CN115232182B - 一种高纯度中生菌素d对照品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高纯度中生菌素D对照品及其制备方法，中生菌素母药依次经过活性炭脱色、凝胶分离、脱盐凝胶脱盐、低压浓缩、高压色谱制备分离、浓缩冻干的步骤得到纯度≥96%的中生菌素D对照品。本发明可应用于目前企业生产中生菌素质量分数的检测，填补了目前中生菌素物对照品的空白，极大的降低了中生菌素的质量控制成本，有效的解决了中生菌素质量层次不齐的现象，有利于增强生物农药企业的可持续发展。

Description

一种高纯度中生菌素D对照品及其制备方法
技术领域
本发明属于农用抗生素提纯技术领域，具体涉及一种高纯度中生菌素D对照品及其制备方法。
背景技术
中生菌素，化学名称为链丝菌素（streptothricins），是最早发现的抗生素之一，链丝菌素早在1942年即由Waksman的研究小组所发现，但其化学结构一直到1982年才通过人工全合成而最终确定。中生菌素的化学结构由链里定内酰胺、古洛糖胺和赖氨酸侧链三部分组成，具有杀菌活性的主要成分有7个，根据赖氨酸的数量从1-7分别命名为链丝菌素F、E、D、C、B、A和X。
中生菌素抗菌谱广，能抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、分枝杆菌、酵母菌及丝状真菌，对人畜中等毒性。我国目前有效登记的中生菌素原药及制剂共有42个品种，其中12%中生菌素母药登记产品1个，3%中生菌素可湿性粉剂13个，5%中生菌素可湿性粉剂1个，混配可湿性粉剂22个，其余为颗粒剂及水剂等，可以看出可湿性粉剂制剂占有绝大部分的比例，主要用于防治苹果轮纹病、黄瓜细菌性角斑病、番茄青枯病等病害。目前福建凯立母药年产值折百约120t，按照市场价100-120万/吨的价格估算，价值约1.4亿元左右，生产为制剂价值约4.5亿/年，在生物农药的市场占有率很可观。根据我们前期对中生菌素的检测发现，中生菌素产品中，中生菌素D占总有效成分的25%左右，在使用中贡献了很大的活性。但是目前国内中生菌素的检测大多以生物测定法为主，众所周知，生物测定法在作为质量控制的过程中无法对产品进行有效的定性分析，且检测时间长，目前即使有个别厂家以高效液相法作为质量控制方法，但是苦于市场无中生菌素对照品，企业所进行的方法均无法对中生菌素进行有效的定性定量分析，所以提纯制备高纯度的中生菌素对照品应用于产品质量控制至关重要。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种高纯度中生菌素D对照品及其制备方法，首先利用活性炭对解析液进行脱色处理，然后用分离凝胶进行粗分离，减压浓缩减少体积，然后利用盐不溶于甲醇而中生菌素溶于甲醇的原理，用甲醇进行粗除盐，再用脱盐凝胶对浓缩液进行脱盐处理，将脱盐后的脱盐溶液进行减压浓缩，最后高压制备，浓缩冻干，得到纯度为96%以上的中生菌素D对照品。
为了实现发明目的，本发明采用如下技术方案，一种高纯度的中生菌素D对照品的制备方法，中生菌素母药依次经过活性炭脱色、凝胶分离、脱盐凝胶脱盐、低压浓缩、高压色谱制备分离、浓缩冻干的步骤得到纯度≥96%的中生菌素D对照品。
更为具体的，本发明所采取的技术方案如下：所述的制备方法，包括以下工艺步骤：
1）活性炭脱色：中生菌素母药溶解，溶解浓度为8~12%，加入活性炭，搅拌，温度控制在35~40℃，静置，用滤纸进行过滤，除去活性炭；
2）凝胶分离：将步骤1）的过滤溶液上分离凝胶进行分离，流动相为甲醇，流速为0.5~1BV/h，分段收集流出液，对流出液进行检测，收集含有中生菌素D馏分；
3）减压浓缩，甲醇除盐：将步骤2）的滤液进行浓缩，浓缩完成后，加入甲醇，洗出中生菌素，然后继续浓缩，重复上述步骤约2~3次，最后将甲醇蒸干，将剩余固形物用纯水进行溶解；
