CN104195065A - 金橙ii降解菌l-15及其生产的菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开金橙II降解菌L-15及其生产的菌剂。金橙II降解菌L-15,其菌株是嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia,属于黄单胞菌目的黄单胞菌科,于2014年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号CGMCC NO.9289,主要生物学特性为菌落圆形不透明,为专性需氧的非发酵型革兰氏阴性极生多鞭毛杆菌,在血平板上有强的氨味,无溶血。降解菌L-15能使偶氮染料金橙II的残留量降低80﹪以上。菌剂具有生产使用成本低,使用方便,去除效果好的优点,适合水及土壤的污染治理。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及金橙II降解菌L-15及其生产的菌剂,是利用微生物的方法降解染料,适用于环境污染的治理。
背景技术
偶氮染料(偶氮基两端连接芳基的一类有机化合物)是纺织品服装在印染工艺中应用最广泛的一类合成染料,用于多种天然和合成纤维的染色和印花,也用于油漆、塑料、橡胶等的着色。在特殊条件下,它能分解产生20多种致癌芳香胺,经过活化作用改变人体的DNA结构引起病变和诱发癌症。
偶氮化合物共同的特征为分子中含有偶氮键“―N=N―”。一般说来,偶氮化合物的分子中含有1―3个“―N=N―”,键上连有苯或苯基,苯或苯基又连有―Cl、―NH2、―CH3、―SO3、―NO2及―OH等基团。
偶氮染料污染的主要特点是污染量大,虽然偶氮染料废水中残留的染料成分浓度很低,但是排入水体也可以造成水体的透光率降低,破坏水体生态系统。这些染料结构稳定,具有抗碱、抗酸、抗微生物、抗光等特性,可以较长时间地滞留在环境中,因此存在潜在的健康危害。在生产和使用染料的地方,地下水和地表水的重要污染物就是偶氮染料。在很多染料工业密集的地区,河流和地下水都面临着严重污染的危险。
偶氮染料对人体的健康也有严重危害。日木人Yoshida等在20世纪30年代发现,溶剂黄可以引起老鼠肝细胞癌变。此后,人们才开始意识到,在生产和使用过程中,偶氮染料及其中间体具有危险性。芳香胺作为偶氮染料中间体,已被一些国家列为可疑致癌物,其中β-萘胺和联苯胺已经被确认为是对人类最具烈性的致癌物。其中,偶氮基经常会与一个或多个芳香环系统相连,而形成共轭体系,从而作为染料的发色体。它几平分布于所有颜色。偶氮染料不仅仅可以用于纺织品的印染,还可以用来染纸张、皮革、食品等。应该指出的是,在一般情况下,偶氮染料自身本不会危害人体健康,但是部分偶氮染料是用芳香胺类中间体合成的,而芳香胺类中间体具有致癌性,当人体皮肤长时间与其接触后,通过人体正常的新陈代谢过程而释放出的物质就会与其结合,结合后会发生还原反应,该反应会导致偶氮基断裂,从而再次生成具有致癌性的芳香胺类的化合物,假如这些生成的化合物被人体重新吸收,在经过活化作用以后,人体的细胞就会在结构和功能方面发生改变,转变成为人体病变的诱因。这样的结果是,导致癌症的可能性。
偶氮染料金橙II产品可溶于水,偶氮染料金橙II对环境的污染,已严重危害着人类的健康其环境的综合治理,偶氮染料金橙II在环境中的降解菌的开发未见有比较成熟的技术。
发明内容
本发明的一个目的是提供了一种金橙II降解菌L-15。
本发明提供的金橙II降解菌L-15,其菌株是嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia),属于黄单胞菌目的黄单胞菌科,于2014年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号CGMCC NO.9289,主要生物学特性为菌落圆形不透明,为专性需氧的非发酵型革兰氏阴性极生多鞭毛杆菌,在血平板上有强的氨味,无溶血;在营养琼脂上显示灰黄色素或无色素,菌落呈针尖状,直径0.5~1mm,中央突起;还原硝酸盐为亚硝酸盐,氧化酶阴性,强解脂性,水解明胶和七叶苷,赖氨酸脱羧酶阳性;在氧化发酵试验中,产酸缓慢或不显产酸,但分解麦芽糖。
本发明的另一个目的提供利用上述的金橙II降解菌L-15生产菌剂的方法,其工艺为:斜面种—摇瓶种子液—种子罐—产品(包装剂型为液体菌剂)。
该方法的具体步骤是:
