以利用各种油作为碳源来生产生物表面活性剂，主要有食用油、甘油、石蜡、煤油、正己烷、废弃油。选择培养基的其它组成为：酵母粉3g/L,蛋白胨3g/L,KH2PO4 2.7g/L,NaCL 5g/L。碳源的浓度为20g/L。250mL的锥形瓶的装样量为50mL,接种量为2%，培养条件为37℃,200rpm。结果见表2。
表2
| 编号 | 碳源 | 生物表面活性剂粗重（g/ L） |
| 1 | 豆油 | 14.83 |
| 2 | 甘油 | 13.44 |
| 3 | 煤油 | 3.08 |
| 4 | 正己烷 | 2.67 |
| 5 | 废弃石油 | 7.23 |
实施例4：枯草芽孢杆菌723发酵生产生物表面活性剂
将枯草芽孢杆菌723接种于LB培养基中，37℃,200rpm下培养12小时以得到种子培养液。将种子培养液按2%的接种量转接于发酵培养基中，37℃,200rpm下培养24h。不同的C/N比的发酵培养基的生物表面活性剂的产量如表3所示。
表 3
其中，LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L,NaCL 10g/L。
发酵培养基：葡萄糖15-25g/L，豆油15-25g/L,尿素3-5g/L,(NH4)2SO4 3-5g/L，KH2PO4 3g/L，无机离子 0.01g/L。
生物表面活性剂的提取：将发酵液8000rpm，4℃，离心10min。发酵上清液用6mol/L的盐酸调PH2.0，放在4℃的冰箱静置过夜。第二天8000rpm，4℃，离心10min，获得沉淀。将沉淀用氯仿：甲醇=2:1等体积萃取三次。有机相旋转蒸发，得到脂肽类表面活性剂粗品。
Claims (4)
1.一株枯草芽孢杆菌, 其分类命名为枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723, 其保藏编号为：CCTCC NO：M 2012285。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723的培养方法，其特征在于，包括：
将所述枯草芽孢杆菌接种于活化培养基中培养以得到种子培养液；和
将所述种子培养液接种于发酵培养基中以得到生物表面活性剂。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，包括：
将经斜面培养12小时-24小时的所述枯草芽孢杆菌接种于活化培养基中，并在30摄氏度-37摄氏度的条件下培养12小时-24小时以得到所述种子培养液；和
将所述种子培养液按照2%-4%的接种量接种于所述发酵培养基中，并在30摄氏度-37摄氏度的条件下培养24小时-48小时以得到脂肽类表面活性剂。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723在发酵生产脂肽类表面活性剂中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210327994.9A CN102851242B (zh) | 2012-09-07 | 2012-09-07 | 枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210327994.9A CN102851242B (zh) | 2012-09-07 | 2012-09-07 | 枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102851242A CN102851242A (zh) | 2013-01-02 |
| CN102851242B true CN102851242B (zh) | 2014-04-09 |
Family
ID=47398222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210327994.9A Expired - Fee Related CN102851242B (zh) | 2012-09-07 | 2012-09-07 | 枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102851242B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103865855B (zh) * | 2014-03-25 | 2017-03-29 | 南京工业大学 | 枯草芽孢杆菌菌株及其应用 |
| CN107964557B (zh) * | 2018-01-17 | 2020-11-20 | 自然资源部第三海洋研究所 | 一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法 |
| CN109628495B (zh) * | 2019-01-14 | 2022-12-09 | 华东理工大学 | 一种同时制备生物表面活性剂和乳化剂的发酵培养方法 |
| CN112980747A (zh) * | 2021-04-30 | 2021-06-18 | 南京理工大学 | 一株产脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌 |
-
2012
- 2012-09-07 CN CN201210327994.9A patent/CN102851242B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102851242A (zh) | 2013-01-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107629973A (zh) | 一株产β‑苯乙醇的库德里阿兹威毕赤酵母菌株及其应用 | |
| CN103789223A (zh) | 一种具有自生固氮、解磷解钾能力的醋酸钙不动杆菌及其应用 | |
| CN102851242B (zh) | 枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用 | |
| Makkar et al. | Isolation and characterization of Rhizobium from Chickpea (Cicer arietinum) | |
| CN105950495B (zh) | 一株甲基营养型芽胞杆菌及其在畜禽养殖废水处理中的应用 | |
| CN103484421B (zh) | 一种液体发酵中试生产粉红粘帚霉厚垣孢子的方法 | |
| CN105624240A (zh) | 一种春雷霉素发酵培养基及发酵方法 | |
| CN106399209A (zh) | 一种降解高油脂餐厨垃圾的复合菌剂及其制备方法 | |
| CN105255756A (zh) | 微生物除臭复合菌剂及其制备方法和应用 | |
| CN101898100B (zh) | 生物表面活性剂及其制备方法和应用 | |
| CN101148643A (zh) | 一种海参用海洋胶红酵母的生产方法 | |
| CN102827794A (zh) | 一株地中海假单胞菌及其应用 | |
| CN102816719B (zh) | 一种根际促生菌sxh-2及其应用 | |
| CN109456915A (zh) | 一种沙福芽孢杆菌株x3及其应用 | |
| CN113337420A (zh) | 一种复合固氮微生物菌剂及其制备方法与应用 | |
| CN101845401B (zh) | 一株胶红酵母菌及其在降解丁草胺中的应用 | |
| CN108504585A (zh) | 一种治理大气污染的苯降解菌及其制备方法和应用 | |
| CN102816720B (zh) | 一种产acc脱氨酶的粘质沙雷氏菌ljl-11及其应用 | |
| CN110511895A (zh) | 一株枯草芽孢杆菌sl-19及其菌剂的制备方法和应用 | |
| CN109735475A (zh) | 一株耐酸产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN106348887A (zh) | 海藻复合分级发酵制备氨基酸液体水溶肥的方法 | |
| CN105950483A (zh) | 一种光滑假丝酵母及其在餐厨垃圾中的应用 | |
| CN109609397A (zh) | 一种水产养殖用复合微生物菌剂及应用 | |
| CN105936879B (zh) | 枯草芽孢杆菌k13及其培养方法和应用 | |
| CN104195065B (zh) | 金橙ii降解菌l-15及其生产的菌剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140409 Termination date: 20160907 |