CN113666986B - 膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺 - Google Patents

膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肽纯化技术领域，针对现有组氨酸二肽分离纯化效率低的问题，公开了膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，包括：将组氨酸二肽配成母液备用；将金枪鱼粗提液进行陶瓷膜微滤处理，再对截留液加水进行透析，收集透过液并合并，继续采用高通量改性膜进行分离，物料浓缩；根据不同色谱柱及液体流动相对肽母液的分离效果，得到高效液相色谱；测定金枪鱼加工副产物中各阶段组氨酸二肽含量及回收率；分析金枪鱼加工副产物相的对分子质量及纯度。通过分离方法、纯化工艺及检测验证手段优化，来实现组氨酸二肽的有效提取，通过制备高通量改性膜，来提高组氨酸二肽的分离持续性与提取效率，充分去除金枪鱼粗体液中的金属离子。

Description

膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺
技术领域
本发明涉及肽纯化技术领域，尤其是涉及膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺。
背景技术
组氨酸二肽(Histidine-containing dipetides,HCDPs)是一类天然水溶性二肽，具有许多生理特性，组氨酸二肽在食品、药品、保健品、化妆品等行业中具有广阔的应用潜力，例如：作为肉类抗氧化剂，能够抑制血红蛋白、脂类氧化酶、铁离子等作用下产生的脂质氧化反应；作为免疫调节剂、抗炎症化及治疗烧伤的药物，能够保护细胞膜，对细胞的动态平衡起重要作用，促进细胞的修护，有利于伤口愈合；作为神经调节剂，具有神经调节的功能；作为抗衰老剂、降血压、治疗癌症、代谢性疾病等良药。
金枪鱼肉腥味重、肌肉纤维粗大且有不良的柴样口感，同时体内累积大量乳酸使其肉有怪酸味，故常加工成罐头或木鱼精调味料，精深化利用程度不够充分，在其加工生产过程中，会产生大量的加工副产物，比如内脏、暗色肉、鱼皮和鱼骨等，约占重量的50-70％，其不仅具有大量的蛋白质、油脂等，并且含有多种的生物活性物质。舟山及宁波地区金枪鱼年加工量在全国位于前列，其加工副产物多达50吨/天，这些副产物通常被加工成廉价的饲料，利用价值低，造成了大量宝贵营养和功能成分的浪费。金枪鱼等一些洄游鱼类能够持续不断游泳的原因之一是其肌肉中含有较多的含组氨酸的游离二肽，即肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸，carnosine)、鹅肌肽(β-丙氨酰-1-甲基-L-组氨酸，anserine)、鲸肌肽(β-丙氨酰-3-甲基-L-组氨酸，balenine)，大量研究表明，肌肽和鹅肌肽具有降低尿酸、延缓痛风症状等功效，但是由于其在组织中含量较少，直接取得率不高。
目前，通过生物、化学方法或者是从天然原料中提取获得组氨酸二肽的成本都较高，限制了组氨酸二肽的应用。尤其是在组氨酸二肽分离过程中，现有的滤膜易受酶解杂质或者肽的堵塞，普遍水通量较低，随着使用时间的延长，水通量衰减严重，过滤效率显著降低；另外，现有肽粗体液中含有较多的有毒金属离子，如：铜、锌、铅等，而金属离子又无法有效除，会留存在肽产物中，对人体造成损伤，因此，开发更高效低成本的组氨酸二肽分离纯化技术对于推动其在食品、药品等领域的广泛应用具有重要意义。
发明内容
本发明是为了克服现有组氨酸二肽分离纯化效率低的问题，提供膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，本发明通过分离方法、纯化工艺及检测验证手段优化，来实现组氨酸二肽的有效提取，通过制备高通量改性膜，来提高组氨酸二肽的分离持续性与提取效率，充分去除金枪鱼粗体液中的金属离子。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，包括如下处理步骤：
