CN114085801A - 一株生产l-色氨酸的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株生产L‑色氨酸的重组大肠杆菌及其应用。本发明的重组大肠杆菌，命名为大肠杆菌(Escherichia coli)FMME‑TRPD‑A，于2021年11月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC M 20211388。本发明的Escherichia coli FMME‑TRPD‑A可抵抗高浓度L‑色氨酸的反馈抑制，且具有较好的传代稳定性，在传代12代之后，其L‑色氨酸的生产能力均能够稳定在一定水平，通过过表达色氨酸合成路径中的关键酶，以提高色氨酸产量；在摇瓶水平上发酵生产L‑色氨酸产量达3.01g/L，在发酵罐水平上发酵生产L‑色氨酸产量达55.2g/L。本发明发酵生产L‑色氨酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。

Description

一株生产L-色氨酸的重组大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株生产L-色氨酸的重组大肠杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

L-色氨酸，即L-α-氨基-β-吲哚基丙酸，化学式C₁₁H₁₂N₂O₂，属于芳香族氨基酸，外观为白色或微黄色结晶，或呈结晶性粉末，无臭，味微苦。水中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿中不溶，溶于甲酸、稀酸和稀碱，不溶于氯仿和乙醚。熔点282℃，289℃分解，在280nm附近有强烈的吸收峰。

色氨酸是8种必需氨基酸之一，可以广泛应用于食品、饲料、医药以及农林等行业。在食品中添加色氨酸可促进蛋白质吸收。作为饲料添加剂，使用时可令动物增重。此外，色氨酸在抑郁症的治疗中也可以起到一定的效果。目前，全世界色氨酸年产量超过5万吨，但仍低于潜在的市场需求量。传统的色氨酸生产方法主要有化学合成法和酶催化法。但由于生产原料有限、污染问题严重以及成本偏高等原因，上述方法已逐渐被微生物法取代随着生物技术的不断发展以及微生物法所特有的低成本、环境友好及高密度发酵等优势，涉及微生物生产色氨酸的策略也得到广泛应用和研究。

色氨酸属于芳香族氨基酸，是代谢路径最长的氨基酸之一。在大肠杆菌中，代谢途径以菌体吸收葡萄糖为起始，经糖酵解(EMP)途径产生磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和戊糖磷酸途径(HMP)产生赤藓糖-4-磷酸(E4P)，两者缩合形成芳香族共同前体物质3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)。此过程在大肠杆菌中可由aroG、aroF或aroH编码的3种DAHP合酶同工酶催化形成，且三种酶在野生型大肠杆菌中的酶活比例分别为80:20:1，分受到L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸的反馈抑制。以DAHP为前体途径莽草酸(SHIK)到分支酸(CHA)的途径称为芳香族氨基酸的共同途径。而后以CHA为起点经过邻氨基苯甲酸(ANTA)到L-色氨酸的途径称为色氨酸分支途径。此过程中由TrpED基因编码ANTA合酶活性受到L-色氨酸的抑制。TrpEDCBA共同构成色氨酸操纵子的结构基因，调控色氨酸分支途径。在大肠杆菌中，合成L-色氨酸的氨基酸骨架由L-丝氨酸提供。由于目前生产菌株中，色氨酸反馈抑制的作用，导致底物浓度低，生产效率低。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种生产L-色氨酸的重组大肠杆菌，先通过紫外诱变以及梯度浓度色氨酸类似物筛选获得抗反馈抑制菌株，再通过过表达抗反馈抑制突变型aroG^fbr以提高芳香族氨基酸途径碳流代谢通量，过表达抗反馈抑制型TrpE^fbrDCBA以强化L-色氨酸分支途径；同时，过表达SerA保证合成L-色氨酸时前体供应。

本发明的第一个目的是提供一种生产L-色氨酸的重组大肠杆菌，命名为大肠杆菌(Escherichia coli)FMME-TRPD-A，于2021年11月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC M 20211388。

进一步地，所述的重组大肠杆菌中，过表达了编码色氨酸生物合成路径中关键酶DAHP合酶的aroG基因、色氨酸操纵子中的结构基因TrpEDCBA基因和编码磷酸甘油脱氢酶的SerA基因。

