CN114836505A - 一种小分子解酒肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小分子解酒肽及其制备方法与应用，包括以下步骤：S1：向海洋生物中加入第一酶进行第一酶解，得到第一酶解液；向第一酶解液中加入第二酶进行第二酶解，得到第二酶解液；向第二酶解液中加入第三酶进行第三酶解，得到第三酶解液；其中，所述第一酶、第二酶和第三酶分别独立地选自胃蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶中的任意一种或几种酶；S2：所得第三酶解液经膜分离得到透过液，所得透过液经吸附树脂和/或阳离子交换树脂吸附、洗脱得到洗脱液，所得洗脱液即为含小分子解酒肽的液体。本发明提供的小分子肽具有水/醇溶性好、易吸收，具有解酒护肝功能活性，适用于食品保健领域。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种小分子解酒肽及其制备方法与应用。
背景技术
我国白酒起源于2000年以前，适量饮酒可以改善人体血液循环，解除疲劳，但是饮入过量酒精会导致肝细胞发生脂肪变性、坏死，从而导致肝纤维化和肝硬化等酒精性肝病。同时随着经济的不断发展，人民生活水平的不断提高，人们对饮酒的品味和健康保障的需求也越来越高。因此，关于解酒护肝养胃活性物质逐渐受到关注。目前关于解酒类的产品主要集中在化学药品或中药类，其配方以维生素、激素类、氨基酸为主，但是大量研究表明生物活性肽是最有前途的解酒保健产品。
生物活性肽(Biological acvtive pepitde)一般由蛋白质酶解制得，通常含有3-20个氨基酸残基，它是将没有生物活性的蛋白质原料，通过酸、碱或酶水解后，释放其生物活性，使其具有促进免疫、激素、酶抑制剂、抗菌、抗病毒、降血脂等作用。生物活性肽与传统的化学中药氧化剂相比，在清除羟自由基、超氧阴离子、DPPH自由基，抑制脂质自氧化方面，具有优化代谢调节机制的优势。活性肽是通过激活人体内解酒系列酶活，抑制氧化系列酶活，抗氧化和清除氧化自由基来预防酒精性脂肪肝、肝纤维化起到对肝脏的解毒作用，同时保护胃粘膜等来起到解酒保健功效。具体为激活体内乙醛脱氢酶(ALDH)、超氧化物岐化酶(SOD)、ADH(乙醇脱氢酶)等的酶活性，抑制氧化系列酶活，例如谷丙转氨酶(ALT)与谷草转氨酶(AST)的酶活性，因此，其在解酒护肝中的发挥着巨大价值。
目前对植物蛋白类多肽解酒活性物质的研究相对比较集中，例如玉米肽、大豆肽、绿豆等，但对海洋生物蛋白类多肽解酒活性物质的研究相对比较缺乏。目前我国海洋生物资源丰富，但是产业的深加工行业发展不足，其中蛋白多肽类产品主要以10000Da以上的大分子为主，存在水解不彻底，消化吸收弱，活性低的问题。尤其是具备高纯度、高活性的小分子肽拥有广阔的市场需求。因此，本发明提供了一种小分子解酒肽及其制备方法与应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明实际要解决的技术问题是提供一种解酒肽及其制备方法通过现代酶解技术、生物技术分离手段，获得一类富含有一种或多种与醒酒作用有关的氨基酸，短肽，寡肽。
本发明还要解决的技术问题是提供上述小分子解酒肽的应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种小分子解酒肽的制备方法，集现代生物分离技、生物酶解技术，研制开发一种高纯度、高活性、高营养保健功效的海洋生物小肽产品，满足保健、医疗、食品等领域对多肽的应用需求，该工艺简单高效、所得产品具有较强的DPPH自由基清除能力，并且在体外对ADH酶具有激活功能，生产成本低，易于工业化规模生产。
其中，所述制备方法包括以下步骤：
S1：向海洋生物中加入第一酶进行第一酶解，得到第一酶解液；向第一酶解液中加入第二酶进行第二酶解，得到第二酶解液；向第二酶解液中加入第三酶进行第三酶解，得到第三酶解液；其中，所述第一酶、第二酶和第三酶分别独立地选自胃蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶中的任意一种或几种酶；且第一酶、第二酶和第三酶均不相同；其蛋白回收率>75％、ADH酶激活率＞20％，多肽得率>50％(10mg/mL)；