(1)配置母液：将组氨酸二肽配成母液备用；
(2)粗提液处理：将金枪鱼加工副产物的粗提液进行陶瓷膜微滤处理，再对截留液加水进行透析，收集透过液并合并，继续采用高通量改性膜进行分离，物料浓缩；
(3)高效液相色谱条件的建立：比较不同色谱柱及液体流动相在不同比例、流速、pH条件下对肽母液的分离效果，得到高效液相色谱；
(4)测定金枪鱼加工副产物中各阶段组氨酸二肽含量及回收率；
(5)分析金枪鱼加工副产物相的对分子质量及纯度。
作为优选，步骤(1)中母液的浓度为1-1.2mg/mL；步骤(2)的具体过程为：将金枪鱼加工副产物的粗提液进行0.5-0.55μm陶瓷膜微滤处理，截留液加水进行透析，重复4-6次，收集透过液并合并；依次采用1000Da、200Da高通量改性膜进行分离，反渗透RO膜进行物料浓缩。
作为优选，所述步骤(3)中的高效液相色谱为：色谱柱CAPCELL PAK C18(4.6×250mm，5μm)；流动相甲醇：20-22mM PH7.0-7.2磷酸缓冲液＝5：94-96；流速0.4-0.6mL/min；进样体积10-10.5μL；检测波长：210nm；运行时间：20-25min。
作为优选，步骤(4)中，各阶段肽指的是粗提液、透过液和截留液的中的肽含量。
作为优选，所述步骤(5)的具体过程为：采用步骤(3)所述的高效液相色谱技术TSKgel2500凝胶柱对针式滤膜分离后液体的分子量范围进行分析，针式滤膜的孔径为0.44-0.46μm滤膜，进样量10-10.8μL，流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝40：60-62：0.4-0.6；检测波长220nm流速0.5-0.6mL/min柱温30-31℃。
本发明通过制定最优的粗提液分离、浓缩及纯化工艺，引入完备的检测和评估技术手段，最终得到较高纯度组氨酸二肽的制备工艺。
作为优选，所述高通量改性膜的制备过程如下：
1)将硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸溶解在三乙醇胺中，加入质量浓度为28-34％的硫酸，超声分散15-20min，然后加热至105-115℃水热反应18-22h，冷却至室温后将产物过滤、清洗、干燥得到配位体基架；
2)将配位体基架和1-(3-氨基丙基)咪唑加入乙醇中，氮气保护下搅拌4-6h；再加入3-异硫氰酸溴丙酯，氮气保护下反应16-20h，继续加入六氟磷酸钠，45-50℃搅拌反应8-10h；将产物过滤后用无水乙醇洗净、真空干燥后得到金属离子吸附体改性的配位体基架；
3)将咪唑溶于去离子水中，然后加入金属离子吸附体改性的配位体基架，分散均匀后调节溶液pH值至5.5-6，得到A溶液，A溶液中咪唑的质量浓度为1-1.2％；
4)将均苯三甲酰氯加入正丁醇中，搅拌溶解后得到均苯三甲酰氯的质量浓度为0.8-1.2％的B溶液；
5)将多孔聚醚砜基膜浸入A溶液中浸泡15-18min，取出后将多孔聚醚砜基膜上多余的A溶液吹扫干净；再将多孔聚醚砜基膜浸入B溶液中反应35-40min；取出后将多孔聚醚砜基膜在60-65℃下干燥10-15min，然后用75-85℃的去离子水洗净，再在质量浓度为10-16％的1,2,4-三羟基丁烷中浸泡6-10min，取出后55-60℃烘干得到所述高通量改性膜。
上述高通量改性膜的制备过程及具体原理为：步骤1)以硫酸锆为金属源，2，5-二氨基对苯二甲酸为有机配体，制得带有氨基的配位体基架；步骤2)先使1-(3-氨基丙基)咪唑吸附扩散至配位体基架的框架结构内，然后再使3-异硫氰酸溴丙酯吸附扩散至框架结构内与1-(3-氨基丙基)咪唑反应，生成中间产物聚合咪唑溴化物，聚合咪唑溴化物上的溴再与六氟磷酸钠中的六氟磷酸基团发生置换反应，最终将金属离子吸附体负载在配位体基架的框架结构内，得到金属离子吸附体改性的配位体基架，配位体基架上带有负电荷的六氟磷酸基团，对金属离子，尤其是二价的金属离子具有较好的吸附性；步骤3)和步骤4)中，通过咪唑和均苯三甲酰氯在多孔聚醚砜基膜表面发生界面聚合反应，生成聚咪唑酰胺功能层，从而使高通量改性膜具有良好的选择透过性，可以将具有亲水性的组氨酸二肽和二价金属离子进行分离。界面聚合过程中，配位体基架中的氨基也可以参与反应，从而使配位体基架可以牢固负载在聚咪唑酰胺功能层中，不易从高通量改性膜表面脱落。