进一步地，aroG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，TrpEDCBA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SerA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述的重组大肠杆菌抗L-色氨酸的反馈抑制。

本发明的第二个目的是提供所述的重组大肠杆菌在发酵生产L-色氨酸中的应用。

进一步地，所述的应用是采用所述的重组大肠杆菌在发酵培养基中进行全有氧发酵，得到含有L-色氨酸的发酵液。

进一步地，在所述的全有氧发酵过程中，进行分阶段控制溶氧，发酵0～6h控制溶氧为15～20％，发酵6～20h控制溶氧为20～25％，发酵20h至发酵结束控制溶氧为25～30％。

进一步地，在所述的全有氧发酵过程中，初始培养基中葡萄糖耗尽时，流加葡萄糖，并控制葡萄糖浓度在1g/L以下。

进一步地，葡萄糖流加是通过脉冲式流加600～1000g/L的葡萄糖溶液。

进一步地，所述的发酵培养基配方为：葡萄糖7～8g/L，柠檬酸1～3g/L，硫酸铵1.5～1.8g/L，磷酸氢二钾5.5～5.8g/L，七水硫酸镁1.8～2.2g/L，金属离子液0.8～1.2mL/L。

进一步地，在所述的全有氧发酵过程中，pH控制在6.5～6.7，发酵温度控制在34～36℃。

本发明的有益效果是：

本发明的Escherichia coli FMME-TRPD-A可抵抗高浓度L-色氨酸的反馈抑制，且具有较好的传代稳定性，在传代12代之后，其L-色氨酸的生产能力均能够稳定在一定水平，通过过表达色氨酸合成路径中的关键酶，以提高色氨酸产量；在摇瓶水平上发酵生产L-色氨酸产量达3.01g/L，在发酵罐水平上发酵生产L-色氨酸产量达55.2g/L。本发明发酵生产L-色氨酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。

生物材料保藏

大肠杆菌(Escherichia coli)FMME-TRPD-A，于2021年11月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC M 20211388。

附图说明：

图1为诱变筛选后大肠杆菌突变菌株的平板生长形态；

图2为大肠杆菌中L-色氨酸合成路径图；

图3为大肠杆菌FMME-TRPD-A质粒图谱；

图4为大肠杆菌在发酵罐水平发酵过程中OD₆₀₀和色氨酸产量变化曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

(1)培养基：

固体培养基：胰蛋白胨10g/L，进口酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，磷酸二氢钾1g/L，琼脂粉30g/L，四环素50mg/L。

种子培养基：葡萄糖40g/L，酵母浸粉6g/L，磷酸二氢钾5.6g/L，硫酸铵1.2g/L，硫酸镁1.6g/L，维生素B11.3 mg/L，生物素0.3mg/L，硫酸亚铁2.8mg/L，四环素15mg/L。

发酵培养基：葡萄糖7.5g/L，柠檬酸2g/L，硫酸铵1.6g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，七水硫酸镁2.0g/L，金属离子液1mL/L。

(2)葡萄糖的测定：

发酵液预处理：取发酵液12000r/min离心5min取上清。稀释至适宜倍数，用M-100生物传感分析仪检测发酵液葡萄糖浓度。

(3)L-色氨酸的测定：

高效液相色谱法：配置1g/L浓度L-色氨酸溶液，稀释至0.1、0.2、0.3、0.4和0.5g/L，利用高效液相色谱仪(HPLC)进行检测，获得出峰时间以及不同浓度L-色氨酸所对应的峰面积，以L-色氨酸溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归方程的回归系数应该在0.990以上方可以使用。仪器为安捷伦高效液相色谱仪，色谱柱采用安捷伦C-18柱；流动相为0.03％KH2PO4：纯甲醇＝9:1；流速设定为1mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长为278nm，柱温为39℃。

发酵液预处理：取发酵液12000r/min离心5min取上清。稀释适宜倍数后，将样品过膜处理，使用HPLC进行检测，将所得峰面积代入线性回归方程，所得结果乘稀释倍数即为发酵液中L-色氨酸浓度。

