CN114854810B - 一种通过脂肪酸代谢调控提高抗菌脂肽bacillomycin D产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物学发酵领域，具体涉及一种利用脂肪酸代谢调控提高抗菌脂肽bacillomycin D产量的方法：以一株能够合成bacillomycin D的芽孢杆菌为出发菌株，在发酵起始时分别添加0.25~5 mmol/L的丙酸钠、丙酸、丁酸等3种脂肪酸或脂肪酸盐，增加培养基中的游离脂肪酸，进而调控脂肪酸代谢途径，增加活性bacillomycin D发酵产量。本发明在基础培养基中添加丙酸钠、丙酸以及丁酸，均可使bacillomycin D产量显著提高，分别可达到对照组的1.44倍、1.4倍和1.1倍；丙酸钠的添加促进bacillomycin D合成基因的表达，从基因水平上佐证了其对bacillomycin D合成的促进作用。同时，丙酸钠可以引发部分信号因子表达上调，这些上调均可促进bacillomycin D的合成。此外，丙酸钠还可促进部分脂肪酸代谢相关酶的表达上调，进而促进脂肪酸的代谢。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域。具体涉及一种通过外源添加游离脂肪酸，促进脂肪酸代谢，调控并提高抗菌脂肽bacillomycin D产量的方法。
背景技术
芽胞杆菌生产的抗菌脂肽主要有surfactin、iturin和fengycin三大家族，其中bacillomycin D属于iturin家族，是由一条含14-17个C的脂肪酸链和一条7个氨基酸的肽链缩合而成的环状脂肽。Bacillomycin D作为一种天然的抗菌脂肽，具有良好的抗真菌作用，尤其对黄曲霉的抑制效果十分显著，且与传统抗菌剂相比，脂肽类物质具有广谱、高效、安全无毒、易降解等特性，因而在食品化妆品、医药、农业等相关行业具有良好的应用前景。但目前看来，bacillomycin D产量普遍较低，导致其生产成本高，这也成为了制约其大规模生产和应用的关键问题。
抗菌脂肽作为一种次级代谢产物，通过优化发酵条件，可以达到提高产量或者改变复合产物各组分比例的效果。有关bacillomycin D发酵培养基的优化，已有的研究主要集中在糖类、氨基酸和微量元素等方面。例如在发酵培养基中添加菊糖、L-Gln等均可使bacillomycin D产量显著提高。这主要是通过提供碳骨架、肽链合成元件、能量，以及调节部分与bacillomycin D合成相关的信号因子的表达来实现的。此外，bacillomycin D的脂肪酸链由PKS酶系合成，酰基-CoA硫酯中间体和丙二酰CoA是其直接前体，此二者与脂肪酸代谢息息相关。理论上，在发酵培养基中添加游离脂肪酸可以促进菌体内的脂肪酸代谢。但考虑到bacillomycin D合成机制的特殊性，菌体初级代谢中的脂肪酸合成及代谢途径能否影响bacillomycin D的合成，怎样影响bacillomycin D的合成尚未可知。通过向发酵培养基中添加脂肪酸来提高bacillomycin D产量方面的研究也是空白的。
发明内容
针对现有现有技术的不足，本发明提供了一种通过脂肪酸代谢调控提高抗菌脂肽bacillomycin D产量的方法。本发明通过向发酵培养基中添加丙酸钠、丙酸、丁酸，分别使bacillomycin D的发酵产量提高为对照组的1.44倍、1.4倍和1.1倍，具有显著的提高bacillomycin D的发酵产量的效果。
本发明具体技术方案如下：
一种通过脂肪酸代谢调控提高抗菌脂肽bacillomycin D产量的方法，以能够合成bacillomycin D的枯草芽孢杆菌为生产菌株，在添加了脂肪酸和/或脂肪酸盐的基础发酵培养基中发酵，所述脂肪酸为丙酸或丁酸，所述脂肪酸盐为丙酸钠，添加量为0.25～5mmol/L。
本发明首次发现添加特定浓度的丙酸、丙酸钠和丁酸能够促进bacillomycin D的合成。可能是由于上述脂肪酸(盐)更易转化为与bacillomycin D的装配路径相关的物质。就丙酸和丙酸钠而言，其在水中的溶解度更高、且可以在一些相关酶的作用下被转化为直接参与脂肪酸合成的丙酰CoA或者被送入柠檬酸循环，从而促进多种有益bacillomycin D合成反应的中间产物的产生。这一促进路径我们通过基因水平上的研究也得到证实。
具体的，在发酵起始前，向灭菌的发酵培养基中添加脂肪酸和/或脂肪酸盐，添加终浓度为0.25～5mmol/L。
优选的，所述丙酸钠、丙酸的最适添加量在2.5mmol/L。
优选的，所述丁酸的最适添加量在0.25mmol/L。
作为本申请的优选技术方案，生产菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ，由南京农业大学酶工程实验室自主筛选所得，菌种保藏号为CGMCC No.0943。
