CN115433745B - 一种提高l-色氨酸生产水平的方法 - Google Patents

一种提高l-色氨酸生产水平的方法 Download PDF

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Abstract

一种提高L‑色氨酸生产水平的方法，属于氨基酸发酵技术领域。为了解决现有技术中利用微生物发酵生产L‑色氨酸存在对色氨酸代谢过程有反馈抑制，造成产酸增长缓慢的问题，本发明在发酵罐运行中后期，增加了2‑4h的育晶过程，之后逐渐恢复到正常发酵条件，利用恒温培养+低温育晶+恒温培养的工艺模式，明显提高了产酸量和转化率，使得产酸量提高至51％以上，转化率提高至19.5％以上，提高了L‑色氨酸生产水平。

Description

一种提高L-色氨酸生产水平的方法
技术领域
本发明属于氨基酸发酵技术领域，具体涉及一种提高L-色氨酸生产水平的方法。
背景技术
L-色氨酸是一种必需氨基酸，广泛用作饲料和食品添加剂。L-色氨酸的生产最早主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是经过对于微生物代谢通路的不断研究，微生物发酵法生产L-色氨酸已经成为了色氨酸发酵的主要方法。
然而，目前发酵生产L-色氨酸存在多种技术问题，例如，L-色氨酸溶解度较低，在25℃时，100g水中溶解度为13.6g，在L-色氨酸发酵过程中，发酵罐培养温度36℃，当产酸超过24g/L左右时，发酵液中就会出现结晶，之后发酵过程色氨酸浓度一直呈过饱和状态，对色氨酸代谢过程有反馈抑制作用，造成产酸增长缓慢。因此通过对L-色氨酸生产工艺的优化设计，提高 L-色氨酸的生产水平是十分必要的。
发明内容
为了解决现有技术中利用微生物发酵生产L-色氨酸存在对色氨酸代谢过程有反馈抑制，造成产酸增长缓慢的问题，本发明提供了一种提高L-色氨酸生产水平的方法，所述方法为将产L-色氨酸的大肠杆菌种子液接种于发酵培养基中，流加浓度为50％-60％葡萄糖，于起始发酵温度32℃-36℃，初始搅拌频率300rpm，溶氧25％-40％，压力0.04-0.1Mpa，通风比0.5-1.5vvm，pH6.9-7.2条件进行发酵培养，持续发酵30-32h，且产酸量达到30-32g/L时，将发酵温度降至15℃-20℃，搅拌频率降至初始搅拌，通风量降低至当前通风量的一半，2-4h后恢复当前发酵条件。
进一步地限定，所述种子液由成分如下的种子培养基获得：玉米浆40-50g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉5-8g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁2-3g/L。
进一步地限定，所述种子液的培养条件为36℃，转速200-600rpm，溶解氧控制 30-40％，压力0.04-0.1MPa，通风比0.5-1.5vvm，培养时间为20h。
进一步地限定，所述发酵培养基的成分为葡萄糖7-12g/L，柠檬酸2-4g/L，磷酸氢二铵5-8g/L，氯化钾2-4g/L，酵母粉1-3g/L，硫酸镁1-2g/L，微量元素和生长因子；所述微量元素的组成为硫酸锰0.05-0.1g/L，硫酸亚铁0.05-0.1g/L，ZnSO4·H2O 0.05-0.1g/L；所述生长因子的组成为VB150-100μg/L，VH 40-50μg/L，复合氨基酸粉0.5-1g/L。
进一步地限定，所述葡萄糖流加浓度为60％。
进一步地限定，所述起始发酵温度为36℃。
进一步地限定，所述pH为7.0。
进一步地限定，所述产酸量达到32g/L时降低发酵温度。
进一步地限定，所述发酵温度降至20℃。
进一步地限定，4h后恢复初始发酵条件。
本发明的有益效果：
在发酵罐运转过程中，尝试通过控制发酵过程物理条件的变化，来改变色氨酸的结晶状态，使发酵液中色氨酸的饱和度发生变化，从而降低色氨酸的反馈抑制，提高产酸水平；