实施例1：菌株的筛选与鉴定

(1)产L-色氨酸的大肠杆菌的诱变与筛选

将野生大肠杆菌悬浮液涂布于含有不同浓度的5-甲基色氨酸(1.0、5.0、10.0、15.0、20.0g/L)的琼脂平板上，采用功率为30瓦的紫外等，照射距离为20cm条件下诱变处理，36℃培养24h，根据菌株生长情况，挑取长势良好菌株，进行初筛，对产量提升较高得到菌株进行复筛，并涂布于LB斜面培养基36℃培养12h。用5mL生理盐水至0.02％接入种子培养基中36℃培养12h，转接于发酵培养基中进行摇瓶发酵，200rpm、24h。将发酵上清液预处理后，经高效液相色谱检测，产量达到1.36g/L。

(2)产L-色氨酸大肠杆菌的鉴定

将待测菌株接入种子培养基中，36℃，200r/min，培养8h后收集菌体，提取目的菌株的基因组DNA。16S rDNA片段的PCR扩增和测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成，将测序结果在Genbank数据库中与已有序列进行Blast比对分析，通过DNAMAN序列比对选取与大肠杆菌的16S rDNA序列相似性高达99％的菌株，将其命名为大肠杆菌FMME-TRPD。

实施例2：大肠杆菌FMME-TRPD的传代稳定性

将筛选得到的大肠杆菌FMME-TRPD进行12代的传代培养，将10代以后的菌株接种至发酵培养基中进行摇瓶发酵。发酵结束后测定L-色氨酸产量，产量为1.32～1.42g/L。传代培养后L-色氨酸产量见表1。

表1

实施例3：菌种改造

挑选实施例2中菌株进行改造，对其路径中关键酶基因aroG和TrpEDCBA以及前体供应的关键酶基因SerA进行强化表达。测序得知，该菌株基因组中aroG、SerA和TrpEDCBA基因均发生不同程度突变。

(1)重组大肠杆菌FMME-TRPD/P_tactrpEDCBA的构建

设计基因trpEDCBA相对应的引物，以上述基因组DNA为模板，利用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获得相应的trpEDCBA基因片段。提取大肠杆菌FMME-TRPD/P_tactrpEDCBA中质粒，经过双酶切后，采用琼脂糖核酸电泳进行胶回收，回收获得线性化的质粒pBR322-P2/P_tactrpEDCBA。将上述PCR扩增获得的基因片段分别与双酶切后的质粒采用一步同源重组酶进行连接，体系为20μL，条件为37℃，30min。连接产物转化至大肠杆菌FMME-TRPD感受态细胞，在四环素抗性平板上进行筛选，挑取单菌落进行PCR验证，阳性转化子进行测序，测序结果与理论序列一致，由此获得强化表达后的菌株大肠杆菌FMME-TRPD/P_tactrpEDCBA。

(2)重组大肠杆菌FMME-TRPD/P_tactrpEDCBA-P_tacaroG-serA的构建

设计基因aroG相对应的引物，以上述基因组DNA为模板，利用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获得相应的aroG基因片段。设计基因serA相对应的引物，以上述基因组DNA为模板，利用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获得相应的serA基因片段。在基因aroG的下游与基因serA的上游设置同源臂。质粒pBR322-P2/P_tactrpEDCBA(四环素抗性)经过双酶切后，采用琼脂糖核酸电泳进行胶回收，回收获得线性化的质粒pBR322-P2。将上述PCR扩增获得的基因片段分别与双酶切后的质粒采用一步同源重组酶进行连接，体系为20μL，条件为37℃，30min。连接产物转化至大肠杆菌FMME-TRPD感受态细胞，在四环素抗性平板上进行筛选，挑取单菌落进行PCR验证，阳性转化子进行测序，测序结果与理论序列一致，由此获得强化表达后的菌株大肠杆菌FMME-TRPD/P_tactrpEDCBA-P_tacaroG-serA。重组菌株质粒图谱如图3所示。

将其命名为大肠杆菌(Escherichia coli)FMME-TRPD-A，并保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏日期为2021年11月08日，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC M 20211388。