本发明制备的高通量改性膜，在聚咪唑酰胺功能层中添加了配位体基架，利用配位体基架的中空多孔结构，可有效提升高通量改性膜的水通量；但是对于粗提液中的金属离子无法有效去除，因此本发明又在配位体基架的多孔结构内修饰了金属离子吸附体，通过金属离子吸附体对二价金属离子的吸附作用，提高了高通量改性膜对金属离子的截留率，从而使制得的高通量改性膜兼具高的金属离子截留率和水通量，可有效对金属离子和组氨酸二肽进行分离，也满足了实现高效率分离提纯的要求。
作为优选，所述步骤1)中，硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸的质量比为1：1.2-1.6：0.4-0.6，硫酸与三乙醇胺的体积比为1：44-48。
作为优选，所述步骤2)中，配位体基架、1-(3-氨基丙基)咪唑、3-异硫氰酸溴丙酯及六氟磷酸钠的质量比为2.6-3：1.2-1.4：2-2.4：0.8-1.2。
作为优选，所述步骤3)中，咪唑与配位体基架的质量比为2.5-3：1。
作为优选，所述组氨酸二肽为鹅肌肽或肌肽。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)通过制定最优的粗提液分离、浓缩及纯化工艺，引入完备的检测和评估技术手段，最终得到高纯度组氨酸二肽的制备工艺，制备工艺简单，制备成本低；
(2)通过制备高通量改性膜，引入配位体基架和金属离子吸附体来提高组氨酸二肽的分离持续性与提取效率，充分去除金枪鱼粗体液中的金属离子，使高通量改性膜兼具高的金属离子截留率和水通量，可有效对金属离子和组氨酸二肽进行分离。
附图说明
图1是实施例1肌肽及鹅肌肽标准品液相色谱图。
图2是实施例1的鹅肌肽标准曲线图。
图3是实施例1的分子量标准曲线图(其中，Aprotinin(6512Da)2.Bacitracin A(1423Da)3.Glutathione(612.63Da)4.Gly(3)(189Da)5.Gly(75Da)。)
图4是实施例1膜分离后组分分子量的测定图(其中，(A)为≥0.5μm浓缩液，(B)为1000-0.5μm浓缩液，(C)为250-1000Da浓缩液，(D)为≤250Da浓缩液)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
总实施例
膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，包括如下处理步骤：
(1)配置母液：将组氨酸二肽(鹅肌肽或肌肽)配成浓度为1-1.2mg/mL母液备用；
(2)粗提液处理：将金枪鱼加工副产物的粗提液进行0.5-0.55μm陶瓷膜微滤处理，截留液加水进行透析，重复4-6次，收集透过液并合并；依次采用1000Da、200Da高通量改性膜进行分离，反渗透RO膜进行物料浓缩；
其中，高通量改性膜的制备过程如下：
1)将硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸溶解在三乙醇胺中，加入质量浓度为28-34％的硫酸，超声分散15-20min，然后加热至105-115℃水热反应18-22h，冷却至室温后将产物过滤、清洗、干燥得到配位体基架；硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸的质量比为1：1.2-1.6：0.4-0.6，硫酸与三乙醇胺的体积比为1：44-48；
2)将配位体基架和1-(3-氨基丙基)咪唑加入乙醇中，氮气保护下搅拌4-6h；再加入3-异硫氰酸溴丙酯，氮气保护下反应16-20h，继续加入六氟磷酸钠，45-50℃搅拌反应8-10h；将产物过滤后用无水乙醇洗净、真空干燥后得到金属离子吸附体改性的配位体基架；配位体基架、1-(3-氨基丙基)咪唑、3-异硫氰酸溴丙酯及六氟磷酸钠的质量比为2.6-3：1.2-1.4：2-2.4：0.8-1.2；