其中，因鉴定技术的进步，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ后更名为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)fmbJ，因此在本申请中，无论是枯草芽孢杆菌fmbJ还是解淀粉芽孢杆菌fmbJ，都实为保藏号CGMCC No.0943的这株菌。
作为本申请的优选技术方案，所述枯草芽孢杆菌fmbJ需要活化后接种到种子培养基，再将种子液接种到发酵培养基，发酵条件为33℃，180rpm，发酵时间为72-120h。
具体的，所述通过脂肪酸代谢调控提高抗菌脂肽bacillomycin D产量的方法包括如下具体步骤：
1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌在LA培养基上进行划线，置于37℃恒温培养箱静置培养12-16h，挑单菌落于LB培养基中，37℃，180rpm过夜活化；
(2)种子培养：将活化后的菌液接入种子培养基，37℃，180rpm培养至OD600达到0.8-1.0；
(3)发酵培养：用滤膜将脂肪酸过滤除菌，加入灭菌的发酵培养基，调整pH至7.0±0.2，然后将种子液接种到各组发酵培养基中，33℃，180rpm发酵72-120h；
(4)产物检测：将发酵液离心，收集上清液；调整上清液pH至2.0，4℃静置过夜；离心弃上清，收集沉淀，重悬，调整重悬液pH至7.0，超声处理50min，离心取上清获得bacillomycin D粗提液；粗提液过直径0.22μm的滤膜，通过分析型高效液相色谱对粗提液中的bacillomycin D进行定量检测，即可。
本发明还保护前述方法在bacillomycin D生产方面的应用。
本发明的有益结果：
(1)本发明通过向发酵培养基中添加丙酸钠、丙酸、丁酸，分别使bacillomycin D的发酵产量提高为对照组的1.44倍、1.4倍和1.1倍。
(2)本发明中，通过检测丙酸钠添加后，枯草芽孢杆菌fmbJ在发酵过程中的相关基因表达情况。发现bacillomycin D合成基因bamA、bamB、bamC的表达增加，从基因水平上证明了脂肪酸对bacillomycin D合成的促进作用。同时证明了丙酸钠的添加可以引发群体感应因子rapF、degQ、sigM表达上调，上述信号因子均可正调控bacillomycin D的合成。此外，丙酸钠的添加促进了柠檬酸合酶(cs)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、β-酮脂酰ACP合酶(fabF)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、丙酮酸激酶(pyk)、乙酰辅酶A合成酶(acs)等脂肪酸代谢相关酶的表达上调，进而促进脂肪酸的代谢。这些基因水平上的变化，为后续寻找从基因水平上提高bacillomycin D产量的方法提供了思路。
附图说明
图1为不同浓度丙酸钠对bacillomycin D发酵产量的影响；
图2为丙酸钠添加量和添加时间对bacillomycin D发酵产量的影响；
图3为2.5mmo/L丙酸钠添加时间对bacillomycin D抑菌活性的影响；
图4为丙酸钠对bacillomycin D合成基因表达的影响；
图5为丙酸钠对信号因子表达的影响；
图6为丙酸钠对脂肪酸合成相关基因表达的影响；
图7为不同浓度丙酸对bacillomycin D发酵产量的影响；
图8为不同浓度丁酸对bacillomycin D发酵产量的影响；
图9为不同浓度丁酸钠、戊酸、庚酸、辛酸、癸酸、油酸对bacillomycin D发酵产量的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可以很容易地从公开是商业渠道获得。
(1)本发明在灭菌的发酵培养基中分别添加丙酸钠、丙酸、丁酸钠、丁酸、戊酸、正庚酸、正辛酸、正癸酸、油酸等8种脂肪酸(盐)的其中之一，设置其终浓度梯度为0、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L。根据本发明优选的，能够最大程度提高bacillomycin D发酵产量的分别是2.5mmol/L的丙酸钠、丙酸以及0.25mmol/L的丁酸。
(2)根据本发明，(1)中脂肪酸(盐)添加的最适时间是发酵起始前。
(3)枯草芽孢杆菌fmbJ过夜活化后接入种子培养基，待种子液OD600达到0.8-1.0，将种子液接种到添加了相应脂肪酸或脂肪酸盐的发酵培养基，33℃，180rpm发酵72-120h。