本发明在发酵罐运行中后期，增加了2-4h的育晶过程，之后逐渐恢复到正常发酵条件。在低温状态下，L-色氨酸溶解度进一步降低，L-色氨酸晶体的晶核会逐渐增大，而发酵液中色氨酸的浓度较之前低，对代谢途径的反馈作用减小。育晶过程结束后，随着发酵温度的回升，L-色氨酸的溶解度逐渐升高，同时菌体的色氨酸代谢速度也会增加，此时产酸水平会有明显的提升。本发明利用恒温培养+低温育晶+恒温培养的工艺模式，明显提高了产酸量和转化率，使得产酸量提高至51％以上，转化率提高至19.5％以上。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但不用以限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明使用的产色氨酸的大肠杆菌公开于申请号为2016111887431，发明名称为一种清液发酵培养基及提高L-色氨酸的方法的中国专利申请中，其保藏编号为CGMCCNO.11073。
实施例1：
(1)大肠杆菌菌液的制备：
将产L-色氨酸的大肠杆菌，从甘油管逐级扩培至茄子瓶，用200mL生理盐水将茄子瓶中的菌种洗脱下来，获得大肠杆菌菌液。扩培的条件为36℃恒温培养箱，培养20h。
(2)种子培养基的制备：
制备种子培养基，种子培养基的组成为玉米浆50g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉8g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁3g/L，将200mL步骤(1)获得的菌液接种于不锈钢发酵罐中，发酵罐中的种子培养基装液量为70％，种子培养的条件为36℃，转速200-600rpm，溶解氧控制30-40％，压力0.04-0.1MPa，通风比0.5-1.5vvm，培养时间为20h。
(3)发酵生产L-色氨酸：
制备发酵培养基，发酵培养基的组成为葡萄糖12g/L，柠檬酸4g/L，磷酸氢二铵8g/L，氯化钾4g/L，酵母粉3g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，ZnSO4·H2O0.1g/L，VB1100μg/L，VH 50μg/L，复合氨基酸粉1g/L。
将步骤(2)获得的种子液以20％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程中流加55％葡萄糖，控制菌体的生长及代谢，使用25％氨水自动控制维持pH6.9，发酵罐压力0.04-0.1 Mpa，通风比0.5-1.5vvm，培养温度34℃，转速300-600rpm，维持溶氧25-40％，维持发酵罐内糖浓度为0.001-0.01g/L，当发酵30h，产酸量达到30g/L时，将发酵温度降温至 20℃，同时搅拌变频降至初始搅拌，通风量降低至原通风量的一半，停止供糖和氨水，低温维持2h后，关闭发酵罐冷却水，逐渐通风和提升搅拌维持溶氧，恢复流加液糖和氨水，至发酵结束，总发酵时间43h左右，即得L-色氨酸发酵液。
发酵结束后，通过HPLC法对发酵液中L-色氨酸的含量进行检测，色氨酸含量52.5g/L，糖酸转化率20.2％。
实施例2：
(1)大肠杆菌菌液的制备：
将产L-色氨酸的大肠杆菌，从甘油管逐级扩培至茄子瓶，用200mL生理盐水将茄子瓶中的菌种洗脱下来，获得大肠杆菌菌液。扩培的条件为36℃恒温培养箱，培养20h。
(2)种子培养基的制备：
制备种子培养基，种子培养基的组成为玉米浆40g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁2g/L，将200mL步骤(1)获得的菌液接种于不锈钢发酵罐中，发酵罐中的种子培养基装液量为70％，种子培养的条件为36℃，转速200-400rpm，溶解氧控制35-50％，压力0.05-0.08MPa，通风比0.5-1.5vvm，培养时间为20h。
(3)发酵生产L-色氨酸：
制备发酵培养基，发酵培养基的组成为葡萄糖7g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵5g/L，氯化钾2g/L，酵母粉1g/L，硫酸镁1g/L，硫酸锰0.05g/L，硫酸亚铁0.05g/L，ZnSO4·H2O0.05g/L，VB150μg/L，VH 40μg/L，复合氨基酸粉0.5g/L。