4）脱盐凝胶脱盐：将步骤3）的溶液分次上脱盐凝胶，待样品完全进入凝胶后，加纯水作为流动相，流速0.5~1BV/h，分段收集流出液，对流出液进行检测，收集含有中生菌素D馏分；
5）减压浓缩：将含有中生菌素D的馏分进行混合，浓缩减少体积；
6）高压制备：将步骤5）的浓缩液用高压制备色谱仪进行高压制备，收集含中生菌素D馏分，制备后中生菌素D的纯度≥96%；
7）减压浓缩、冻干：将步骤6）制备出的中生菌素D纯度≥96%馏分混合菌素进行浓缩，将浓缩液冻干，得到纯度≥96%的白色固体中生菌素D对照品。
在本发明的优选实施步骤中，步骤（1）中，活性炭浓度为0.2%~0.5%。
在本发明的优选实施步骤中，步骤（2）中，分离凝胶为Sephadex G，1L凝胶上样量为8~10ml，流动相为3%~5%甲醇。
在本发明的优选实施步骤中，步骤（6）中，制备过程中，流速30~70ml/min，检测波长200nm，上样体积1~3ml；色谱柱50mm*250mm，内装C18、10μm填料，流动相3~5%甲醇。
本发明还保护上述制备方法制备得到的中生菌素D对照品，其纯度≥96%。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明提纯制备中生菌素D纯度≥96%，制备工艺相对简单，操作性更强。
（2）本发明的方法可应用于目前企业生产中生菌素的质量检测，填补了目前中生菌素物对照品的空白，极大的降低了中生菌素的质量控制成本，有效的解决了中生菌素质量层次不齐的现象，有利于增强生物农药企业的可持续发展。
附图说明
下面结合附图作进一步的说明。
图1为中生菌素D分子式。其中n=3。
图2为实施例1制得的中生菌素D对照品的1H-NMR（500Mz，D2O）谱图。
图3为实施例1制得的中生菌素D对照品的13C-NMR（125Mz，D2O）谱图。
图4为实施例1制得的中生菌素D对照品的高分辨质谱图。
图5为实施例1制得的中生菌素D对照品液相色谱图。
具体实施方式
本发明实质性特点下面用实例予以说明，应该理解为，实例是用于说明，并不限制该发明的实施方式，本发明的范围和核心内容依据权利要求加以说明。
实施例1
1）活性炭脱色：中生菌素母药溶解，溶解浓度为10%，加入0.5%活性炭，搅拌，温度控制在35±2℃，静置2h，用滤纸进行过滤，除去活性炭；
2）凝胶分离：将步骤1）过滤溶液上分离凝胶Sephadex G进行分离，1L凝胶上样量为8ml，流动相为3%甲醇，流速为0.5BV/h，分段收集流出液，对流出液进行检测，收集含有中生菌素D馏分；
3）减压浓缩，甲醇除盐：将步骤2）滤液进行浓缩，浓缩完成后，加入甲醇，洗出中生菌素，然后继续浓缩，重复上述步骤约2次，最后将甲醇蒸干，将剩余固形物用纯水进行溶解；
4）脱盐凝胶脱盐：将步骤3）溶液分次上脱盐凝胶，待样品完全进入凝胶后，加纯水作为流动相，流速1BV/h，分段收集流出液，对流出液进行检测，收集含有中生菌素D馏分；
5）减压浓缩：将含有中生菌素D的馏分进行混合，浓缩减少体积；
6）高压制备：将步骤5）浓缩液用高压制备色谱仪进行高压制备，流速30ml/min，检测波长200nm，流动相为4%甲醇，上样体积3ml，收集含中生菌素馏分，制备后中生菌素D纯度≥96%；
7）减压浓缩、冻干：将步骤6）制备出的中生菌素D纯度≥96%馏分混合菌素进行浓缩，将浓缩液冻干，得到纯度96.5%的白色固体中生菌素D对照品。
实施例2
1）活性炭脱色：中生菌素母药溶解，溶解浓度为8%，加入0.5%活性炭，搅拌，温度控制在35±2℃，静置2h，用滤纸进行过滤，除去活性炭；
2）凝胶分离：将步骤1）过滤溶液上分离凝胶Sephadex G进行分离，1L凝胶上样量为10ml，流动相为3%甲醇，流速为0.5BV/h，分段收集流出液，对流出液进行检测，收集含有中生菌素D馏分；
3）减压浓缩，甲醇除盐：将步骤2）滤液进行浓缩，浓缩完成后，加入甲醇，洗出中生菌素，然后继续浓缩，重复上述步骤约2次，最后将甲醇蒸干，将剩余固形物用纯水进行溶解；
