CN104195065B

CN104195065B - 金橙ii降解菌l-15及其生产的菌剂

Info

Publication number: CN104195065B
Application number: CN201410315204.4A
Authority: CN
Inventors: 刘秀艳; 焦亮; 郭军; 史晓亮
Original assignee: Hangzhou Dianzi University
Current assignee: Suzhou Xinlong Ecological Environment Co ltd
Priority date: 2014-07-03
Filing date: 2014-07-03
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2034-07-03
Also published as: CN104195065A

Abstract

本发明公开金橙II降解菌L-15及其生产的菌剂。金橙II降解菌L-15，其菌株是嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas？maltophilia，属于黄单胞菌目的黄单胞菌科，于2014年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC？NO.9289，主要生物学特性为菌落圆形不透明，为专性需氧的非发酵型革兰氏阴性极生多鞭毛杆菌,在血平板上有强的氨味,无溶血。降解菌L-15能使偶氮染料金橙II的残留量降低80﹪以上。菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合水及土壤的污染治理。

Description

金橙II降解菌L-15及其生产的菌剂

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及金橙II降解菌L-15及其生产的菌剂，是利用微生物的方法降解染料，适用于环境污染的治理。

背景技术

偶氮染料(偶氮基两端连接芳基的一类有机化合物)是纺织品服装在印染工艺中应用最广泛的一类合成染料，用于多种天然和合成纤维的染色和印花，也用于油漆、塑料、橡胶等的着色。在特殊条件下，它能分解产生20多种致癌芳香胺，经过活化作用改变人体的DNA结构引起病变和诱发癌症。

偶氮化合物共同的特征为分子中含有偶氮键“―N＝N―”。一般说来，偶氮化合物的分子中含有1―3个“―N＝N―”，键上连有苯或苯基，苯或苯基又连有―Cl、―NH2、―CH3、―SO3、―NO2及―OH等基团。

偶氮染料污染的主要特点是污染量大，虽然偶氮染料废水中残留的染料成分浓度很低，但是排入水体也可以造成水体的透光率降低，破坏水体生态系统。这些染料结构稳定，具有抗碱、抗酸、抗微生物、抗光等特性，可以较长时间地滞留在环境中，因此存在潜在的健康危害。在生产和使用染料的地方，地下水和地表水的重要污染物就是偶氮染料。在很多染料工业密集的地区，河流和地下水都面临着严重污染的危险。

偶氮染料对人体的健康也有严重危害。日木人Yoshida等在20世纪30年代发现，溶剂黄可以引起老鼠肝细胞癌变。此后，人们才开始意识到，在生产和使用过程中，偶氮染料及其中间体具有危险性。芳香胺作为偶氮染料中间体，已被一些国家列为可疑致癌物，其中β-萘胺和联苯胺已经被确认为是对人类最具烈性的致癌物。其中，偶氮基经常会与一个或多个芳香环系统相连，而形成共轭体系，从而作为染料的发色体。它几平分布于所有颜色。偶氮染料不仅仅可以用于纺织品的印染，还可以用来染纸张、皮革、食品等。应该指出的是，在一般情况下，偶氮染料自身本不会危害人体健康，但是部分偶氮染料是用芳香胺类中间体合成的，而芳香胺类中间体具有致癌性，当人体皮肤长时间与其接触后，通过人体正常的新陈代谢过程而释放出的物质就会与其结合，结合后会发生还原反应，该反应会导致偶氮基断裂，从而再次生成具有致癌性的芳香胺类的化合物，假如这些生成的化合物被人体重新吸收，在经过活化作用以后，人体的细胞就会在结构和功能方面发生改变，转变成为人体病变的诱因。这样的结果是，导致癌症的可能性。

偶氮染料金橙II产品可溶于水，偶氮染料金橙II对环境的污染，已严重危害着人类的健康其环境的综合治理，偶氮染料金橙II在环境中的降解菌的开发未见有比较成熟的技术。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种金橙II降解菌L-15。

本发明提供的金橙II降解菌L-15，其菌株是嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，属于黄单胞菌目的黄单胞菌科，于2014年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCCNO.9289，主要生物学特性为菌落圆形不透明，为专性需氧的非发酵型革兰氏阴性极生多鞭毛杆菌,在血平板上有强的氨味,无溶血；在营养琼脂上显示灰黄色素或无色素,菌落呈针尖状,直径0.5～1mm,中央突起；还原硝酸盐为亚硝酸盐,氧化酶阴性,强解脂性,水解明胶和七叶苷,赖氨酸脱羧酶阳性；在氧化发酵试验中,产酸缓慢或不显产酸,但分解麦芽糖。

本发明的另一个目的提供利用上述的金橙II降解菌L-15生产菌剂的方法，其工艺为：斜面种—摇瓶种子液—种子罐—产品(包装剂型为液体菌剂)。

该方法的具体步骤是：

步骤(1).将金橙II降解菌L-15的试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

步骤(2).将上述培养好的菌种按10﹪的接种量接种入500L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方及质量含量为：蛋白胨0.5﹪、酵母膏0.25﹪，用蒸馏水配制，pH为7.0；

步骤(3).将种子液按10﹪接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

步骤(4).在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6～1.2，搅拌速度为180～240r/min，培养温度为30℃，整个工艺流程培养时间为48～60h，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，该液体剂即为菌剂。

本发明的具体有益效果：

本发明的金橙II降解菌L-15菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合水及土壤的污染治理。本发明对于保护生态环境，保护人类身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。降解菌L-15能使偶氮染料金橙II的残留量降低80﹪以上。L-15菌株能以偶氮染料金橙II为碳源和能源进行生长，并可在短时间内偶氮染料金橙II降解。