将步骤(2)获得的种子液以20％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程中流加50％葡萄糖，控制菌体的生长及代谢，使用25％氨水自动控制维持pH7.2，发酵罐压力0.04-0.1 Mpa，通风比0.5-1.5vvm，培养温度36℃，转速300-600rpm，维持溶氧25-40％，维持发酵罐内糖浓度为0.001-0.01g/L，当发酵32h，产酸量达到32g/L时，将发酵温度降温至 15℃，同时搅拌变频降至初始搅拌，通风量降低至原通风量的一半，停止供糖和氨水，低温维持2h后，关闭发酵罐冷却水，逐渐通风和提升搅拌维持溶氧，恢复流加液糖和氨水，至发酵结束，总发酵时间43h左右，即得L-色氨酸发酵液。
发酵结束后，通过HPLC法对发酵液中L-色氨酸的含量进行检测，色氨酸含量51.2g/L，糖酸转化率19.5％。
实施例3：
(1)大肠杆菌菌液的制备：
将产L-色氨酸的大肠杆菌，从甘油管逐级扩培至茄子瓶，用200mL生理盐水将茄子瓶中的菌种洗脱下来，获得大肠杆菌菌液。扩培的条件为36℃恒温培养箱，培养20h。
(2)种子培养基的制备：
制备种子培养基，种子培养基的组成为玉米浆50g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉8g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁3g/L，将200mL步骤(1)获得的菌液接种于不锈钢发酵罐中，发酵罐中的种子培养基装液量为70％，种子培养的条件为36℃，转速200-600rpm，溶解氧控制30-40％，压力0.04-0.1MPa，通风比0.5-1.5vvm，培养时间为20h。
(3)发酵生产L-色氨酸：
制备发酵培养基，发酵培养基的组成为葡萄糖12g/L，柠檬酸4g/L，磷酸氢二铵8g/L，氯化钾4g/L，酵母粉3g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，ZnSO4·H2O0.1g/L，VB1100μg/L，VH 50μg/L，复合氨基酸粉1g/L。
将步骤(2)获得的种子液以20％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程中流加55％葡萄糖，控制菌体的生长及代谢，使用25％氨水自动控制维持pH6.9，发酵罐压力0.04-0.1Mpa，通风比0.5-1.5vvm，培养温度34℃，转速300-600rpm，维持溶氧25-40％，维持发酵罐内糖浓度为0.001-0.01g/L，当发酵30h，产酸量达到30g/L时，将发酵温度降温至20℃，同时搅拌变频降至初始搅拌，通风量降低至原通风量的一半，停止供糖和氨水，低温维持3h后，关闭发酵罐冷却水，逐渐通风和提升搅拌维持溶氧，恢复流加液糖和氨水，至发酵结束，总发酵时间43h左右，即得L-色氨酸发酵液。
发酵结束后，通过HPLC法对发酵液中L-色氨酸的含量进行检测，色氨酸含量53.0g/L，糖酸转化率20.6％。
实施例4：
(1)大肠杆菌菌液的制备：
将产L-色氨酸的大肠杆菌，从甘油管逐级扩培至茄子瓶，用200mL生理盐水将茄子瓶中的菌种洗脱下来，获得大肠杆菌菌液。扩培的条件为36℃恒温培养箱，培养20h。
(2)种子培养基的制备：
制备种子培养基，种子培养基的组成为玉米浆40g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁2g/L，将200mL步骤(1)获得的菌液接种于不锈钢发酵罐中，发酵罐中的种子培养基装液量为70％，种子培养的条件为36℃，转速200-400rpm，溶解氧控制35-50％，压力0.05-0.08MPa，通风比0.5-1.5vvm，培养时间为20h。
(3)发酵生产L-色氨酸：
制备发酵培养基，发酵培养基的组成为葡萄糖7g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵5g/L，氯化钾2g/L，酵母粉1g/L，硫酸镁1g/L，硫酸锰0.05g/L，硫酸亚铁0.05g/L，ZnSO4·H2O0.05g/L，VB150μg/L，VH 40μg/L，复合氨基酸粉0.5g/L。
将步骤(2)获得的种子液以20％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程中流加50％葡萄糖，控制菌体的生长及代谢，使用25％氨水自动控制维持pH7.2，发酵罐压力0.04-0.1 Mpa，通风比0.5-1.5vvm，培养温度32℃，转速300-600rpm，维持溶氧25-40％，维持发酵罐内糖浓度为0.001-0.01g/L，当发酵32h，产酸量达到32g/L时，将发酵温度降温至 18℃，同时搅拌变频降至初始搅拌，通风量降低至原通风量的一半，停止供糖和氨水，低温维持3h后，关闭发酵罐冷却水，逐渐通风和提升搅拌维持溶氧，恢复流加液糖和氨水，至发酵结束，总发酵时间43h左右，即得L-色氨酸发酵液。