上述实施例中，引物设计如下表2所示：

表2

实施例4：重组大肠杆菌(Escherichia coli)FMME-TRPD-A摇瓶发酵

将重组大肠杆菌(Escherichia coli)FMME-TRPD-A接入发酵培养基中进行摇瓶发酵。发酵结束后测定L-色氨酸产量，产量为3.01g/L。改造后大肠杆菌生产L-色氨酸产量见下表3。

表3

导入质粒	L-色氨酸产量(g/L)
		无质粒	1.38
pBR322	1.32
		pBR322-P<sub>tac</sub>trpEDCBA	2.48
pBR322-P<sub>tac</sub>TrpEDCBA-P<sub>tac</sub>aroG-serA	3.01

实施例5：重组大肠杆菌(Escherichia coli)FMME-TRPD-A补料分批发酵

(1)种子活化及培养

斜面培养基：胰蛋白胨10g/L，进口酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，磷酸二氢钾1g/L，琼脂粉30g/L，四环素50mg/L。

种子培养基：葡萄糖40g/L，酵母浸粉6g/L，磷酸二氢钾5.6g/L，硫酸铵1.2g/L，硫酸镁1.6g/L，维生素B₁1.3 mg/L，生物素0.3mg/L，硫酸亚铁2.8mg/L，四环素15mg/L。

斜面活化：从保藏管中接种一环菌株至斜面培养基，恒温36℃，培养12h；

种子培养：将生长好的斜面用5mL生理盐水洗脱，向装有50mL培养基的500mL三角瓶中接入菌悬液，往复式摇床200rpm/min，36℃恒温培养约12h左右，至种子液稀释10倍后，OD₆₆₀值在0.4-0.6之间。

(2)发酵培养

在5L发酵罐中对分别对重组菌株进行发酵培养，具体发酵条件为：

发酵培养基：葡萄糖7.5g/L，柠檬酸2g/L，硫酸铵1.6g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，七水硫酸镁2.0g/L，金属离子液1mL/L。121℃灭菌15min。灭菌后安装至控制台，开启温度自控，待温度冷却至35℃后准备接种。

接种量：以接种量10％，将制备好的种子液接种至发酵罐中；

发酵温度：发酵过程中，开启温度自控，维持发酵温度在35±1℃；

发酵pH：使用氨水调节pH在6.5～6.7之间；

溶氧条件：初始条件：通气量3L/min，转速400rpm；

发酵过程中，通过调节通气量和搅拌桨转速将发酵过程中的溶氧，进行分阶段控制溶氧，发酵前6h，控制溶氧为15-20％，发酵6～20h，控制溶氧为20～25％，发酵20h至放罐，控制溶氧为25～30％。

发酵过程中，待发酵培养基中初始葡萄糖全部耗尽后，通过脉冲式流加800g/L的葡萄糖溶液，控制葡萄糖浓度在1.0g/L以下。

下表4表示不同改造程度的重组大肠杆菌，发酵生产L-色氨酸的产量。

表4

导入质粒	L-色氨酸产量(g/L)
		无质粒	11.3
pBR322	10.8
		pBR322-P<sub>tac</sub>aroG	20.7
pBR322-P<sub>tac</sub>aroG-P<sub>tac</sub>trpEDCBA	45.5
		pBR322-P<sub>tac</sub>aroG-P<sub>tac</sub>TrpEDCBA-serA	55.2

如表4所示，在该发酵条件下，L-色氨酸产量达到55.2g/L。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一株生产L-色氨酸的重组大肠杆菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1065