3)将咪唑溶于去离子水中，然后加入金属离子吸附体改性的配位体基架，分散均匀后调节溶液pH值至5.5-6，得到A溶液，A溶液中咪唑的质量浓度为1-1.2％；将均苯三甲酰氯加入正丁醇中，搅拌溶解后得到均苯三甲酰氯的质量浓度为0.8-1.2％的B溶液；咪唑与配位体基架的质量比为2.5-3：1；
4)将多孔聚醚砜基膜浸入A溶液中浸泡15-18min，取出后将多孔聚醚砜基膜上多余的A溶液吹扫干净；再将多孔聚醚砜基膜浸入B溶液中反应35-40min；取出后将多孔聚醚砜基膜在60-65℃下干燥10-15min，然后用75-85℃的去离子水洗净，再在质量浓度为10-16％的1,2,4-三羟基丁烷中浸泡6-10min，取出后55-60℃烘干得到所述高通量改性膜。
(3)高效液相色谱条件的建立：比较不同色谱柱及液体流动相在不同比例、流速、pH条件下对肽母液的分离效果，得到高效液相色谱；
其中，高效液相色谱为：色谱柱CAPCELL PAK C18(4.6×250mm，5μm)；流动相甲醇：20-22mM PH7.0-7.2磷酸缓冲液＝5：94-96；流速0.4-0.6mL/min；进样体积10-10.5μL；检测波长：210nm；运行时间：20-25min；
(4)测定金枪鱼加工副产物中粗提液、透过液和截留液中组氨酸二肽含量及回收率；
(5)采用步骤(3)所述的高效液相色谱技术TSKgel 2500凝胶柱对针式滤膜分离后液体的分子量范围进行分析，针式滤膜的孔径为0.44-0.46μm滤膜，进样量10-10.8μL，流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝40：60-62：0.4-0.6；检测波长220nm流速0.5-0.6mL/min柱温30-31℃，分析金枪鱼加工副产物相的对分子质量及纯度。
实施例1
膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，包括如下处理步骤：
(1)配置母液：将鹅肌肽配成浓度为1.1mg/mL母液备用；
(2)粗提液处理：将金枪鱼加工副产物的粗提液进行0.52μm陶瓷膜微滤处理，截留液加水进行透析，重复5次，收集透过液并合并；依次采用1000Da、200Da高通量改性膜进行分离，反渗透RO膜进行物料浓缩；
其中，高通量改性膜的制备过程如下：
1)将硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸溶解在三乙醇胺中，加入质量浓度为30％的硫酸，超声分散18min，然后加热至110℃水热反应20h，冷却至室温后将产物过滤、清洗、干燥得到配位体基架；硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸的质量比为1：1.4：0.5，硫酸与三乙醇胺的体积比为1：46；
2)将配位体基架和1-(3-氨基丙基)咪唑加入乙醇中，氮气保护下搅拌5h；再加入3-异硫氰酸溴丙酯，氮气保护下反应18h，继续加入六氟磷酸钠，48℃搅拌反应9h；将产物过滤后用无水乙醇洗净、真空干燥后得到金属离子吸附体改性的配位体基架；配位体基架、1-(3-氨基丙基)咪唑、3-异硫氰酸溴丙酯及六氟磷酸钠的质量比为2.8：1.3：2.2：1；
3)将咪唑溶于去离子水中，然后加入金属离子吸附体改性的配位体基架，分散均匀后调节溶液pH值至5.8，得到A溶液，A溶液中咪唑的质量浓度为1.1％；将均苯三甲酰氯加入正丁醇中，搅拌溶解后得到均苯三甲酰氯的质量浓度为1％的B溶液；咪唑与配位体基架的质量比为2.8：1；
4)将多孔聚醚砜基膜浸入A溶液中浸泡16.5min，取出后将多孔聚醚砜基膜上多余的A溶液吹扫干净；再将多孔聚醚砜基膜浸入B溶液中反应38min；取出后将多孔聚醚砜基膜在62℃下干燥12min，然后用80℃的去离子水洗净，再在质量浓度为13％的1,2,4-三羟基丁烷中浸泡8min，取出后58℃烘干得到所述高通量改性膜。