首先对以下实例中涉及的关键培养基成分做出说明：
种子培养基：牛肉浸膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠5.0g/L，pH 7.0-7.2。发酵培养基：无水葡萄糖20.0g/L，L-谷氨酸5.0g/L，酵母浸膏1.0g/L，KH2PO4 0.5g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CuSO4·5H2O 0.15mg/L，FeSO4·7H2O 1.2mg/L，MnSO4 5mg/L，pH7.0。
实施例1
(1)菌种活化：将-20℃保存的枯草芽孢杆菌fmbJ在LA培养基上进行划线，置于37℃恒温培养箱静置培养16h，挑单菌落于LB培养基中，37℃，180rpm过夜活化。
(2)种子培养：将活化后的菌液接入种子培养基，37℃，180rpm培养至OD600达到0.8-1.0。
(3)发酵培养：首先将丙酸钠配制成2.5mol/L的浓储溶液，用0.22μm有机滤膜将丙酸钠溶液过滤除菌，按照终浓度0、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L加入灭菌的发酵培养基。然后将种子液接种到各组发酵培养基中，33℃，180rpm发酵120h。
(4)添加浓度进一步筛选：用0.22μm有机滤膜将丙酸钠溶液过滤除菌，按照终浓度0、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、3mmol/L加入灭菌的发酵培养基。然后将种子液接种到各组发酵培养基中，33℃，180rpm发酵120h。
(5)添加时间进一步筛选：将种子液接种到各组发酵培养基中，33℃，180rpm发酵120h。用0.22μm有机滤膜将丙酸钠溶液过滤除菌，按照终浓度2.5mmol/L加入灭菌的发酵培养基，添加时间分别设置在发酵0h、12h、24h、36h、48h。
(6)产物检测：将发酵液转移至离心管中，8000rpm离心20min，收集上清液。6M HCl调整上清液pH至2.0，4℃静置过夜。8500rpm离心20min，弃上清，收集沉淀于离心管底，按照100:2的比例加入甲醇使沉淀重悬，2M NaOH调整重悬液pH至7.0，置于超声清洗器中超声处理50min，8000rpm离心20min，取上清获得bacillomycin D粗提液。粗提液过直径0.22μm的滤膜，通过分析型高效液相色谱对粗提液中的bacillomycin D进行定量检测。并按照如下标准曲线计算bacillomycin D的最终产量：y＝7.6396x-2.3576，R2＝0.9999，x，bacillomycin D浓度，mg/L；y，峰面积，mAU·h。
(7)抑菌效果检测：将-20℃保存的黄曲霉菌接种于PDA培养基，置于30℃恒温培养箱活化2-3天，向培养平板中加入5mL生理盐水，轻轻晃动或用灭菌枪头轻刮使孢子悬浮，制成孢子悬液，并将该悬液用无菌脱脂棉过滤，以除去残留在悬液中的菌丝。通过血细胞计数法将孢子悬液浓度调整至106个/mL，取100mL的PDA培养基，融化后冷却至45-50℃，加入1mL孢子悬液轻摇混匀，然后倒入灭菌的培养皿中。待平板晾干后，用直径6mm的打孔器在培养基上均匀打孔，并按照预加样品名称做好标记，然后在每个孔中加入50μL相应的bacillomycin D粗提液，以甲醇作为对照。最后用保鲜膜密封后平稳转移至30℃恒温培养箱中培养72h，观察抑菌圈情况。
(8)RT-qPCR检测基因表达量的变化：首先采用细菌总RNA提取试剂盒提取发酵36h的枯草芽孢杆菌fmbJ总RNA，提取完成后，通过NanoDrop 2000检测RNA浓度及质量。
按照cDNA第一链合成试剂盒说明书获取cDNA。具体反应条件如下：在RNase-free的离心管中，加入4×gDNA wiper Mix 4μL，模板RNA 2μL，RNase free ddH2O 10μL，并用移液器轻轻吹打混匀，置于42℃水浴锅中2min，以去除基因组DNA。之后在反应管中直接加入5×HiScriptⅡqRT SuperMixⅡ4μL，置于PCR仪中，进行逆转录反应。反应程序为50℃15min，85℃5sec。将反应产物取出，置于冰上，采用NanoDrop 2000测定所得cDNA浓度，置于-20℃冰箱备用。
RT-qPCR反应体系为上下游引物各1μL，将配制完成的反应液转移至荧光定量PCR仪上进行两步法扩增，条件为：95℃，30s；40个循环：95℃，5s；60℃，30s。以16S rRNA为内参基因，用2-ΔΔCt法分析目的基因的表达。引物设计如表1：
表1 RT-qPCR所需引物