发酵结束后，通过HPLC法对发酵液中L-色氨酸的含量进行检测，色氨酸含量52.3g/L，糖酸转化率20.3％。
实施例5：
(1)大肠杆菌菌液的制备：
将产L-色氨酸的大肠杆菌，从甘油管逐级扩培至茄子瓶，用200mL生理盐水将茄子瓶中的菌种洗脱下来，获得大肠杆菌菌液。扩培的条件为36℃恒温培养箱，培养20h。
(2)种子培养基的制备：
制备种子培养基，种子培养基的组成为玉米浆50g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉8g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁3g/L，将200mL步骤(1)获得的菌液接种于不锈钢发酵罐中，发酵罐中的种子培养基装液量为70％，种子培养的条件为36℃，转速200-600rpm，溶解氧控制30-40％，压力0.04-0.1MPa，通风比0.5-1.5vvm，培养时间为20h。
(3)发酵生产L-色氨酸：
制备发酵培养基，发酵培养基的组成为葡萄糖12g/L，柠檬酸4g/L，磷酸氢二铵8g/L，氯化钾4g/L，酵母粉3g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，ZnSO4·H2O0.1g/L，VB1100μg/L，VH 50μg/L，复合氨基酸粉1g/L。
将步骤(2)获得的种子液以20％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程中流加55％葡萄糖，控制菌体的生长及代谢，使用25％氨水自动控制维持pH6.9，发酵罐压力0.04-0.1 Mpa，通风比0.5-1.5vvm，培养温度34℃，转速300-600rpm，维持溶氧25-40％，维持发酵罐内糖浓度为0.001-0.01g/L，当发酵30h，产酸量达到30g/L时，将发酵温度降温至 15℃，同时搅拌变频降至初始搅拌，通风量降低至原通风量的一半，停止供糖和氨水，低温维持4h后，关闭发酵罐冷却水，逐渐通风和提升搅拌维持溶氧，恢复流加液糖和氨水，至发酵结束，总发酵时间43h左右，即得L-色氨酸发酵液。
发酵结束后，通过HPLC法对发酵液中L-色氨酸的含量进行检测，色氨酸含量52.1g/L，糖酸转化率20.2％。
实施例6：
(1)大肠杆菌菌液的制备：
将产L-色氨酸的大肠杆菌，从甘油管逐级扩培至茄子瓶，用200mL生理盐水将茄子瓶中的菌种洗脱下来，获得大肠杆菌菌液。扩培的条件为36℃恒温培养箱，培养20h。
(2)种子培养基的制备：
制备种子培养基，种子培养基的组成为玉米浆40g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁2g/L，将200mL步骤(1)获得的菌液接种于不锈钢发酵罐中，发酵罐中的种子培养基装液量为70％，种子培养的条件为36℃，转速200-400rpm，溶解氧控制35-50％，压力0.05-0.08MPa，通风比0.5-1.5vvm，培养时间为20h。
(3)发酵生产L-色氨酸：
制备发酵培养基，发酵培养基的组成为葡萄糖7g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵5g/L，氯化钾2g/L，酵母粉1g/L，硫酸镁1g/L，硫酸锰0.05g/L，硫酸亚铁0.05g/L，ZnSO4·H2O0.05g/L，VB150μg/L，VH 40μg/L，复合氨基酸粉0.5g/L。
将步骤(2)获得的种子液以20％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程中流加50％葡萄糖，控制菌体的生长及代谢，使用25％氨水自动控制维持pH7.2，发酵罐压力0.04-0.1 Mpa，通风比0.5-1.5vvm，培养温度36℃，转速300-600rpm，维持溶氧25-40％，维持发酵罐内糖浓度为0.001-0.01g/L，当发酵32h，产酸量达到32g/L时，将发酵温度降温至 20℃，同时搅拌变频降至初始搅拌，通风量降低至原通风量的一半，停止供糖和氨水，低温维持4h左右后，关闭发酵罐冷却水，逐渐通风和提升搅拌维持溶氧，恢复流加液糖和氨水，至发酵结束，总发酵时间43h左右，即得L-色氨酸发酵液。