(3)高效液相色谱条件的建立：比较不同色谱柱及液体流动相在不同比例、流速、pH条件下对肽母液的分离效果，得到高效液相色谱；
其中，高效液相色谱为：色谱柱CAPCELL PAK C18(4.6×250mm，5μm)；流动相甲醇：21mM PH7.1磷酸缓冲液＝5：95；流速0.5mL/min；进样体积10.2μL；检测波长：210nm；运行时间：22min；
(4)测定金枪鱼加工副产物中粗提液、透过液和截留液中组氨酸二肽含量及回收率；
(5)采用步骤(3)所述的高效液相色谱技术TSKgel 2500凝胶柱对针式滤膜分离后液体的分子量范围进行分析，针式滤膜的孔径为0.45μm滤膜，进样量10.4μL，流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝40：61：0.5；检测波长220nm流速0.55mL/min柱温30.5℃，分析金枪鱼加工副产物相的对分子质量及纯度。
实施例2
膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，包括如下处理步骤：
(1)配置母液：将鹅肌肽配成浓度为1mg/mL母液备用；
(2)粗提液处理：将金枪鱼加工副产物的粗提液进行0.5μm陶瓷膜微滤处理，截留液加水进行透析，重复4次，收集透过液并合并；依次采用1000Da、200Da高通量改性膜进行分离，反渗透RO膜进行物料浓缩；
其中，高通量改性膜的制备过程如下：
1)将硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸溶解在三乙醇胺中，加入质量浓度为28％的硫酸，超声分散15min，然后加热至105℃水热反应18h，冷却至室温后将产物过滤、清洗、干燥得到配位体基架；硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸的质量比为1：1.2：0.4，硫酸与三乙醇胺的体积比为1：44；
2)将配位体基架和1-(3-氨基丙基)咪唑加入乙醇中，氮气保护下搅拌4-6h；再加入3-异硫氰酸溴丙酯，氮气保护下反应16h，继续加入六氟磷酸钠，45℃搅拌反应8h；将产物过滤后用无水乙醇洗净、真空干燥后得到金属离子吸附体改性的配位体基架；配位体基架、1-(3-氨基丙基)咪唑、3-异硫氰酸溴丙酯及六氟磷酸钠的质量比为2.6：1.2：2：0.8；
3)将咪唑溶于去离子水中，然后加入金属离子吸附体改性的配位体基架，分散均匀后调节溶液pH值至5.5，得到A溶液，A溶液中咪唑的质量浓度为1％；将均苯三甲酰氯加入正丁醇中，搅拌溶解后得到均苯三甲酰氯的质量浓度为0.8％的B溶液；咪唑与配位体基架的质量比为2.5：1；
4)将多孔聚醚砜基膜浸入A溶液中浸泡15min，取出后将多孔聚醚砜基膜上多余的A溶液吹扫干净；再将多孔聚醚砜基膜浸入B溶液中反应35min；取出后将多孔聚醚砜基膜在60℃下干燥10min，然后用75℃的去离子水洗净，再在质量浓度为10％的1,2,4-三羟基丁烷中浸泡6min，取出后55℃烘干得到所述高通量改性膜。
(3)高效液相色谱条件的建立：比较不同色谱柱及液体流动相在不同比例、流速、pH条件下对肽母液的分离效果，得到高效液相色谱；
其中，高效液相色谱为：色谱柱CAPCELL PAK C18(4.6×250mm，5μm)；流动相甲醇：20mM PH7.0-7.2磷酸缓冲液＝5：94；流速0.4mL/min；进样体积10μL；检测波长：210nm；运行时间：20min；分析金枪鱼加工副产物中组氨酸二肽的纯度。
(4)测定金枪鱼加工副产物中粗提液、透过液和截留液中组氨酸二肽含量及回收率；(5)采用步骤(3)所述的高效液相色谱技术TSKgel 2500凝胶柱对针式滤膜分离后液体的分子量范围进行分析，针式滤膜的孔径为0.44μm滤膜，进样量10μL，流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝40：60：0.4；检测波长220nm流速0.5mL/min柱温30℃，分析金枪鱼加工副产物相的对分子质量。