如图1、图2，经过HPLC的分析，与不添加任何脂肪酸的基础培养基相比，在发酵起始前添加2.5mmol/L丙酸钠的处理组，bacillomycin D产量从272.3mg/L提高到392.5mg/L，为对照组的1.44倍，且抑菌圈大小较对照组明显增大(图3)。
经RT-qPCR检测，bacillomycin D合成基因bamA、bamB和bamC的表达显著上调(图4)，从基因水平印证了bacillomycin D产量的提高。此外，如图5，丙酸钠的添加使得群体感应因子rapF、degQ、sigM的表达显著上调，上述信号因子均可正调控bacillomycin D的表达；与此同时，也促进了cs、icd、fabF、ACCase、pyk、acs等基因的表达(图6)。这表明，丙酸钠的添加促进了部分群体感应因子和脂肪酸相关代谢途径的活跃，这可能是丙酸钠促进bacillomycin D产量提高的直接路径，为后续寻找从基因水平上提高bacillomycin D产量的方法提供了广阔思路。
实施例2
(1)菌种活化：将-20℃保存的枯草芽孢杆菌fmbJ在LA培养基上进行划线，置于37℃恒温培养箱静置培养16h，挑单菌落于LB培养基中，37℃，180rpm过夜活化。
(2)种子培养：将活化后的菌液接入种子培养基，37℃，180rpm培养至OD600达到0.8-1.0。
(3)发酵培养：用0.22μm有机滤膜将丙酸过滤除菌，按照终浓度0、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L加入灭菌的发酵培养基，采用除菌后的4M NaOH调整pH至7.0左右。然后将种子液接种到各组发酵培养基中，33℃，180rpm发酵120h。
(4)产物检测：将发酵液转移至离心管中，8000rpm离心20min，收集上清液。6M HCl调整上清液pH至2.0，4℃静置过夜。8500rpm离心20min，弃上清，收集沉淀于离心管底，按照100:2的比例加入甲醇使沉淀重悬，2M NaOH调整重悬液pH至7.0，置于超声清洗器中超声处理50min，8000rpm离心20min，取上清获得bacillomycin D粗提液。粗提液过直径0.22μm的滤膜，通过分析型高效液相色谱对粗提液中的bacillomycin D进行定量检测。并按照如下标准曲线计算bacillomycin D的最终产量：y＝7.6396x-2.3576，R2＝0.9999，x，bacillomycin D浓度，mg/L；y，峰面积，mAU·h。
如图7，经过HPLC分析，与不添加任何脂肪酸的基础培养基相比，添加了2.5mmol/L丙酸的bacillomycin D产量从246.7mg/L提高到344.8mg/L，为对照组的1.4倍。
实施例3
(1)菌种活化：将-20℃保存的枯草芽孢杆菌fmbJ在LA培养基上进行划线，置于37℃恒温培养箱静置培养16h，挑单菌落于LB培养基中，37℃，180rpm过夜活化。
(2)种子培养：将活化后的菌液接入种子培养基，37℃，180rpm培养至OD600达到0.8-1.0。
(3)发酵培养：用0.22μm有机滤膜将丁酸过滤除菌，按照终浓度0、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L加入灭菌的发酵培养基，采用除菌后的4M NaOH调整pH至7.0左右。然后将种子液接种到各组发酵培养基中，33℃，180rpm发酵120h。
(4)产物检测：将发酵液转移至离心管中，8000rpm离心20min，收集上清液。6M HCl调整上清液pH至2.0，4℃静置过夜。8500rpm离心20min，弃上清，收集沉淀于离心管底，按照100:2的比例加入甲醇使沉淀重悬，2M NaOH调整重悬液pH至7.0，置于超声清洗器中超声处理50min，8000rpm离心20min，取上清获得bacillomycin D粗提液。粗提液过直径0.22μm的滤膜，通过分析型高效液相色谱对粗提液中的bacillomycin D进行定量检测。并按照如下标准曲线计算bacillomycin D的最终产量：y＝7.6396x-2.3576，R2＝0.9999，x，bacillomycin D浓度，mg/L；y，峰面积，mAU·h。
如图8，经HPLC分析，与不添加任何脂肪酸的基础培养基相比，添加了0.25mmol/L丁酸的bacillomycin D产量从284.7mg/L提高到313.9mg/L，对照组的1.1倍。
对比例1
(1)菌种活化：将-20℃保存的枯草芽孢杆菌fmbJ在LA培养基上进行划线，置于37℃恒温培养箱静置培养16h，挑单菌落于LB培养基中，37℃，180rpm过夜活化。
(2)种子培养：将活化后的菌液接入种子培养基，37℃，180rpm培养至OD600达到0.8-1.0。
