CN113214160A - 一种无氨氮排放高效纯化组氨酸原料药的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无氨氮排放高效纯化组氨酸原料药的方法，属于生物医药领域。本发明将发酵液经过超滤膜过滤、阳离子交换树脂进行吸附、针对柱子中未吸附的组氨酸发酵清液用水压柱，水洗结束后，用氢氧化钠溶液进行洗脱，利用电导率来判断收集液的终点，将收集液用电渗析除盐；再利用活性碳两次脱色，得到成品。本发明利用氢氧化钠替代氨水进行洗脱，不排放含氨氮的废水；利用电导率来判断收集液的终点。

Description

一种无氨氮排放高效纯化组氨酸原料药的方法
技术领域
本发明涉及一种无氨氮排放高效纯化组氨酸原料药的方法，属于生物医药领域。
背景技术
原料药，是用于生产各类制剂的原料药物，是制剂中的有效成份，是由化学合成、植物提取或者生物技术所制备的各种用来作为药用的粉末、结晶、浸膏等，但病人无法直接服用。原料药只有加工成为药物制剂，才能成为可供临床应用的医药。原料药质量好坏决定制剂质量的好坏，因此其质量标准要求很严，世界各国对于其广泛应用的原料药都制订了严格的国家药典标准和质量控制方法。
组氨酸是一种α-氨基酸，化学式为C6H9N3O2，分子量为155。存在于香蕉，葡萄，肉类，禽畜，牛奶以及奶类制品中。组氨酸可作为生化试剂和药剂，还可用于治疗心脏病，贫血，风湿性关节炎等。
目前，制备组氨酸的方法主要有化学法和生物发酵法。其中，生物发酵法主要是利用粘质沙雷氏菌，以葡萄糖为底物，经过50h时间的发酵产酸，然后经过膜除菌、离子交换等步骤分离提取步骤得到组氨酸。
在制备组氨酸原料药的过程中，需要用到离子交换对组氨酸发酵液进行纯化，而在离子交换处理的过程中，需要采用氨水进行洗脱，直接产生含氨氮的废水。氨氮废水需要经过进一步的处理才能排放，这对企业来说是很大的负担，如何减少氨氮废水的排放，是企业一直想要解决的问题。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是在利用离子交换法从发酵液中纯化组氨酸的过程中，需要采用氨酸进行洗脱，这将产生含氨氮的废水，增加企业的废水处理负担。
[技术方案]
本发明提供一种无氨氮排放高效纯化组氨酸原料药的方法，包括以下步骤：
(1)将发酵液经过超滤膜过滤除去菌体得到发酵清液；所述发酵液是指利用粘质沙雷氏菌以葡萄糖为底物进行发酵得到的发酵液；
(2)将发酵清液上732阳离子交换树脂进行吸附，发酵清液的流速为8-10L/h；
(3)吸附饱和后，针对柱子中未吸附的组氨酸发酵清液用水压柱，水洗速度为8-10L/h，收集水洗液；
(4)水洗结束后，用浓度为1～2％的氢氧化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为7～8L/h，收集电导率小于1000us/cm的洗脱液，即A液，收集1000us/cm＜电导＜5000us/cm的洗脱液，即为B1液；
(5)将B1液用电渗析除盐；
(6)将A液、电渗析处理后的B1液合并，得到E液；
(7)取E液，向其中加入10-20％活性炭于55-60℃脱色30-60min，将脱色液进行浓缩结晶得到粗品；
(8)取粗品，向其中加入15-20倍质量的水，加入0.05％-0.3％的亚硫酸钠、10-20％的活性炭，于55-60℃脱色30-60min，将二次脱色液浓缩结晶得到成品。
在本发明的一种实施方式中，所述电渗析，是将用等体积的纯水对待处理的溶液进行除盐。
[有益效果]
本发明利用氢氧化钠替代氨水进行洗脱，因此，不会排放含氨氮的废水。
由于组氨酸是碱性氨基酸，洗脱时，无法通过pH准确判断收集液终点，因此，本发明利用电导率来判断收集液的终点。
本发明将超过洗脱终点后流出的含组氨酸的洗脱液通过电膜除盐，得到纯净的组氨酸料液，提高组氨酸的总收率。
具体实施方式
下面结合具体实施例和对比例，对本发明进行进一步的阐述。
组氨酸的检测方法(目测法)：
1)溶液制备
展开剂的配制：正丁醇：冰醋酸：水＝6.17：2.86：2；将1g/L茚三酮加入配制好的展开剂中，混合充分溶解。
组氨酸标准溶液：0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L、1.25g/L、1.5g/L、1.75、g/L、2.0g/L、2.25g/L、2.5g/L、2.75g/L、3.0g/L、3.25g/L、3.5g/L组氨酸标准溶液。