实施例3
膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，包括如下处理步骤：
(1)配置母液：将鹅肌肽配成浓度为1.2mg/mL母液备用；
(2)粗提液处理：将金枪鱼加工副产物的粗提液进行0.55μm陶瓷膜微滤处理，截留液加水进行透析，重复6次，收集透过液并合并；依次采用1000Da、200Da高通量改性膜进行分离，反渗透RO膜进行物料浓缩；
其中，高通量改性膜的制备过程如下：
1)将硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸溶解在三乙醇胺中，加入质量浓度为28-34％的硫酸，超声分散20min，然后加热至115℃水热反应22h，冷却至室温后将产物过滤、清洗、干燥得到配位体基架；硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸的质量比为1：1.6：0.6，硫酸与三乙醇胺的体积比为1：48；
2)将配位体基架和1-(3-氨基丙基)咪唑加入乙醇中，氮气保护下搅拌6h；再加入3-异硫氰酸溴丙酯，氮气保护下反应20h，继续加入六氟磷酸钠，50℃搅拌反应10h；将产物过滤后用无水乙醇洗净、真空干燥后得到金属离子吸附体改性的配位体基架；配位体基架、1-(3-氨基丙基)咪唑、3-异硫氰酸溴丙酯及六氟磷酸钠的质量比为3：1.4：2.4：1.2；
3)将咪唑溶于去离子水中，然后加入金属离子吸附体改性的配位体基架，分散均匀后调节溶液pH值至6，得到A溶液，A溶液中咪唑的质量浓度为1.2％；将均苯三甲酰氯加入正丁醇中，搅拌溶解后得到均苯三甲酰氯的质量浓度为1.2％的B溶液；咪唑与配位体基架的质量比为3：1；
4)将多孔聚醚砜基膜浸入A溶液中浸泡18min，取出后将多孔聚醚砜基膜上多余的A溶液吹扫干净；再将多孔聚醚砜基膜浸入B溶液中反应40min；取出后将多孔聚醚砜基膜在65℃下干燥15min，然后用85℃的去离子水洗净，再在质量浓度为16％的1,2,4-三羟基丁烷中浸泡10min，取出后60℃烘干得到所述高通量改性膜。
(3)高效液相色谱条件的建立：比较不同色谱柱及液体流动相在不同比例、流速、pH条件下对肽母液的分离效果，得到高效液相色谱；
其中，高效液相色谱为：色谱柱CAPCELL PAK C18(4.6×250mm，5μm)；流动相甲醇：22mM PH7.2磷酸缓冲液＝5：96；流速0.6mL/min；进样体积10.5μL；检测波长：210nm；运行时间：25min；
(4)测定金枪鱼加工副产物中粗提液、透过液和截留液中组氨酸二肽含量及回收率；
(5)采用步骤(3)所述的高效液相色谱技术TSKgel 2500凝胶柱对针式滤膜分离后液体的分子量范围进行分析，针式滤膜的孔径为0.46μm滤膜，进样量10.8μL，流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝40：62：0.6；检测波长220nm流速0.6mL/min柱温31℃，分析金枪鱼加工副产物相的对分子质量。
对比例1与实施例1的区别在于，将高通量改性膜替换成步骤(1)的陶瓷膜，其余步骤均与实施例1相同。
对比例2与实施例1的区别在于，未加入金属离子吸附体对配位体基架进行改性，其余步骤均与实施例1相同。
对比例3与实施例1的区别在于，直接将入金属离子吸附体与配位体基架进行共混，其余步骤均与实施例1相同；
高通量改性膜的制备过程如下：
1)将硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸溶解在三乙醇胺中，加入质量浓度为30％的硫酸，超声分散18min，然后加热至110℃水热反应20h，冷却至室温后将产物过滤、清洗、干燥得到配位体基架；硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸的质量比为1：1.4：0.5，硫酸与三乙醇胺的体积比为1：46；