S2：所得第三酶解液经膜分离，达到除蛋白及大分子杂质的目的，得到透过液，所得透过液调节pH为3.0～4.0后经吸附树脂和/或阳离子交换树脂吸附、洗脱得到洗脱液，所得洗脱液即为含小分子解酒肽的液体，通过液相检测对洗脱液进行实时检测，分步进行收集。
步骤S1中，所述海洋生物为鱿鱼、海参、牡蛎和海蜇中的任意一种或几种组合；所述海洋生物先浸泡去杂，清洗，切块，低温匀浆至呈糊状后再进行酶解。
步骤S1中，所述第一酶、第二酶和第三酶的加入量均为海洋生物中蛋白的0.1％～2％w/w；所述第一酶、第二酶和第三酶的加入量均为活酶400～600U/g海洋生物；反应体系中，所述海洋生物中蛋白的浓度为1％～2％w/w，所述海洋生物与体系的料液比为1：(5-20)w/w。
步骤S1中，所述第一酶解、第二酶解和第三酶解的条件均为：pH 2.0～9.0，温度为20～50℃，时间为1～4h。
步骤S2中，所述膜分离为所得第三酶解液经微滤、超滤、纳滤中的任意一种或几种进行分离，所述微滤、超滤、纳滤的孔径分布依次为50-300nm、1000-10000Da、150-300Da；所述微滤、超滤、纳滤的压力均为0.2-3MBar。
步骤S2中，所述吸附树脂为西安蓝晓科技新材料股份有限公司，编号为X-6的树脂，其吸附量为0.04g/g以上；所述阳离子交换树脂为西安蓝晓科技新材料股份有限公司，编号为NH-1的树脂，其吸附量为0.1g/g以上。
步骤S2中，所得第三酶解液经膜分离得到透过液，所得透过液经吸附树脂和阳离子交换树脂吸附、洗脱得到洗脱液，所得洗脱液即为含小分子解酒肽的液体。
步骤S2中，当树脂为吸附树脂时，洗脱剂为甲醇、乙醇和丙酮中的任意一种或几种有机溶剂，优选乙醇，进一步优选为2％、5％、10％乙醇进行梯度洗脱，梯度洗脱的速率为1-2BV/h。
步骤S2中，当树脂为阳离子交换树脂时，洗脱剂为1-2mol/L NaCl，pH3.0～4.0，优选为1mol/L NaCl。
上述方法制备得到的小分子解酒肽也在本发明的保护范围之内。
在一些实施例中，所述小分子解酒肽为淡黄色小肽粉末，其与水、酒精可以任意比例互溶，其分子量在3000Da以下，其含量为95％以上，含氮量为14％以上、蛋白氮含量为95％以上、灰分为2％以下，DPPH自由基清除率为60％以上，体外乙醇脱氢酶激活率为14％以上，优选为70％以上。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述小分子解酒肽在制备解酒护肝产品或在制备美容保健产品中的应用。
本发明提供的小分子解酒肽是以鱿鱼为原材料，其营养价值高，富含蛋白质且脂肪含量低，且含多种人体必需的氨基酸，其组成和比例接近全蛋蛋白。在中医上，称鱿鱼具有滋阴、养胃、补虚、润肤之效，是一种优良的天然保健食品。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和技术效果：
(1)本发明制备的小分子解酒肽在具有较好的水溶性和醇溶解。
(2)本发明制备的小分子解酒肽分子量3000Da以下，其含量>95％，分子量小、易吸收。
(3)本发明制备的小分子解酒肽含氮量>14％、蛋白氮含量>95％、灰分<2％以下，总收率为>10％，纯度高、杂质少，收率高。
(4)本发明制备的小分子解酒肽生物活性高，具体为DPPH自由基清除率可达92.01％(10mg/mL)和体外乙醇脱氢酶激活率可达83.42％(10mg/mL)。低分子量肽是促乙醇代谢的主要功能肽片段，具备解酒护肝功效作用。
(5)本发明的小分子解酒肽通过对蛋白水解度和ADH酶激活为评价指标来控制酶解工艺，具体以酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶，优选酶2-5种组合。其蛋白回收率为75％、ADH酶激活率＞20％(10mg/mL)。
(6)本发明的制备工艺简单易操作条件温和、稳定性高、节能环保。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为解酒肽产品。
图2为解酒肽分子质量分布。
图3为DPPH自由基清除率。
图4为体外ADH酶激活率。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所述胃蛋白酶(30U/mg)、碱性蛋白酶(200U/mg)、胰蛋白酶(2500U/mg)、风味蛋白酶(20U/mg)、菠萝蛋白酶(300U/mg)、木瓜蛋白酶(800U/mg)均购自源叶生物技术有限公司。