发酵结束后，通过HPLC法对发酵液中L-色氨酸的含量进行检测，色氨酸含量53.7g/L，糖酸转化率21.0％。
实施例7：
(1)大肠杆菌菌液的制备：
将产L-色氨酸的大肠杆菌，从甘油管逐级扩培至茄子瓶，用200mL生理盐水将茄子瓶中的菌种洗脱下来，获得大肠杆菌菌液。扩培的条件为36℃恒温培养箱，培养20h。
(2)种子培养基的制备：
制备种子培养基，种子培养基的组成为玉米浆45g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉6.5g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁2.5g/L，将200mL步骤(1)获得的菌液接种于不锈钢发酵罐中，发酵罐中的种子培养基装液量为70％，种子培养的条件为36℃，转速200-400rpm，溶解氧控制30-40％，压力0.04-0.1MPa，通风比0.5-1.5vvm，培养时间为20h。
(3)发酵生产L-色氨酸：
制备发酵培养基，发酵培养基的组成为葡萄糖10g/L，柠檬酸3g/L，磷酸氢二铵6.5g/L，氯化钾3g/L，酵母粉2g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸锰0.07g/L，硫酸亚铁0.07g/L， ZnSO4·H2O 0.07g/L，VB175μg/L，VH 45μg/L，复合氨基酸粉0.7g/L。
将步骤(2)获得的种子液以20％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程中流加55％葡萄糖，控制菌体的生长及代谢，使用25％氨水自动控制维持pH7.0，发酵罐压力0.04-0.1Mpa，通风比0.5-1.5vvm，培养温度34℃，转速300-600rpm，维持溶氧25-40％，维持发酵罐内糖浓度为0.001-0.01g/L，当发酵31h，产酸量达到31g/L时，将发酵温度降温至20℃，同时搅拌变频降至初始搅拌，通风量降低至原通风量的一半，停止供糖和氨水，低温维持4h左右后，关闭发酵罐冷却水，逐渐通风和提升搅拌维持溶氧，恢复流加液糖和氨水，至发酵结束，总发酵时间43h左右，即得L-色氨酸发酵液。
发酵结束后，通过HPLC法对发酵液中L-色氨酸的含量进行检测，色氨酸含量53.2g/L，糖酸转化率20.8％。
实施例8：
(1)大肠杆菌菌液的制备：
将产L-色氨酸的大肠杆菌，从甘油管逐级扩培至茄子瓶，用200mL生理盐水将茄子瓶中的菌种洗脱下来，获得大肠杆菌菌液。扩培的条件为36℃恒温培养箱，培养20h。
(2)种子培养基的制备：
制备种子培养基，种子培养基的组成为玉米浆45g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉6.5g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁2.5g/L，将200mL步骤(1)获得的菌液接种于不锈钢发酵罐中，发酵罐中的种子培养基装液量为70％，种子培养的条件为36℃，转速200-400rpm，溶解氧控制30-40％，压力0.04-0.1MPa，通风比0.5-1.5vvm，培养时间为20h。
(3)发酵生产L-色氨酸：
制备发酵培养基，发酵培养基的组成为葡萄糖10g/L，柠檬酸3g/L，磷酸氢二铵6.5g/L，氯化钾3g/L，酵母粉2g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸锰0.07g/L，硫酸亚铁0.07g/L， ZnSO4·H2O 0.07g/L，VB175μg/L，VH 45μg/L，复合氨基酸粉0.7g/L。