2)将1-(3-氨基丙基)咪唑加入乙醇中，氮气保护下搅拌5h；再加入3-异硫氰酸溴丙酯，氮气保护下反应18h，继续加入六氟磷酸钠，48℃搅拌反应9h；将产物过滤后用无水乙醇洗净、真空干燥后得到金属离子吸附体，再将金属离子吸附体和配位体基架混合，得到混合物；1-(3-氨基丙基)咪唑、3-异硫氰酸溴丙酯及六氟磷酸钠的质量比为1.3：2.2：1；配位体基架与金属离子吸附体的质量比为1.5：0.8；
3)将咪唑溶于去离子水中，然后加入金属离子吸附体和配位体基架混合物，分散均匀后调节溶液pH值至5.8，得到A溶液，A溶液中咪唑的质量浓度为1.1％；将均苯三甲酰氯加入正丁醇中，搅拌溶解后得到均苯三甲酰氯的质量浓度为1％的B溶液；咪唑与配位体基架的质量比为2.8：1；
4)将多孔聚醚砜基膜浸入A溶液中浸泡16.5min，取出后将多孔聚醚砜基膜上多余的A溶液吹扫干净；再将多孔聚醚砜基膜浸入B溶液中反应38min；取出后将多孔聚醚砜基膜在62℃下干燥12min，然后用80℃的去离子水洗净，再在质量浓度为13％的1,2,4-三羟基丁烷中浸泡8min，取出后58℃烘干得到所述高通量改性膜。
对以上实施例1-3及对比例1-3，对母液采取二倍稀释法用超纯水稀释成0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL、0.015625mg/mL，分别进行测定分析，得到肌肽、鹅肌肽的标准曲线，并将曲线进行线性回归分析，利用面积归一化法，最终得到相关的结果及结论。
表1实施例1中制备高纯度组氨酸二肽工艺的各评估参数/膜工艺参数
Figure BDA0003182821830000101
表2实施例1中金枪鱼加工副产物中基本营养成分的损失率
总糖 蛋白 可溶性固形物 盐度
损失率/％ 6.07±0.89 1.69±0.21 0.84±0.06 -
表3各项目中制备高纯度组氨酸二肽的工艺的相关参数评价指标
Figure BDA0003182821830000102
结论：由实施例1-3可以看出，在本发明制备步骤及制备工艺范围内制备出来的组氨酸二肽具有较高的纯度和较低金属离子含量，具有较高的组氨酸二肽提取效率。
对比例1与实施例1的区别在于，将高通量改性膜替换成步骤(1)的陶瓷膜，由于陶瓷膜不具有金属离子吸附作用，且随着过滤时间的增加，膜孔会被大量堵塞，过滤分离效率低，致使最终鹅肌肽的纯度降低及金属离子含量升高。对比例2与实施例1的区别在于，未加入金属离子吸附体对配位体基架进行改性，其余步骤均与实施例1相同，不能有效吸附并去除粗提液中的金属离子，导致最终金属离子含量升高；对比例3与实施例1的区别在于，直接将入金属离子吸附体与配位体基架进行共混；金属离子吸附体与配位体基架的连接性能降低，随着高通量改性膜使用时间的延长，金属离子吸附体易从配位体基架上脱落，导致最终高通量改性膜的除杂功能下降。
图1说明了本发明的高效液相色谱检测方法能够很好的将鹅肌肽与肌肽进行分离；图2说明了经过线性方程拟合，得到纯度鹅肌肽含量拟合曲线；图3是实施例1的分子量标准曲线图，并依据各个标准的分子量进行分离；图4较好的验证了本发明膜分离后分子量大小的准确性。
由上述实施例1-3及对比例1-3相关的数据可知，只有在本发明权利要求范围内的方案，才能够在各方面均能满足上述要求，得出最优化的方案，得到最优的高纯度组氨酸二肽制备工艺。而对于配比的改动、原料的替换/加减，或者加料顺序的改变，均会带来相应的负面影响。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，其特征在于，包括如下处理步骤：
（1）配置母液：将组氨酸二肽配成母液备用；所述组氨酸二肽为鹅肌肽或肌肽；
（2）粗提液处理：将金枪鱼加工副产物的粗提液进行陶瓷膜微滤处理，再对截留液加水进行透析，收集透过液并合并，继续采用高通量改性膜进行分离，物料浓缩；
所述高通量改性膜的制备过程如下：