(3)发酵培养：用0.22μm有机滤膜将丁酸钠、戊酸、庚酸、辛酸、癸酸、油酸分别过滤除菌，按照终浓度0、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L加入灭菌的发酵培养基，采用除菌后的4M NaOH调整pH至7.0左右。然后将种子液接种到各组发酵培养基中，33℃，180rpm发酵120h。
(4)产物检测：将发酵液转移至离心管中，8000rpm离心20min，收集上清液。6M HCl调整上清液pH至2.0，4℃静置过夜。8500rpm离心20min，弃上清，收集沉淀于离心管底，按照100:2的比例加入甲醇使沉淀重悬，2M NaOH调整重悬液pH至7.0，置于超声清洗器中超声处理50min，8000rpm离心20min，取上清获得bacillomycin D粗提液。粗提液过直径0.22μm的滤膜，通过分析型高效液相色谱对粗提液中的bacillomycin D进行定量检测。并按照如下标准曲线计算bacillomycin D的最终产量：y＝7.6396x-2.3576，R2＝0.9999，x，bacillomycin D浓度，mg/L；y，峰面积，mAU·h。
如图9，经过HPLC分析，与不添加任何脂肪酸的基础培养基相比，添加了上述任一种脂肪酸的处理组的bacillomycin D产量均有不同程度下降，在庚酸、辛酸、癸酸浓度较高时甚至会影响菌体生长，阻断bacillomycin D的合成。由此得出结论，丁酸钠、戊酸、庚酸、辛酸、癸酸、油酸不能促进bacillomycin D合成。
综上，通过实施例1-3以及对比例1对比短链、中链及长链脂肪酸对bacillomycinD产量的影响，从中得出，特定浓度的丙酸、丙酸钠及丁酸可以促进bacillomycin D发酵产量提高；针对其中产量最高的丙酸钠，探究其在基因水平上对发酵过程中枯草芽孢杆菌fmbJ的bacillomycin D合成基因、部分群体感应信号因子以及脂肪酸代谢相关酶表达的影响。结果表明，丙酸钠促进了bacillomycin D合成基因bamA、bamB、bamC的表达上调，从基因水平上证明了丙酸钠对bacillomycin D产量的促进作用；并且丙酸钠的添加也使脂肪酸代谢和信号因子表达上调。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
Claims (4)
1.一种通过脂肪酸代谢调控提高bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，以能够合成bacillomycin D的芽孢杆菌为生产菌株，在分别添加了脂肪酸或脂肪酸盐的基础发酵培养基中发酵，所述脂肪酸为丙酸或丁酸，所述脂肪酸盐为丙酸钠；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）fmbJ，由南京农业大学酶工程实验室自主筛选所得，菌种保藏号为CGMCC No.0943；
其中，所述丙酸钠、丙酸的添加量在2.5 mmol/L；
所述丁酸的最适添加量在0.25 mmol/L。
2.根据权利要求1所述的通过脂肪酸代谢调控提高bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌活化后接种到种子培养基，再将种子液接入发酵培养基，发酵条件为33 ℃，180 rpm，发酵时间为72-120 h。
3.根据权利要求1所述的通过脂肪酸代谢调控提高bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）菌种活化：将枯草芽孢杆菌在LA培养基上进行划线，置于37 ℃恒温培养箱静置培养12-16 h，挑单菌落于LB培养基中，37 ℃，180 rpm过夜活化；
（2）种子培养：将活化后的菌液接入种子培养基，37 ℃，180 rpm培养至OD 600 达到0.8-1.0；
（3）发酵培养：用滤膜将脂肪酸过滤除菌，加入灭菌的发酵培养基，调整pH至7.0±0.2，然后将种子液接种到各组发酵培养基中，33 ℃，180 rpm发酵72-120 h；
（4）产物检测：将发酵液离心，收集上清液；调整上清液pH至2.0，4 ℃静置过夜；离心弃上清，收集沉淀，重悬，调整重悬液pH至7.0，超声处理50 min，离心取上清获得bacillomycin D粗提液；粗提液过直径0.22 μm的滤膜，通过分析型高效液相色谱对粗提液中的bacillomycin D进行定量检测，即可。
4.权利要求1-3任一所述的通过脂肪酸代谢调控提高bacillomycin D发酵产量的方法在bacillomycin D生产方面的应用。
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