下述实施例中所述吸附树脂为西安蓝晓科技有限公司的编号为X-6的树脂，其吸附量为0.04g/g以上。
下述实施例中所述阳离子交换树脂为西安蓝晓科技有限公司的编号的编号为NH-1的树脂，其吸附量为0.1g/g以上。
下述实施例中所述中度酶解提取步骤中，各pH是通过1mol/L磷酸和PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2-7.4)进行调节的。
下述实施例中所述膜设备中所述膜为微滤陶瓷膜，孔径为50-80nm。
下述实施例中步骤(3)中所述调节pH为通过1mol/L磷酸进行调节。
下述实施例中，如无特殊说明，所述中度酶解提取过程中，各阶段中酶的加入量均为海洋生物中蛋白的0.2％w/w，均为活酶400～600U/g海洋生物；反应体系中，所述海洋生物中蛋白的浓度为1％～2％w/w，所述海洋生物与体系的料液比为1：(5-20)w/w。
下述实施例中通过液相检测对洗脱液进行实时检测，分步进行收集，其液相检测流速：1.0ml/min，柱温10-20℃，检测波长为220nm和280nm，检测流出液小肽含量。
下述实施例中对截留液进行冷冻干燥，冷冻干燥条件：温度零下50-100℃，12-24h，真空度低于100pa，最终得到淡黄色小分子肽粉末。
实施例1：
1)原料预处理：将新鲜海蜇浸泡去杂，清洗，切块，4-20℃低温匀浆至呈糊状，混合均匀后投入控温搅拌装置中进行中度酶解提取。
2)中度酶解提取步骤：模拟人体胃条件设置分步酶解过程，阶段1：碱性蛋白酶；酶解条件为pH8.0、50℃、1h；阶段2：胃蛋白酶，酶解条件为pH2.0、30℃、1h；阶段3：风味蛋白酶；酶解条件为pH7.0、50℃、2h。
3)小肽粗酶液纯化及精制：将酶解提取液通过膜设备进行将固液渣分离，达到除蛋白及大分子杂质的目的；再调节清液的pH为6.0(活性肽浓度为10g/L)，进行色谱精制，所用色谱填料为吸附树脂；用洗脱剂进行梯度洗脱，将洗脱液浓缩。
其中，上样速率为1BV/h，上样量为2BV；
其中，洗脱剂为2％、5％、10％乙醇，流速控制在1BV/h，各浓度乙醇洗脱体积均为1BV，洗脱体积共3BV，收集10％乙醇梯度洗脱所得样品。
4)干燥：将浓缩液冷冻干燥或喷干，得到小分子活性肽。
产品收率21.21％，总氮含量11.42％，蛋白氮纯度71.36％，灰分18.1％，含水4.04％。
结论：活性肽纯度低，灰分高，改进工艺，目的除盐。
实施例2：
1)原料预处理：将新鲜海蜇浸泡去杂，清洗，切块，4-20℃打浆至呈糊状，混合均匀后投入控温搅拌装置中进行中度酶解提取；
2)中度酶解提取步骤：模拟人体胃条件设置分步酶解过程，阶段1：胃蛋白酶，酶解条件为pH3.0、20℃、2h；阶段2：胰蛋白酶；酶解条件为pH7.0、30℃、2h；阶段3：菠萝蛋白酶；酶解条件为pH7.0、30℃、2h。
3)小肽粗酶液纯化及精制：将酶解提取液通过膜设备进行将固液渣分离，达到除蛋白及大分子杂质的目的；所得清液用10000Da超滤膜对大分子进行截留，调节透过液的pH为3.0，进行色谱精制，所用色谱填料为吸附树脂；用洗脱剂进行梯度洗脱，将洗脱液浓缩。
其中，上样速率为1BV/h，上样量为2BV；
其中，洗脱剂为2％、5％、10％、20％乙醇，流速均控制在1BV/h，各浓度乙醇洗脱体积均为1BV，洗脱量为4BV，收集20％乙醇梯度洗脱所得样品。
4)干燥：将浓缩液冷冻干燥或喷干，得到小分子活性肽。
产品收率11.11％，总氮含量14.58％，蛋白氮纯度91.11％，灰分3.15％，含水6.82％。
结论：产品纯度提高，灰分也降低了，仍需进一步优化工艺。
实施例3：
1)原料预处理：将新鲜鱿鱼浸泡去杂，清洗，切块，4-20℃低温打浆至呈糊状，混合均匀后投入控温搅拌装置中进行中度酶解提取；
2)中度酶解提取步骤：模拟人体胃条件设置分步酶解过程，阶段1：风味蛋白酶；酶解条件为pH7.0、40℃、2h。阶段2：胰蛋白酶；酶解条件为pH7.0、37℃、2h；阶段3：胃蛋白酶，酶解条件为pH2.0、28℃、1h；