2)发酵液或洗脱液中组氨酸含量的检测
将发酵液于10000rpm离心2min，取上清液稀释10倍，取稀释好的样品清液0.6μl，通过颜色深浅的比较，与含量相近的标准样品一起点在硅胶板上，电吹风吹干。放在盛有展开剂的层析缸中，展开至顶端处取出，大约30min，在75℃烘箱内烘干约5min，取出目视比色确定样品含量。
3)注意事项：
层析纸的准备：裁取6.8cm长、5cm宽的硅胶板，在距离硅胶板短边线1cm处用铅笔画一条直线，每隔0.5cm设一点样点(共8个)，写上点样标记。
点样：点样斑点控制直径在2mm内，点样时尽量靠近但不要戳破硅胶板。
展开：将点好样的硅胶板装有约5mm深展开剂的层析缸内，当展开剂前沿上行至距离硅胶板顶端1cm时取出，置于烘箱内烘干，约20min。
硅胶板使用前应先放100℃烘箱内烘干30min，然后取出使用(避免因潮湿引起的检测异常)。
组氨酸发酵：利用粘质沙雷氏菌以葡萄糖为底物进行发酵，发酵条件培养温度30-35℃，溶氧10-40％，罐压0.1Mpa；培养基配方如下表1所示：
表1
序号 原料名称 配比(g/L)
1 葡萄糖 40
2 硫酸镁 0.5
3 甜菜碱 1.0
4 磷酸氢二钾 1.2
5 玉米浆干粉 18.0
6 柠檬酸 2.0
7 硫酸铵 5.0
8 酵母浸粉 5.0
9 泡敌 0.8mL/L
10 硫酸锰 1mg/L
11 硫酸亚铁 5mg/L
12 生物素 0.2mg/L
13 VB1 0.2mg/L
实施例1
(1)取70L组氨酸发酵液经超滤膜过滤除去菌体得到的发酵清液，
(2)将发酵清液上14L的732阳离子交换树脂进行吸附(填料：WA-2、柱子规模型号14L)，发酵清液的流速即吸附速度为9L/h(经检测，共吸附组氨酸量1120g)；
(3)当出柱液经吲哚醌快速点样显色即可判断为达到了吸附饱和，柱子中未吸附的组氨酸发酵清液用水压柱，水洗速度为9L/h，得水洗液28L，水洗液中组氨酸含量为1％(g/100mL)，共280g；
(4)水洗结束后，用浓度为1％(g/100mL)氢氧化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为8L/h，得到35L A液(电导＜1000us/cm，洗脱终点)，A液中组氨酸的含量为3％，即1050g组氨酸；得到10L B1液(多余的氢氧化钠开始进入洗脱液，洗脱液是氢氧化钠和组氨酸的混合液，1000us/cm＜电导＜5000us/cm)，B1液的组氨酸含量为0.5％，即50g组氨酸；
(5)将10L B1液过电渗析，具体地，将10L B1液置于淡室，浓室加入10L纯水，加电压50v，进行电渗析，得到10L脱盐的(电导200us/cm)、组氨酸含量0.5％的组氨酸溶液；
(6)将A液与B1液过电渗析得到的组氨酸溶液合并，得到E液，计算收率为98％(即(1050+50)/1120＝98.2％)
(7)取E液，向其中加入15％(g/100mL)活性炭于60℃脱色30min，将脱色液进行浓缩结晶得到粗品120g；
(8)取100g粗品，向其中加入2L水，加入0.1％(0.1g/100g粗品)亚硫酸钠(用于抗氧化)、15％活性炭于60℃脱色30min，将二次脱色液浓缩结晶得到成品70g。经检测，成品检测硫酸根含量＜0.02％，满足原料药的要求。
成品品质的检测：
表2
Figure BDA0003086588020000041
Figure BDA0003086588020000051
实施例2
(1)取70L组氨酸发酵液经超滤膜过滤除去菌体得到的发酵清液，
(2)将发酵清液上14L的732阳离子交换树脂进行吸附(填料：WA-2、柱子规模型号14L)，发酵清液的流速即吸附速度为8L/h(经检测，共吸附组氨酸量1122g)；
(3)当出柱液经吲哚醌快速点样显色即可判断为达到了吸附饱和，柱子中未吸附的组氨酸发酵清液用水压柱，水洗速度为8L/h，得水洗液28L，水洗液中组氨酸含量为1.01％(g/100mL)，共282.8g；
(4)水洗结束后，用浓度为2％(g/100mL)氢氧化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为8L/h，得到30L A液(电导＜1000us/cm，洗脱终点)，A液中组氨酸的含量为3.2％；得到10L B1液(多余的氢氧化钠开始进入洗脱液，洗脱液是氢氧化钠和组氨酸的混合液，1000us/cm＜电导＜5000us/cm)，B1液的组氨酸含量为0.48％；