将步骤(2)获得的种子液以20％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程中流加60％葡萄糖，控制菌体的生长及代谢，使用25％氨水自动控制维持pH7.0，发酵罐压力0.04-0.1 Mpa，通风比0.5-1.5vvm，培养温度36℃，转速300-600rpm，维持溶氧25-40％，维持发酵罐内糖浓度为0.001-0.01g/L，当发酵32h，产酸量达到32g/L时，将发酵温度降温至 20℃，同时搅拌变频降至初始搅拌，通风量降低至原通风量的一半，停止供糖和氨水，低温维持4h左右后，关闭发酵罐冷却水，逐渐通风和提升搅拌维持溶氧，恢复流加液糖和氨水，至发酵结束，总发酵时间43h左右，即得L-色氨酸发酵液。
发酵结束后，通过HPLC法对发酵液中L-色氨酸的含量进行检测，色氨酸含量53.8g/L，糖酸转化率21.5％。
对比例：
(1)大肠杆菌菌液的制备：
将产L-色氨酸的大肠杆菌，从甘油管逐级扩培至茄子瓶，用200mL生理盐水将茄子瓶中的菌种洗脱下来，获得大肠杆菌菌液。扩培的条件为36℃恒温培养箱，培养20h。
(2)种子培养基的制备：
制备种子培养基，种子培养基的组成为玉米浆45g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉6.5g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁2.5g/L，将200mL步骤(1)获得的菌液接种于不锈钢发酵罐中，发酵罐中的种子培养基装液量为70％，种子培养的条件为36℃，转速200-400rpm，溶解氧控制30-40％，压力0.04-0.1MPa，通风比0.5-1.5vvm，培养时间为20h。
(3)发酵生产L-色氨酸：
制备发酵培养基，发酵培养基的组成为葡萄糖10g/L，柠檬酸3g/L，磷酸氢二铵6.5g/L，氯化钾3g/L，酵母粉2g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸锰0.07g/L，硫酸亚铁0.07g/L，ZnSO4·H2O 0.07g/L，VB175μg/L，VH 45μg/L，复合氨基酸粉0.7g/L。
将步骤(2)获得的种子液以20％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程中流加60％葡萄糖，控制菌体的生长及代谢，使用25％氨水自动控制维持pH7.0，发酵罐压力0.04-0.1 Mpa，通风比0.5-1.5vvm，培养温度36℃，转速300-600rpm，维持溶氧25-40％，维持发酵罐内糖浓度为0.001-0.01g/L，直至发酵结束，对照组发酵总时长40h左右，即得L-色氨酸发酵液。
发酵结束后，通过HPLC法对发酵液中L-色氨酸的含量进行检测，色氨酸含量38.5g/L，糖酸转化率16.2％。
由上述各实施例和对比例获得的发酵结果可知，相比于对比例，本发明利用恒温培养 +低温育晶+恒温培养的工艺模式，明显提高了色氨酸产量和糖酸转化率，使得产酸量提高至51％以上，转化率提高至19.5％以上。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高L-色氨酸生产水平的方法，其特征在于，所述方法为将产L-色氨酸的大肠杆菌种子液接种于发酵培养基中，流加浓度为50％-60％的葡萄糖，于起始发酵温度32℃-36℃，初始搅拌频率300rpm，溶氧25％-40％，压力0.04-0.1Mpa，通风比0.5-1.5vvm，pH6.9-7.2条件进行发酵培养，持续发酵30-32h，且产酸量达到30-32g/L时，将发酵温度降至15℃-20℃，搅拌频率降至初始搅拌，通风量降低至当前通风量的一半，2-4h后恢复当前发酵条件。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子液由成分如下的种子培养基获得：玉米浆40-50g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉5-8g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁2-3g/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子液的培养条件为36℃，转速200-600rpm，溶解氧控制30-40％，压力0.04-0.1MPa，通风比0.5-1.5vvm，培养时间为20h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分为葡萄糖7-12g/L，柠檬酸2-4g/L，磷酸氢二铵5-8g/L，氯化钾2-4g/L，酵母粉1-3g/L，硫酸镁1-2g/L，微量元素和生长因子；所述微量元素的组成为硫酸锰0.05-0.1g/L，硫酸亚铁0.05-0.1g/L，ZnSO4·H2O 