CN112481325A

CN112481325A - 一种利用粘质沙雷氏菌流加葡萄糖生产组氨酸的方法

Info

Publication number: CN112481325A
Application number: CN202011490594.0A
Authority: CN
Inventors: 张宗华; 冯世红; 边恩来; 庄会华; 刘福玲
Original assignee: Xinjiang Fufeng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xinjiang Fufeng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-17
Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2021-03-12

Abstract

本发明涉及一种利用粘质沙雷氏菌流加葡萄糖生产组氨酸的方法，属于微生物发酵技术领域，将所述粘质沙雷氏菌，经过活化培养、种子培养，所得种子液接入发酵培养基进行发酵培养。采用本方法生产的组氨酸生产量高，糖酸转化率高，且发酵过程用时短，大大提高了生产效率。

Description

一种利用粘质沙雷氏菌流加葡萄糖生产组氨酸的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用粘质沙雷氏菌流加葡萄糖生产组氨酸的方法。

背景技术

组氨酸化学名α-氨基β-咪唑基丙酸，属于碱性氨基酸或杂环氨基酸，分子式为C₆H₉N₃O₂，相对分子量155，呈无色片状或针状结晶，无臭，稍有苦味，在营养学的范畴里，组氨酸被认为是一种人类必需的氨基酸，主要是儿童。组氨酸是一种重要的功能性氨基酸，具有抗炎、抗氧化和免疫调节等多种生理功能，在医药、保健食品和饲料行业有着广阔的应用前景。血粉等蛋白原料的水解提取是目前组氨酸

的主要生产方法，但是原料不易得，设备损失率高等因素制约了此法的生产规模，很难满足日益增长的组氨酸市场需求。而发酵法生产氨基酸具有原料来源广泛，反应所需能耗低，环境友好等优点，适合工业化生产，成为组氨酸生产研究的主流方向。

发明内容

本发明提供了一种利用粘质沙雷氏菌流加葡萄糖生产组氨酸的方法，该方法将所述粘质沙雷氏菌，经过活化培养、种子培养，所得种子液接入发酵培养基进行发酵培养。采用本方法生产的组氨酸生产量高，糖酸转化率高，且发酵过程用时短，大大提高了生产效率。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

一种利用粘质沙雷氏菌流加葡萄糖生产组氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1）将粘质沙雷氏菌种子液接入含有发酵培养基的发酵培养罐中，控制发酵培养罐中液体体积为50L，控制发酵培养条件温度33℃，pH7.0、转速80rpm、压力0.05MPa；

2）整个发酵过程中，流加磷酸氢二钾水溶液，流加流速为20ml/h，直至发酵结束；发酵培养6h后，开始流加发酵促进剂，流加流速为0.5L/h，直至发酵结束；发酵总时间为52h。

优选地，所述发酵促进剂包含葡萄糖100-1000g/L，乙酸钙10-100mg/L。

优选地，所述发酵培养基成分为：葡萄糖70g/L、酵母粉5g/L、甜菜碱1.5g/L、磷酸氢二钾5g/L、玉米浆40ml/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁0.5g/L、生物素0.15mg/L、维生素B₁0.15mg/L。

优选地，所述磷酸氢二钾水溶液的浓度为100g/L。

优选地，所述发酵促进剂包含葡萄糖100-1000g/L，乙酸钙10-100mg/L，丙二酸10-50mg/L。

更优选地，所述发酵促进剂包含葡萄糖500g/L，乙酸钙100mg/L，丙二酸50mg/L。

最优选地，所述发酵促进剂的组分为：葡萄糖500g/L，乙酸钙100mg/L，丙二酸50mg/L。

附图说明

图1：乙酸钙对发酵液中组氨酸产量的影响；

图2：丙二酸对发酵液中组氨酸产量的影响。

本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于下几个方面：

采用本发明经过活化培养的粘质沙雷氏菌进行组氨酸生产，发酵过程通过流加葡萄糖以及磷酸氢二钾，有效补充了氮源以及菌株生长所需要的营养物质，维持了菌株的生长活力，发酵产酸性能大幅提升减少菌体繁殖消耗葡萄糖，增加糖酸转化率，经检测，该方法组氨酸的产量和糖酸转化率大幅提高，其中，糖酸转化率可以达到13％以上，且发酵过程用时仅为50h左右，大大提高了生产效率。

不同菌株的产酸机制以及对刺激因子的耐受程度差异较大，并不具备借鉴意义，尽管现有技术对谷氨酸的产酸机制作了较多研究，例如在发酵培养基中添加适量的柠檬酸钠能够提高谷氨酸棒杆菌产组氨酸的量，但是柠檬酸钠对粘质沙雷氏菌并无明显刺激效果。