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60

gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120

aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180

tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240

gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300

acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360

gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420

gctctgccag cggcaggtga gtttctcgat atgatcaccc cacaatatct cgctgacctg 480

atgagctggg gcgcaattgg cgcacgtacc accgaatcgc aggtgcaccg cgaactggca 540

tcagggcttt cttgtccggt cggcttcaaa aatggcaccg acggtacgat taaagtggct 600

atcgatgcca ttaatgccgc cggtgcgccg cactgcttcc tgttcgtaac gaaatggggg 660

cattcggcga ttgtgaatac cagcggtaac ggcgattgcc atatcattct gcgcggcggt 720

aaagagccta actacagcgc gaagcacgtt gctgaagtga aagaagggct gaacaaagca 780

ggcctgccag cacaggtgat gatcgatttc agccatgcta actcgtccaa acaattcaaa 840

aagcagatgg atgtttgtgc tgacgtttgc cagcagattg ccggtggcga aaaggccatt 900

attggcgtga tggtggaaag ccatctggtg gaaggcaatc agagcctcga gagcggggag 960

ccgctggcct acggtaagag catcaccgat gcctgcatcg gctgggaaga taccgatgct 1020

ctgttacgtc aactggcgaa tgcagtaaaa gcgcgtcgcg ggtaa 1065

<210> 2

<211> 3158

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

atgcaaacac aaaaaccgac tctcgaacta ctaacctgcg aaggcgctta tcgcgacaac 60

ccgaccgcgc tttttcacca gttgtgtggg gatcgtccgg caacgctgct gctggaatcc 120

gcagatatcg acagcaaaga tgatttaaaa agcctgctac tggtagacag tgcgctgcgc 180

attacagcat taggtgacac tgtcacaatt aaggcgttat ccggcaatgg tgaagccctg 240

ctggcactac tggataacgc cctgcctgcg ggtgtggaaa atgaacaatc accaaactgc 300

cgtgtgctgc gcttcccccc tgtcagtcca ctgctggatg aagacgctcg cttatgctcc 360

ctttcggttt ttgacgcttt ccgtttattg cagaatctgt tgaatgtacc gaaggaagaa 420

cgagaagcca tgttcttcgg cggcctgttc tcttatgacc ttgtggcggg atttgaagat 480

ttaccgcaac tgtcagcgga aaataactgc cctgatttct gtttttatct cgctgaaacg 540

ctgatggtga ttgaccatca gaaaaaaagc acccgtattc aggccagcct gtttgctccg 600

aatgaagaag aaaaacaacg tctcactgct cgcctgaacg aactacgtca gcaactgacc 660

gaagccgcgc cgccgctgcc agtggtttcc gtgccgcata tgcgttgtga atgtaatcag 720

agcgatgaag agttcggtgg cgtagtgcgt ttgttgcaaa aagcgattcg cgctggagaa 780

attttccagg tggtgccatc tcgccgtttc tctctgccct gcccgtcacc gctggcggcc 840

tattacgtgc tgaaaaagag taatcccagc ccgtacatgt tttttatgca ggataatgat 900

ttcaccctat ttggcgcgtc gccggaaagc tcgctcaagt atgatgccac cagccgccag 960

attgagatct acccgattgc cggaacacgc ccacgcggtc gtcgcgccga tggttcactg 1020

gacagagatc tcgacagccg tattgaactg gaaatgcgta ccgatcataa agagctgtct 1080

gaacatctga tgctggttga tctcgcccgt aatgatctgg cacgcatttg cacccccggc 1140

agccgctacg tcgccgatct caccaaagtt gaccgttatt cctatgtgat gcacctcgtc 1200

tctcgcgtag tcggcgaact gcgtcacgat cttgacgccc tgcacgctta tcgcgcctgt 1260

atgaatatgg ggacgttaag cggtgcgccg aaagtacgcg ctatgcagtt aattgccgag 1320

gcggaaggtc gtcgccgcgg cagctacggc ggcgcggtag gttatttcac cgcgcatggc 1380

gatctcgaca cctacattgt gatccgctcg gcgctggtgg aaaacggtat cgccaccgtg 1440

caagcgggtg ctggtgtagt ccttgattct gttccgcagt cggaagccga cgaaacccgt 1500

aacaaagccc gcgctgtact gcgcgctatt gccaccgcgc atcatgcaca ggagactttc 1560

tgttaccctc gtgccgccag tgcggtgact ctgtcgtaag cggaaccact gcgcagtacc 1620

tcaagaacgg tttgcgcatt ggcttgcaga tcttcatggc catgcaggcg cattaacatg 1680

gcgacgttcg cagcgacggc tgcttcatgg gcggcgtcgc ctttaccttg taacaaacgt 1740

gttaaaatgt cacggttttc ttccggtgtt ccgcctgcca gttgctcctg gtggtagggt 1800

gtcaggccaa agtcttctgc ggtgagctga tagcttttaa tttcgccgtc atgcagttcg 1860

gcaacgattg tcggcgcgtg taatgaaact tcatccatcc cgccgctgtg caccaccgcc 1920

gcgcgttgat accccagcac gcgcaaggtt tcggcaatcg gcagcaccag ttccggacta 1980