1）将硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸溶解在三乙醇胺中，加入质量浓度为28-34%的硫酸，超声分散15-20min，然后加热至105-115℃水热反应18-22h，冷却至室温后将产物过滤、清洗、干燥得到配位体基架；
2）将配位体基架和1-（3-氨基丙基）咪唑加入乙醇中，氮气保护下搅拌4-6h；再加入3-异硫氰酸溴丙酯，氮气保护下反应16-20h，继续加入六氟磷酸钠，45-50℃搅拌反应8-10h；将产物过滤后用无水乙醇洗净、真空干燥后得到金属离子吸附体改性的配位体基架；
3）将咪唑溶于去离子水中，然后加入金属离子吸附体改性的配位体基架，分散均匀后调节溶液pH值至5.5-6，得到A溶液，A溶液中咪唑的质量浓度为1-1.2%；将均苯三甲酰氯加入正丁醇中，搅拌溶解后得到均苯三甲酰氯的质量浓度为0.8-1.2%的B溶液；
4）将多孔聚醚砜基膜浸入A溶液中浸泡15-18min，取出后将多孔聚醚砜基膜上多余的A溶液吹扫干净；再将多孔聚醚砜基膜浸入B溶液中反应35-40min；取出后将多孔聚醚砜基膜在60-65℃下干燥10-15min，然后用75-85℃的去离子水洗净，再在质量浓度为10-16%的1,2,4-三羟基丁烷中浸泡6-10min，取出后55-60℃烘干得到所述高通量改性膜；
（3）高效液相色谱条件的建立：比较不同色谱柱及液体流动相在不同比例、流速、pH条件下对肽母液的分离效果，得到高效液相色谱；
所述步骤（3）中的高效液相色谱为：色谱柱CAPCELL PAK C18，4.6×250 mm，5μm；流动相甲醇：20-22mM PH7.0-7.2 磷酸缓冲液=5：94-96；流速0.4-0.6 mL/min；进样体积10-10.5μL；检测波长：210 nm；运行时间：20-25min；
（4）测定金枪鱼加工副产物中各阶段组氨酸二肽含量及回收率；
（5）分析金枪鱼加工副产物相的对分子质量及纯度；
所述步骤（5）的具体过程为：采用高效液相色谱技术TSKgel 2500凝胶柱对针式滤膜分离后液体的分子量范围进行分析，针式滤膜的孔径为0.44-0.46μm滤膜，进样量10-10.8μL，流动相：乙腈：水：三氟乙酸=40：60-62：0.4-0.6；检测波长220nm流速0.5-0.6 mL/min柱温30-31℃。
2.根据权利要求1所述的膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，其特征在于，步骤（1）中母液的浓度为1-1.2mg/mL；步骤（2）的具体过程为：将金枪鱼加工副产物的粗提液进行0.5-0.55μm陶瓷膜微滤处理，截留液加水进行透析，重复4-6次，收集透过液并合并；依次采用1000Da、200Da高通量改性膜进行分离，反渗透RO膜进行物料浓缩。
3.根据权利要求1所述的膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，其特征在于，步骤（4）中，各阶段肽指的是粗提液、透过液和截留液的中的肽含量。
4.根据权利要求1所述的膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，其特征在于，所述步骤1）中，硫酸锆和2，5-二氨基对苯二甲酸及硫酸的质量比为1：1.2-1.6：0.4-0.6，硫酸与三乙醇胺的体积比为1：44-48。
5.根据权利要求1所述的膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，其特征在于，所述步骤2）中，配位体基架、1-（3-氨基丙基）咪唑、3-异硫氰酸溴丙酯及六氟磷酸钠的质量比为2.6-3：1.2-1.4：2-2.4：0.8-1.2。
6.根据权利要求1所述的膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，其特征在于，所述步骤3）中，咪唑与配位体基架的质量比为2.5-3：1。
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