3)小肽粗酶液纯化及精制：将酶解提取液通过膜设备进行将固液渣分离，达到除蛋白及大分子杂质的目的；所得清液用10000Da超滤膜对大分子进行截留，调节透过液的pH为3.0，进行色谱精制，所用色谱填料为吸附树脂和阳离子交换树脂串联；用洗脱液进行梯度洗脱，将洗脱液浓缩。
其中，上样速率为1BV/h，上样量为2BV；
其中，吸附柱树脂的洗脱剂为20％乙醇，洗脱速率为1BV/h，洗脱量为4BV；阳离子交换树脂洗脱剂为1.0mol/L NaCl，pH3.0，洗脱速率为1BV/h，洗脱量为2BV。
4)干燥：将浓缩液冷冻干燥或喷干，得到小分子活性肽。
产品收率12.3％，总氮含量14.90％，蛋白氮纯度93.16％，灰分1.36％，含水0.96％。
结论：产品纯度提高，灰分也降低了，这批工艺较好。
实施例4：
1)原料预处理：将新鲜鱿鱼浸泡去杂，清洗，切块，4-20℃低温打浆至呈糊状，混合均匀后投入控温搅拌装置中进行中度酶解提取；
2)中度酶解提取步骤：模拟人体胃条件设置分步酶解过程，阶段1：所添加的酶1为胃蛋白酶；酶解条件为pH2.0、37℃、1h；阶段2：所添加的酶2为碱性蛋白酶；酶解条件为pH7.5、45℃、1h；阶段3：所添加的酶3为胰蛋白酶；酶解条件为pH7.5、37℃、2h。
3)小肽粗酶液纯化及精制：将酶解提取液通过膜设备进行将固液渣分离，达到除蛋白及大分子杂质的目的；调节清液的pH为3.0，进行色谱精制，所用色谱填料为吸附树脂和阳离子交换树脂串联；用洗脱液进行梯度洗脱，将洗脱液浓缩。
其中，上样速率为1BV/h，上样量为2BV；
其中，吸附柱树脂洗脱剂为10％乙醇，洗脱速率为1BV/h，洗脱量为5BV；阳离子交换树脂洗脱剂为2mol/L NaCl，pH3.0，洗脱速率为1BV/h，洗脱体积为2BV。
4)干燥：将浓缩液冷冻干燥或喷干，得到小分子活性肽。
产品收率11.6％，总氮含量15.27％，蛋白氮纯度95.45％，灰分0.99％，含水1.72％。
结论：产品纯度提高，灰分也降低了，这批工艺较好。
实施例5：
1)原料预处理：将新鲜鱿鱼浸泡去杂，清洗，切块，4-20℃低温打浆至呈糊状，混合均匀后投入控温搅拌装置中进行中度酶解提取；
2)中度酶解提取步骤：模拟人体胃条件设置分步酶解过程，阶段1：胃蛋白酶；酶解条件为pH2.0、37℃、2h；阶段2：碱性蛋白酶；酶解条件为pH8.5、37℃、1h；阶段3：胰蛋白酶；酶解条件为pH7.0、37℃、1h。
3)小肽粗酶液纯化及精制：将酶解提取液通过膜设备进行将固液渣分离，达到除蛋白及大分子杂质的目的；所得清液用10000Da超滤膜对大分子进行截留，调节透过液pH为3.0，进行色谱精制，所用色谱填料为吸附树脂和阳离子交换树脂串联；用洗脱液进行梯度洗脱，将洗脱液浓缩。
其中，上样速率为1BV/h，上样量为2BV；
其中，吸附柱洗脱剂为10％乙醇，洗脱速率为1BV/h，洗脱量为5BV；阳离子交换树脂洗脱剂为1mol/L NaCl，pH3.0，洗脱速率为1BV/h，洗脱量为2BV。
4)干燥：将浓缩液冷冻干燥或喷干，得到小分子活性肽，如图1所示；分子量分布如图2所示。
产品收率10.2％，总氮含量15.33％，蛋白氮纯度95.81％，灰分1.87％，含水1.63％。
结论：产品纯度提高，灰分也降低了，这批工艺较好。
实施例6：
参照公开报道的检测方法[1]，对DPPH自由基的检测以及体外对ADH酶激活率；并设置GSH和VC-抗坏血酸为阳性对照组。将实施例中所获得样品进行活性检测，实验结果如表1和图3、图4所示。
表1
| 序号 | 编号 | 初始浓度(mg/mL) | DPPH自由基(％) | ADH酶活(％) |
| 1 | 实施例1 | 10 | 68.97 | 55.54 |
| 2 | 实施例2 | 10 | 84.84 | 14.60 |
| 3 | 实施例3 | 10 | 76.50 | 73.22 |
| 4 | 实施例4 | 10 | 88.83 | 82.38 |
| 5 | 实施例5 | 10 | 92.01 | 83.42 |
| 6 | GSH | 10 | 93.12 | 56.16 |
| 7 | VC-抗坏血酸 | 10 | 92.81 | 14.6 |