0.05-0.1g/L；所述生长因子的组成为VB150-100μg/L，VH 40-50μg/L，复合氨基酸粉0.5-1g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖流加浓度为60％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述起始发酵温度为36℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH为7.0。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产酸量达到32g/L时降低发酵温度。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵温度降至20℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，4h后恢复初始发酵条件。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0592944A (ja) * 1991-07-16 1993-04-16 Ajinomoto Co Inc アミノ酸・核酸またはその誘導体の製造方法
CN103627743A (zh) * 2013-12-18 2014-03-12 江苏江山制药有限公司 提高l-色氨酸发酵产量的方法
CN105087703A (zh) * 2015-08-06 2015-11-25 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 L-色氨酸的发酵生产方法
WO2017197887A1 (zh) * 2016-05-17 2017-11-23 河南巨龙生物工程股份有限公司 大肠埃希氏菌JLTrp及其在生产L-色氨酸中的应用
CN108410918A (zh) * 2018-03-27 2018-08-17 河南巨龙生物工程股份有限公司 一种色氨酸发酵培养基及色氨酸发酵方法
CN110387387A (zh) * 2019-06-27 2019-10-29 华东理工大学青岛创新研究院 一种重组大肠杆菌产l-色氨酸的发酵工艺
CN114085801A (zh) * 2021-11-29 2022-02-25 江南大学 一株生产l-色氨酸的重组大肠杆菌及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0592944A (ja) * 1991-07-16 1993-04-16 Ajinomoto Co Inc アミノ酸・核酸またはその誘導体の製造方法
CN103627743A (zh) * 2013-12-18 2014-03-12 江苏江山制药有限公司 提高l-色氨酸发酵产量的方法
CN105087703A (zh) * 2015-08-06 2015-11-25 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 L-色氨酸的发酵生产方法
WO2017197887A1 (zh) * 2016-05-17 2017-11-23 河南巨龙生物工程股份有限公司 大肠埃希氏菌JLTrp及其在生产L-色氨酸中的应用
CN108410918A (zh) * 2018-03-27 2018-08-17 河南巨龙生物工程股份有限公司 一种色氨酸发酵培养基及色氨酸发酵方法
CN110387387A (zh) * 2019-06-27 2019-10-29 华东理工大学青岛创新研究院 一种重组大肠杆菌产l-色氨酸的发酵工艺
CN114085801A (zh) * 2021-11-29 2022-02-25 江南大学 一株生产l-色氨酸的重组大肠杆菌及其应用

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