组氨酸的发酵过程并不依赖TCA途径，适当弱化TCA途径能够提高进入组氨酸合成途径的代谢流，但是TCA循环维持菌体细胞的正常增殖和代谢，并不能过度削弱。丙二酸可作为TCA循环的抑制剂，通过弱化TCA循环，能够提高组氨酸合成途径代谢流，进而提高组氨酸的产量。

L-组氨酸是HMP途径的中间产物，HMP途径同样会产生乙酸类副产物，从而造成碳代谢流的浪费，通过添加乙酸钙，对副产物产生一定的抑制作用，从而使得HMP途径更多的代谢流进入组氨酸合成途径，为组氨酸的生物合成提供更多的前提物质，从而提升了组氨酸的产量。

选择在发酵中期开始流加，这是因为是组氨酸的大量合成发生在发酵中期，而且，发酵初期以菌株增殖为主，此时弱化TCA途径会降低菌株活力。

控制葡萄糖的摄入速率对L-组氨酸发酵具有重要意义，发酵初期葡萄糖浓度过高，会造成乙酸产量增加，但是浓度过低不利于菌株增殖；发酵中后期保持较低葡萄糖的摄入速率有利于抑制乙酸等副产物的生成，达到控制乙酸生长，并且保持菌株增殖效率的目的。

本发明通过在发酵中期流加磷酸氢二钾，有效补充了菌株生长所需要的营养物质，维持了菌株的生长活力，发酵产酸性能大幅提升，本发明补入的糖能够快速均匀分布到发酵液中，有效的解决了糖局部浓度过高造成发酵液渗透压过和过多的乙酸等副产物，同时也解决了发酵液中局部葡萄糖浓度过低而使底物限制，使发酵液中的残糖迅速耗尽，导致菌种生产能力不能得到最大限度发挥的问题，这一方面加快了菌种的生长速率，另一方面避免了工艺参数调整过快，糖补入量过多，造成发酵失控。

本发明采用微生物发酵法生产L-组氨酸，在生产过程中具有操作简便、反应条件相对温和、副产物少、污染少且容易处理等优点。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种利用粘质沙雷氏菌流加葡萄糖生产组氨酸的方法，包括如下步骤：

1）将粘质沙雷氏菌（ATCC31026）放入活化培养基，恒温培养箱保持温度在33℃恒温培养24h，活化培养基配方为无水葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠2.5g/L、琼脂条20g/L，得到活化培养液。在移入菌株之前，对种子罐投料后加水定容，定容体积为5L，直接接入蒸汽加热至119-122℃，压力为0.13-0.14MPa，保温30min，进行灭菌处理；

2）将所得的活化培养液通过压差法接入灭菌完成后的种子培养罐中，液体体积为5L，保持控制培养条件初始温度33℃、pH7.0、搅拌电机转速80rpm、风量70m³/h、压力0.05MPa，连续培养16h。控制料液成分为葡萄糖35g/L、酵母粉5g/L、甜菜碱1.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、玉米浆30ml/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁0.4g/L、生物素0.15mg/L、维生素B10.15mg/L。

3）在发酵开始时对磷酸氢二钾于发酵进行流加，磷酸氢二钾的浓度为100g/L，流加流速为1.5ml/h，在发酵培养5h后葡萄糖开始流加，葡萄糖浓度为500g/L，流加流速为0.1L/h，直至发酵结束，连续培养16h。

4）经检测种子灌OD值达到20.3后进行移种，按照10%的接种量接入发酵培养罐。发酵培养罐中液体体积为50L，控制发酵培养条件温度33℃，pH7.0、搅拌电机转速80rpm,、风量400m³/h、压力0.05MPa。

5）控制发酵培养基成分葡萄糖70g/L、酵母粉5g/L、甜菜碱1.5g/L、磷酸氢二钾5g/L、玉米浆40ml/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁0.5g/L、生物素0.15mg/L、维生素B1 0.15mg/L。在发酵开始时对磷酸氢二钾于发酵进行流加，磷酸氢二钾的浓度为100g/L，流加流速为20ml/h，在发酵培养6h，然后开始流加发酵促进剂（葡萄糖500g/L，乙酸钙100mg/L，丙二酸50mg/L），流加流速为0.5L/h，直至发酵结束，发酵总时间为52h，组氨酸产量达到38.7g/L。