上述实验结果表明，本发明实施例5为最佳实施例，在最佳工艺条件下鱿鱼肽得率为10.2％，蛋白氮纯度达95％以上。其对DPPH自由基清除率达到92.01％，与同等条件下GSH、VC(抗坏血酸)水平相当，说明本发明鱿鱼活性肽具有显著的抗氧化能力。并对其体外ADH酶活检测，结果表明其最大激活可达83.42％。乙醇经食道进入胃内后，首先部分被胃粘膜细胞吸收并由其内乙醇脱氢酶(ADH)脱氢代谢，其可催化肝细胞内吸收乙醇被氧化代谢，推动加速乙醇在体内的代谢分解，由此可见本发明的小分子活性肽具有解酒护肝功能。
[1]刘鹏.低分子量促乙醇代谢玉米肽制备与蛋白成分对活性贡献关系研究[D].广州:华南理工大学,2015.
综上，本发明提供了一种小分子解酒肽及其制备方法，具体以海洋生物为原材料，通过特定的酶解工艺对原料蛋白进行中度酶解，获得一类富含有一种或多种与醒酒作用有关的氨基酸，短肽。本发明提供的制备工艺，条件温和、低能耗、易操作，能够有效获得一类活性高、纯度高、分子量小、易吸收的小分子肽类产品，因其具备高抗氧化性和对ADH(乙醇脱氢酶)在体外起激活作用，能应用但不局限于解酒护肝领域。
本发明提供的一种小分子解酒肽及其制备方法与应用及思路，应当指出，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种小分子解酒肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：向海洋生物中加入第一酶进行第一酶解，得到第一酶解液；向第一酶解液中加入第二酶进行第二酶解，得到第二酶解液；向第二酶解液中加入第三酶进行第三酶解，得到第三酶解液；其中，所述第一酶、第二酶和第三酶分别独立地选自胃蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶中的任意一种或几种酶；
S2：所得第三酶解液经膜分离得到透过液，所得透过液经吸附树脂和/或阳离子交换树脂吸附、洗脱得到洗脱液，所得洗脱液即为含小分子解酒肽的液体。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述海洋生物为鱿鱼、海参、牡蛎和海蜇中的任意一种或几种组合；所述海洋生物先浸泡去杂，清洗，切块，低温匀浆至呈糊状后再进行酶解。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述第一酶、第二酶和第三酶的加入量均为海洋生物中蛋白的0.1％～2％w/w。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述第一酶解、第二酶解和第三酶解的条件均为：pH 2.0～9.0，温度为20～50℃，时间为1～4h。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述膜分离为所得第三酶解液经微滤、超滤、纳滤中的任意一种或几种进行分离，所述微滤、超滤、纳滤的孔径分布依次为50-300nm、1000-10000Da、150-300Da；所述微滤、超滤、纳滤的压力均为0.2-3MBar。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述吸附树脂为西安蓝晓科技新材料股份有限公司编号为X-6的树脂，其吸附量为0.04g/g以上；所述阳离子交换树脂为西安蓝晓科技新材料股份有限公司的编号为NH-1的树脂，其吸附量为0.1g/g以上。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，当树脂为吸附树脂时，洗脱剂为甲醇、乙醇和丙酮中的任意一种或几种有机溶剂，优选乙醇。
8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，当树脂为阳离子交换树脂时，洗脱剂为1-2mol/L NaCl，pH3.0～4.0，优选为1mol/L NaCl。
9.权利要求1～8中任意一项所述方法制备得到的小分子解酒肽；优选地，所述小分子解酒肽为淡黄色小肽粉末，其与水、酒精可以任意比例互溶，其分子量在3000Da以下，其含量为95％以上，含氮量为14％以上、蛋白氮含量为95％以上、灰分为2％以下，DPPH自由基清除率为60％以上，体外乙醇脱氢酶激活率为14％以上，优选为70％以上。
10.权利要求9所述的小分子解酒肽在制备解酒护肝产品或在制备美容保健产品中的应用。
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