步骤(1).将金橙II降解菌L-15的试管种接种于发酵培养基中,振荡培养至对数期;
步骤(2).将上述培养好的菌种按10﹪的接种量接种入500L种子罐,培养至对数生长期,种子罐所用的培养基配方及质量含量为:蛋白胨0.5﹪、酵母膏0.25﹪,用蒸馏水配制,pH为7.0;
步骤(3).将种子液按10﹪接种量接入生产罐培养,生产罐所用培养基与种子罐培养基相同;
步骤(4).在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6~1.2,搅拌速度为180~240r/min,培养温度为30℃,整个工艺流程培养时间为48~60h,发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上,发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂,该液体剂即为菌剂。
本发明的具体有益效果:
本发明的金橙II降解菌L-15菌剂具有生产使用成本低,使用方便,去除效果好的优点,适合水及土壤的污染治理。本发明对于保护生态环境,保护人类身体健康,提高农产品的附加值具有重要的意义。降解菌L-15能使偶氮染料金橙II的残留量降低80﹪以上。L-15菌株能以偶氮染料金橙II为碳源和能源进行生长,并可在短时间内偶氮染料金橙II降解。
附图说明
图1为接种量对L-15降解效率的影响;
图2为初始pH对L-15降解效率的影响;
图3为温度对L-15降解效率的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的分析。
金橙II降解菌,其菌株是嗜麦芽寡养单胞菌的菌株L-15,于2014年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院,保藏编号CGMCC NO.9289。
1.菌株的分离和鉴定
取污染土壤10g,置于100mL的无菌水中,振荡5min,得土壤菌悬液;取5mL的土壤菌悬液,加入到100mL的无机盐培养基[NH4NO3:407mg/L;KH2PO4:98mg/L;K2HPO4:33mg/L;NaCl:30mg/L;MgSO4:200mg/L;pH7.0]中,添加金橙II作为碳源,置于30℃,150r/min摇床培养获得富集液,连续在添加金橙II的培养基平板上涂布,直到获得金橙II的降解菌株。该降解菌命名为L-15,进一步纯化并鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。L-15菌株主要生物学特性菌落呈针尖状,直径0.5mm~1mm,中央突起。培养最适温度28~30℃,pH7.0。 该菌属假单胞菌属。能以金橙II为碳源进行生长,最适生长温度为30℃。在实验室摇瓶培养条件下金橙II的降解率达82﹪以上。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。
2.实验室生物降解实验
2.1接种量对L-15降解效率的影响
菌株L-15在LB培养基(LB培养基配方g/l:酵母粉5g/l,蛋白胨10g/l,NaCl 10g/l, pH7.0)中培养至对数期,按100ul、200 ul 、300 ul 、400 ul 、500 ul 的接种量分别接种到培养液[(无机盐培养基:NH4NO3:407 mg/L;KH2PO4:98 mg/L;K2HPO4:33 mg/L;NaCl:30 mg/L;MgSO4:200 mg/L;pH 7.0);金橙II:100 mg/L,pH 7.0],置于30℃、150r/min摇床培养,在培养后24 h分别测定培养液在600 nm处的OD值。结果如图1所示,接种量越大,金橙II的降解效率就越高;当接种量大于200 ul时在增大接种量对金橙II降解影响不大。虽然菌体的生长量随着接种量增加而提高,考虑到菌体生长情况以及经济的原因,采用100 ul(1﹪v/v)的接种量即可达到要求。
2.2 pH对L-15降解效率的影响
pH值是影响微生物生长和生存的另一个重要环境因素,微生物生长有一个适宜的pH值范围,超过适宜生长的pH值范围,大多数微生物都不能很好人的生长。