附图说明

图1为接种量对L-15降解效率的影响；

图2为初始pH对L-15降解效率的影响；

图3为温度对L-15降解效率的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的分析。

金橙II降解菌，其菌株是嗜麦芽寡养单胞菌的菌株L-15，于2014年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号CGMCCNO.9289。

1.菌株的分离和鉴定

取污染土壤10g，置于100mL的无菌水中，振荡5min，得土壤菌悬液；取5mL的土壤菌悬液，加入到100mL的无机盐培养基[NH₄NO₃：407mg/L；KH₂PO₄：98mg/L；K₂HPO₄：33mg/L；NaCl：30mg/L；MgSO₄：200mg/L；pH7.0]中，添加金橙II作为碳源，置于30℃，150r/min摇床培养获得富集液，连续在添加金橙II的培养基平板上涂布，直到获得金橙II的降解菌株。该降解菌命名为L-15，进一步纯化并鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)。L-15菌株主要生物学特性菌落呈针尖状,直径0.5mm～1mm,中央突起。培养最适温度28～30℃，pH7.0。该菌属假单胞菌属。能以金橙II为碳源进行生长，最适生长温度为30℃。在实验室摇瓶培养条件下金橙II的降解率达82﹪以上。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

2.实验室生物降解实验

2.1接种量对L-15降解效率的影响

菌株L-15在LB培养基(LB培养基配方g/l：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl10g/l,pH7.0)中培养至对数期，按100ul、200ul、300ul、400ul、500ul的接种量分别接种到培养液[(无机盐培养基：NH₄NO₃：407mg/L；KH₂PO₄：98mg/L；K₂HPO₄：33mg/L；NaCl：30mg/L；MgSO₄：200mg/L；pH7.0)；金橙II：100mg/L，pH7.0]，置于30℃、150r/min摇床培养，在培养后24h分别测定培养液在600nm处的OD值。结果如图1所示，接种量越大，金橙II的降解效率就越高；当接种量大于200ul时在增大接种量对金橙II降解影响不大。虽然菌体的生长量随着接种量增加而提高，考虑到菌体生长情况以及经济的原因，采用100ul(1﹪v/v)的接种量即可达到要求。

2.2pH对L-15降解效率的影响

pH值是影响微生物生长和生存的另一个重要环境因素，微生物生长有一个适宜的pH值范围，超过适宜生长的pH值范围，大多数微生物都不能很好人的生长。

菌株L-15在LB培养基(LB培养基配方g/l：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl10g/l,pH7.0)中培养至对数期；按1﹪的接种量分别接种到六种不同pH的培养液，其中培养液[无机盐培养基(NH₄NO₃：407mg/L；KH₂PO₄：98mg/L；K₂HPO₄：33mg/L；NaCl：30mg/L；MgSO₄：200mg/L；pH7.0)；金橙II：100mg/L]pH值分别调至2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0；置于30℃、150r/min摇床培养，在培养后8h、16h、24h和32h分别测定培养液在600nm处的OD值。pH对菌株L-15生长的影响如图2所示。结果表明：L-15菌株生长的适宜pH值范围在6～10，最佳pH值为6～7。

2.3温度对L-15降解效率的影响

菌株L-15在LB培养基(LB培养基配方g/l：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl10g/l,pH7.0)中培养至对数期，按1﹪的接种量接种到培养液[无机盐培养基[NH₄NO₃：407mg/L；KH₂PO₄：98mg/L；K₂HPO₄：33mg/L；NaCl：30mg/L；MgSO₄：200mg/L；pH7.0]，分别置于18℃、28℃、30℃、33℃、37℃下培养，在培养后8h、16h和24h分别测定培养液在600nm处的OD值。温度对菌株L-15生长的影响如图3所示。结果表明：在实验的温度范围内，菌体均有不同程度的生长，温度为28～30℃时，生长最好，超过或低于该温度时，菌体生长速度减慢，而在37℃下培养时，菌种易老化。因此，L-15的最佳生长温度为28～30℃。

3.生产实施例

将金橙II降解菌L-15的试管种接种到发酵培养基中，振荡培养至对数期，准备接种种子罐；然后将上述培养好的菌种按10﹪的接种量接种到500L种子罐，恒温培养至对数生长期，无菌空气的通气量为1:0.6～1.2，培养温度为30℃，搅拌速度为180～240r/min，种子罐所用的培养基配方的质量含量为：葡萄糖0.1﹪，蛋白胨0.5﹪，酵母膏0.25﹪，用无菌水配制，pH7.0～7.2；将种子罐中的种子液按10﹪接种量接入生产罐中培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，无菌空气的通气量为1:0.6～1.2，培养温度为30℃，搅拌速度为180～240r/min，整个工艺流程培养时间为48～60h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上。

发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。该液体剂即为菌剂。

Claims

1.金橙II降解菌L-15，其特征在于该菌株是嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonasmaltophilia，属于黄单胞菌目的黄单胞菌科，于2014年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCCNO.9289，主要生物学特性为菌落圆形不透明，为专性需氧的非发酵型革兰氏阴性极生多鞭毛杆菌,在血平板上有强的氨味,无溶血；在营养琼脂上显示灰黄色素或无色素,菌落呈针尖状,直径0.5～1mm,中央突起；还原硝酸盐为亚硝酸盐,氧化酶阴性,水解明胶和七叶苷,赖氨酸脱羧酶阳性；在氧化发酵试验中,产酸缓慢或不显产酸,但分解麦芽糖。

2.利用如权利要求1所述的金橙II降解菌L-15生产的菌剂，该菌剂通过以下方法制备而成，其特征在于该方法包括以下步骤：

在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6～1.2，搅拌速度为180～240r/min，培养温度为30℃，整个工艺流程培养时间为48～60h，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，该液体剂即为菌剂。