4）脱盐凝胶脱盐：将步骤3）溶液分次上脱盐凝胶，待样品完全进入凝胶后，加纯水作为流动相，流速1BV/h，分段收集流出液，对流出液进行检测，收集含有中生菌素D馏分；
5）减压浓缩：将含有中生菌素D的馏分进行混合，浓缩减少体积；
6）高压制备：将步骤5）浓缩液用高压制备色谱仪进行高压制备，流速30ml/min，检测波长200nm，流动相为3%甲醇，上样体积3ml，收集含中生菌素馏分，制备后中生菌素D纯度≥97.1%；
7）减压浓缩、冻干：将步骤6）制备出的中生菌素D纯度≥96%馏分混合菌素进行浓缩，将浓缩液冻干，得到纯度96.5%的白色固体中生菌素D对照品。
实施例3
1）活性炭脱色：中生菌素母药溶解，溶解浓度为10%，加入0.5%活性炭，搅拌，温度控制在35±2℃，静置2h，用滤纸进行过滤，除去活性炭；
2）凝胶分离：将步骤1）过滤溶液上分离凝胶Sephadex G进行分离，1L凝胶上样量为8ml，流动相为5%甲醇，流速为0.5BV/h，分段收集流出液，对流出液进行检测，收集含有中生菌素D馏分；
3）减压浓缩，甲醇除盐：将步骤2）滤液进行浓缩，浓缩完成后，加入甲醇，洗出中生菌素，然后继续浓缩，重复上述步骤约2次，最后将甲醇蒸干，将剩余固形物用纯水进行溶解；
4）脱盐凝胶脱盐：将步骤3）溶液分次上脱盐凝胶，待样品完全进入凝胶后，加纯水作为流动相，流速1BV/h，分段收集流出液，对流出液进行检测，收集含有中生菌素D馏分；
5）减压浓缩：将含有中生菌素D的馏分进行混合，浓缩减少体积；
6）高压制备：将步骤5）浓缩液用高压制备色谱仪进行高压制备，流速30ml/min，检测波长200nm，流动相为5%甲醇，上样体积3ml，收集含中生菌素馏分，制备后中生菌素D纯度≥96.6%；
7）减压浓缩、冻干：将步骤6）制备出的中生菌素D纯度≥96%馏分混合菌素进行浓缩，将浓缩液冻干，得到纯度96.5%的白色固体中生菌素D对照品。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。在不脱离本发明构思的前提下，对这些已描述的实施方式作出的若干替代或变型，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种高纯度的中生菌素D对照品的制备方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：
1）活性炭脱色：中生菌素母药溶解，溶解浓度为8~12%，加入活性炭，搅拌，温度控制在35~40℃，静置，用滤纸进行过滤，除去活性炭；
2）凝胶分离：将步骤1）的过滤溶液上分离凝胶进行分离，流动相为甲醇，流速为0.5~1BV/h，分段收集流出液，对流出液进行检测，收集含有中生菌素D馏分；分离凝胶为Sephadex G，1L凝胶上样量为8~10ml，流动相为3%~5%甲醇；
3）减压浓缩，甲醇除盐：将步骤2）的滤液进行浓缩，浓缩完成后，加入甲醇，洗出中生菌素，然后继续浓缩，重复上述步骤2~3次，最后将甲醇蒸干，将剩余固形物用纯水进行溶解；
4）脱盐凝胶脱盐：将步骤3）的溶液分次上脱盐凝胶，待样品完全进入凝胶后，加纯水作为流动相，流速0.5~1BV/h，分段收集流出液，对流出液进行检测，收集含有中生菌素D馏分；
5）减压浓缩：将含有中生菌素D的馏分进行混合，浓缩减少体积；
6）高压制备：将步骤5）的浓缩液用高压制备色谱仪进行高压制备，收集含中生菌素D馏分，制备后中生菌素D的纯度≥96%；
7）减压浓缩、冻干：将步骤6）制备出的中生菌素D纯度≥96%馏分混合菌素进行浓缩，将浓缩液冻干，得到纯度≥96%的白色固体中生菌素D对照品；
步骤1）中，活性炭浓度为0.2%~0.5%；
步骤6）中，制备过程中，流速30~70ml/min，检测波长200nm，上样体积1~3ml；色谱柱50mm*250mm，内装C18、10μm填料，流动相3~5%甲醇。
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