菌株L-15在LB培养基(LB培养基配方g/l:酵母粉5g/l,蛋白胨10g/l,NaCl 10g/l, pH7.0)中培养至对数期;按1﹪的接种量分别接种到六种不同pH的培养液,其中培养液[无机盐培养基(NH4NO3:407 mg/L;KH2PO4:98 mg/L;K2HPO4:33 mg/L;NaCl:30 mg/L;MgSO4:200 mg/L;pH 7.0);金橙II:100 mg/L] pH值分别调至2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0;置于30℃、150r/min摇床培养,在培养后8 h、16 h、24 h和32h分别测定培养液在600 nm处的OD值。pH对菌株L-15生长的影响如图2所示。结果表明:L-15菌株生长的适宜pH值范围在6~10,最佳pH值为6~7。
2.3 温度对L-15降解效率的影响
菌株L-15在LB培养基(LB培养基配方g/l:酵母粉5g/l,蛋白胨10g/l,NaCl 10g/l, pH7.0)中培养至对数期,按1﹪的接种量接种到培养液[无机盐培养基[ NH4NO3:407 mg/L;KH2PO4:98 mg/L;K2HPO4:33 mg/L;NaCl:30 mg/L;MgSO4:200 mg/L;pH 7.0],分别置于18℃、28℃、30℃、33℃、37℃下培养,在培养后8 h、16 h和24h分别测定培养液在600 nm处的OD值。温度对菌株L-15生长的影响如图3所示。结果表明:在实验的温度范围内,菌体均有不同程度的生长,温度为28~30℃时,生长最好,超过或低于该温度时,菌体生长速度减慢,而在37℃下培养时,菌种易老化。因此,L-15的最佳生长温度为28~30℃。
3.生产实施例
将金橙II降解菌L-15的试管种接种到发酵培养基中,振荡培养至对数期,准备接种种子罐;然后将上述培养好的菌种按10﹪的接种量接种到500L种子罐,恒温培养至对数生长期,无菌空气的通气量为1:0.6~1.2,培养温度为30℃,搅拌速度为180~240r/min,种子罐所用的培养基配方的质量含量为:葡萄糖0.1﹪,蛋白胨0.5﹪,酵母膏0.25﹪,用无菌水配制,pH7.0~7.2;将种子罐中的种子液按10﹪接种量接入生产罐中培养,生产罐所用培养基与种子罐培养基相同,无菌空气的通气量为1:0.6~1.2,培养温度为30℃,搅拌速度为180~240r/min,整个工艺流程培养时间为48~60h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上。
发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。该液体剂即为菌剂。
Claims (2)
1.金橙II降解菌L-15,其特征在于该菌株是嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia,属于黄单胞菌目的黄单胞菌科,于2014年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号CGMCC NO.9289,主要生物学特性为菌落圆形不透明,为专性需氧的非发酵型革兰氏阴性极生多鞭毛杆菌,在血平板上有强的氨味,无溶血;在营养琼脂上显示灰黄色素或无色素,菌落呈针尖状,直径0.5~1mm,中央突起;还原硝酸盐为亚硝酸盐,氧化酶阴性,强解脂性,水解明胶和七叶苷,赖氨酸脱羧酶阳性;在氧化发酵试验中,产酸缓慢或不显产酸,但分解麦芽糖。
2.利用如权利要求1所述的金橙II降解菌L-15生产的菌剂,该菌剂通过以下方法制备而成,其特征在于该方法包括以下步骤:
步骤(1).将金橙II降解菌L-15的试管种接种于发酵培养基中,振荡培养至对数期;
步骤(2).将上述培养好的菌种按10﹪的接种量接种入500L种子罐,培养至对数生长期,种子罐所用的培养基配方及质量含量为:蛋白胨0.5﹪、酵母膏0.25﹪,用蒸馏水配制,pH为7.0;
步骤(3).将种子液按10﹪接种量接入生产罐培养,生产罐所用培养基与种子罐培养基相同;
步骤(4).在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6~1.2,搅拌速度为180~240r/min,培养温度为30℃,整个工艺流程培养时间为48~60h,发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上,发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂,该液体剂即为菌剂。
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