(5)将10L B1液过电渗析，具体地，将10L B1液置于淡室，浓室加入10L纯水，加电压50v，进行电渗析，得到10L脱盐的(电导200us/cm)、组氨酸含量0.48％的组氨酸溶液；
(6)将A液与B1液过电渗析得到的组氨酸溶液合并，得到E液；
(7)取E液，向其中加入15％(g/100mL)活性炭于60℃脱色30min，将脱色液进行浓缩结晶得到粗品；
(8)取100g粗品，向其中加入2L水，加入0.1％(0.1g/100g粗品)亚硫酸钠、15％活性炭于60℃脱色30min，将二次脱色液浓缩结晶得到成品，经检测，成品检测硫酸根含量＜0.02％。
实施例3
(1)将粘质沙雷氏菌组氨酸发酵液经过超滤膜过滤除去菌体得到发酵清液；
(2)将14L发酵清液上732阳离子交换树脂进行吸附，发酵清液的流速为10L/h；
(3)吸附饱和后，针对柱子中未吸附的组氨酸发酵清液用水压柱，水洗速度为10L/h，收集水洗液；
(4)水洗结束后，用浓度为1％的氢氧化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为8L/h，收集电导率小于1000us/cm的洗脱液，即A液，收集1000us/cm＜电导＜5000us/cm的洗脱液，即为B1液；
(5)将B1液用电渗析除盐；
(6)将A液、电渗析处理后的B1液合并，得到E液；
(7)取E液，向其中加入10％活性炭于55℃脱色60min，将脱色液进行浓缩结晶得到粗品；
(8)取粗品，向其中加入15倍质量的水，加入0.3％的亚硫酸钠、20％的活性炭，于55℃脱色45min，将二次脱色液浓缩结晶得到成品，成品中硫酸根含量＜0.02％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种无氨氮排放高效纯化组氨酸原料药的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将发酵液经过超滤膜过滤除去菌体得到发酵清液；所述发酵液是指利用粘质沙雷氏菌以葡萄糖为底物进行发酵得到的发酵液；
(2)将发酵清液上732阳离子交换树脂进行吸附，发酵清液的流速为8-10L/h；
(3)吸附饱和后，针对柱子中未吸附的组氨酸发酵清液用水压柱，水洗速度为8-10L/h，收集水洗液；
(4)水洗结束后，用浓度为1～2％的氢氧化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为7～8L/h，收集电导率小于1000us/cm的洗脱液，即A液，收集1000us/cm＜电导＜5000us/cm的洗脱液，即为B1液；
(5)将B1液用电渗析除盐；
(6)将A液、电渗析处理后的B1液合并，得到E液；
(7)取E液，向其中加入10-20％活性炭于55-60℃脱色30-60min，将脱色液进行浓缩结晶得到粗品；
(8)取粗品，向其中加入15-20倍质量的水，加入0.05％-0.3％的亚硫酸钠、10-20％的活性炭，于55-60℃脱色30-60min，将二次脱色液浓缩结晶得到成品。
2.根据权利要求1所述的一种无氨氮排放高效纯化组氨酸原料药的方法，其特征在于，所述电渗析，是将用等体积的纯水对待处理的溶液进行除盐。
3.根据权利要求1所述的一种无氨氮排放高效纯化组氨酸原料药的方法，其特征在于，步骤(2)发酵清液的流速是9L/h。
4.根据权利要求1所述的一种无氨氮排放高效纯化组氨酸原料药的方法，其特征在于，步骤(4)采用用浓度为1的氢氧化钠溶液进行洗脱。
5.根据权利要求1所述的一种无氨氮排放高效纯化组氨酸原料药的方法，其特征在于，步骤(7)，取E液，向其中加入15％活性炭于60℃脱色30-60min，将脱色液进行浓缩结晶得到粗品。
6.根据权利要求1所述的一种无氨氮排放高效纯化组氨酸原料药的方法，其特征在于，步骤(8)，取粗品，向其中加入20倍质量的水，加入0.1％的亚硫酸钠、15％的活性炭，于60℃脱色30min，将二次脱色液浓缩结晶得到成品。
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