taaacaccaa ttaacgccag cggcggatgc gccgggttaa tcaatggccc cagcacattg 2040

aacagggtgc gggttttcag ttgctggcga accggcatcg cgtggcggaa tccggtgtga 2100

tacttcggcg caaagaggaa acatacacct aactcatcca gcgcctggcg cgatttatcg 2160

gcgttcatat caagattaat accgaacgcc gccagcagat cggacgaacc agatttactg 2220

gagacgctac ggttgccgtg tttcgccact ttcagcccac aggccgcggc gacaaacgca 2280

ctggcggtag aaatattgat actgttgctg ccgtcaccgc cagtaccgac gatatcagca 2340

aacagataat ccgggcgcgg gaacggcgct gcgttttcca gtagcgcggt tgctgccccg 2400

gcgatctcgt tcgggtgctc accgcgaatt ttcatgctca ccagcgccgc cgccagttgt 2460

tccggcttca gctcgccacg caccaccgct gaaaacagct ggtggctttc ttgttggcta 2520

agcgtctgcg cctgatacag tttttccaga atcggttgca gcgtgttggc tggctctagt 2580

ttctgctgcg cccaggccag cgtttgttcc agcaggcgag cgccctgggt ggtgagaatg 2640

gattccggat ggaactggaa tccacaaacg cgatccgcat cgtgacgtac tgccatcacc 2700

atgccattaa aatgggcgtt gatggttaaa ccggccggaa tgttactgcc aaccagcgag 2760

tgataacgcg ccaccggcag cgggtttgtt aatccggcaa acatcgcctg accgtcatgt 2820

tcaatgctgg aggctttacc gtggagaatt tcgcccgcct gaccgacata gcccccgtaa 2880

gcttcgacaa tcgcctgatg tccgaggcaa atgccaataa tgggcagctt gccacgcaag 2940

cgggtgagga gttccggcat acaaccggct tcgctcggca caccggggcc aggagaaagc 3000

atcagcaccg gattgctcat ggtcgccagg cgttcaatta aggtttgcgc cggaatatgg 3060

ttgcggtaaa tcaccacgtt atgcccattg ctgcgcaact gatctgccag gttgtacgta 3120

aaagagtcga tattatcgag cagcagaatg tcagccat 3158

<210> 3

<211> 1233

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60

caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120

gcgctggatg atgaacaatt aaaagaatcc atccgcgatg cccacttcat cggcctgcga 180

tcccgtaccc atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240

tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300

gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360

ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420

aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480

catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540

gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600

ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660

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gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840

ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900

caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960

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Claims (10)

1.一种生产L-色氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)FMME-TRPD-A，于2021年11月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC M 20211388。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌中，过表达了编码色氨酸生物合成路径中关键酶DAHP合酶的aroG基因、色氨酸操纵子中的结构基因TrpEDCBA基因和编码磷酸甘油脱氢酶的SerA基因。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，aroG基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，TrpEDCBA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SerA基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌抗L-色氨酸的反馈抑制。

5.权利要求1～4任一项所述的重组大肠杆菌在发酵生产L-色氨酸中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用是采用所述的重组大肠杆菌在发酵培养基中进行全有氧发酵，得到含有L-色氨酸的发酵液。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在所述的全有氧发酵过程中，进行分阶段控制溶氧，发酵0～6h控制溶氧为15～20％，发酵6～20h控制溶氧为20～25％，发酵20h至发酵结束控制溶氧为25～30％。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在所述的全有氧发酵过程中，初始培养基中葡萄糖耗尽时，流加葡萄糖，并控制葡萄糖浓度在1g/L以下。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基配方为：葡萄糖7～8g/L，柠檬酸1～3g/L，硫酸铵1.5～1.8g/L，磷酸氢二钾5.5～5.8g/L，七水硫酸镁1.8～2.2g/L，金属离子液0.8～1.2mL/L。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在所述的全有氧发酵过程中，pH控制在6.5～6.7，发酵温度控制在34～36℃。

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