对比例1

3）将所得的活化培养液通过压差法接入灭菌完成后的种子培养罐中，液体体积为5L，保持控制培养条件初始温度33℃、pH7.0、搅拌电机转速80rpm、风量70m³/h、压力0.05MPa，连续培养16h。控制料液成分为葡萄糖35g/L、酵母粉5g/L、甜菜碱1.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、玉米浆30ml/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁0.4g/L、生物素0.15mg/L、维生素B10.15mg/L。

4）在发酵开始时对磷酸氢二钾于发酵进行流加，磷酸氢二钾的浓度为100g/L，流加流速为1.5ml/h，在发酵培养5h后葡萄糖开始流加，葡萄糖浓度为500g/L，流加流速为0.1L/h，直至发酵结束，连续培养16h。经检测种子灌OD值达到20.3后进行移种，按照10%的接种量接入发酵培养罐。

发酵培养罐中液体体积为50L，控制发酵培养条件温度33℃，pH7.0、搅拌电机转速80rpm,、风量400m³/h、压力0.05MPa。

5）控制发酵培养基成分葡萄糖70g/L、酵母粉5g/L、甜菜碱1.5g/L、磷酸氢二钾5g/L、玉米浆40ml/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁0.5g/L、生物素0.15mg/L、维生素B1 0.15mg/L。在发酵开始时对磷酸氢二钾于发酵进行流加，磷酸氢二钾的浓度为100g/L，流加流速为20ml/h，在发酵培养6h，然后开始流加发酵促进剂（葡萄糖500g/L），流加流速为0.5L/h，直至发酵结束，发酵总时间为52h，组氨酸产量达到22.1g/L。

实施例2

1．工艺同对比例1，在对比例1的基础上对发酵促进剂进行优化，设置不同浓度的乙酸钙（横坐标），分别为0，20，40，60，80，100，120，140，单位为mg/L，如图1所示，随着乙酸钙浓度的增加，发酵液中组氨酸含量（纵坐标，g/L）也随之提高，当乙酸钙浓度达到100mg/L时，组氨酸浓度达到峰值，继续增加乙酸钙浓度对组氨酸产量没有明显影响，糖酸转化率和组氨酸的趋势一致，说明乙酸钙主要是通过提高粘质沙雷氏菌的糖酸转化率来提升组氨酸的产量，可能原因是，L-组氨酸是HMP途径的中间产物，HMP途径同样会产生乙酸类副产物，从而造成碳代谢流的浪费，通过添加合适浓度的乙酸钙，对副产物产生一定的抑制作用，从而使得HMP途径更多的代谢流进入组氨酸合成途径，为组氨酸的生物合成提供更多的前提物质，从而提升了组氨酸的产量；而且钙离子也是组氨酸合成中所需酶的激活剂。

2.选择乙酸钙的浓度为100mg/L，继续评价丙二酸对发酵液中组氨酸产量的影响。设置不同浓度的乙酸钙，分别为0，10，20，30，40，50，60，70，单位为mg/L，如图2所示，随着丙二酸浓度的增加，发酵液中组氨酸含量也随之提高，当乙酸钙浓度达到50mg/L时，组氨酸浓度接近峰值，继续增加乙酸钙对组氨酸产量没有实质的影响，糖酸转化率和组氨酸的趋势也基本保持一致，可能原因是，组氨酸的发酵过程并不依赖TCA途径，适当弱化TCA途径能够提高进入组氨酸合成途径的代谢流，但是TCA循环维持菌体细胞的正常增殖和代谢，并不能过度削弱，因此需要选择在发酵中期开始流加，这是因为是组氨酸的大量合成发生在发酵中期，而且在发酵初期主要以菌株增殖为主，此时弱化TCA途径会降低菌株活力。适量丙二酸可作为TCA循环的抑制剂，通过弱化TCA循环，能够提高组氨酸合成途径代谢流，进而提高糖酸转化率和组氨酸的产量。

以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用粘质沙雷氏菌流加葡萄糖生产组氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵促进剂包含葡萄糖100-1000g/L，乙酸钙10-100mg/L。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为：葡萄糖70g/L、酵母粉5g/L、甜菜碱1.5g/L、磷酸氢二钾5g/L、玉米浆40ml/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁0.5g/L、生物素0.15mg/L、维生素B₁ 0.15mg/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸氢二钾水溶液的浓度为100g/L。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵促进剂包含葡萄糖100-1000g/L，乙酸钙10-100mg/L，丙二酸10-50mg/L。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵促进剂包含葡萄糖500g/L，乙酸钙100mg/L，丙二酸50mg/L。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵促进剂的组分为：葡萄糖500g/L，乙酸钙100mg/L，丙二酸50mg/L。