CN113121320B

CN113121320B - 一种使用高速逆流色谱分离杨梅树皮中杨梅醇的方法

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Publication number: CN113121320B
Application number: CN202110425169.1A
Authority: CN
Inventors: 贺凯; 李莎; 李甜丹; 吴卫华; 阳慧; 石丽萍
Original assignee: Hunan University of Medicine
Current assignee: Hunan University of Medicine
Priority date: 2021-04-20
Filing date: 2021-04-20
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2041-04-20
Also published as: CN113121320A

Abstract

本发明公开了一种使用高速逆流色谱分离杨梅醇的方法。具体是以杨梅树皮为原料，经乙醇渗漉提取、浓缩、萃取、大孔树脂富集后使用高速逆流色谱得到杨梅醇纯品。该方法原料便宜，且操作简单、耗时短、适用范围广、对环境污染小、易于工业推广。纯化所得的杨梅醇含量为95％以上。本发明所制备的杨梅醇在抗癌、改善阿尔兹海默症、调血脂和改善肌功能障碍等领域有巨大的应用前景。

Description

一种使用高速逆流色谱分离杨梅树皮中杨梅醇的方法

技术领域

本发明属于植物有效成分提取的技术领域，公开了一种简单的分离、纯化杨梅树皮中杨梅醇的方法。

背景技术

杨梅树是中国南方地区的一种特有果树，在我国分布广泛，资源丰富。杨梅树皮是湘西侗族人民治疗腹泻、肠胃炎的习用药材，其具有的清热降火、利湿去浊、收敛等功效在民间口口相传。杨梅树皮中富含杨梅素、杨梅苷、杨梅醇等活性成分。其中，杨梅素是一种天然黄酮类化合物，具有巨大的营养和药理价值，目前已被美国FDA批准可作为保健品、化妆品和药品。杨梅醇(Myricanol)具有许多生物活性，包括抗癌、逆转阿尔茨海默病、抑制一氧化氮的产生、保护肝脏损伤和抗雄激素活性。药理研究表明，杨梅醇能显著抑制人肺腺癌(A549)、肝癌(HepG2)和人早幼粒细胞白血病(HL-60)细胞的增殖。此外，研究报道杨梅醇促进HEK293T细胞中tau蛋白介导的细胞自噬和清除。动物实验证明，杨梅醇可激活AMP活化蛋白激酶抑制3t3-l1脂肪细胞和高脂饲料斑马鱼体内脂质的积累。此外，杨梅醇通过sirtuin1依赖机制改善地塞米松诱导的肌肉功能障碍。分子对接研究揭示杨梅醇能与的SIRT1激活位点结合，发挥其他SIRT1激活剂相似活性。综上，杨梅醇有巨大的研究和临床应用价值。

目前国内外分离杨梅醇的方法主要是硅胶柱色谱法，聚酰胺柱色谱法和葡聚糖凝胶柱色谱法。这些方法虽然能分离得到杨梅醇，但存在死吸附、耗时、耗有机溶剂、成本较高等缺陷。高速逆流色谱(highspeed countercurrent chromatography，HSCCC)是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术。它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性。此外，大孔树脂在中药成分分离中具有理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性好，不受无机盐类及强离子、低分子化合物存在的影响，可重复使用3-5次，成本低、环境友好等优点。

本发明研发了一种可重复使用的大孔树脂富集杨梅醇，结合高速逆流色谱法分离杨梅树皮中杨梅醇的技术路线，具有简单、经济、环境友好，产物纯度高等特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便的从杨梅树皮中提取杨梅醇的方法。该方法具有简单、高效、低成本、污染少等优点。所制备的杨梅醇纯度能达到95％以上，可开发成具有抗心血管疾病、抗癌、改善肌损伤、抗阿尔兹海默症等功效的药品、食品、保健品和化妆品。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种使用高速逆流色谱分离杨梅醇的方法，包括以下步骤：

1)杨梅树皮粉碎备用；

2)乙醇溶液或丙酮、甲醇浸提，浸提液浓缩得浸膏；

3)将步骤2)得到的杨梅树皮提取浸膏用水溶解，加入石油醚或正己烷萃取至上清液无色，然后将石油醚或正己烷萃取后分离的下层杨梅树皮提取物用乙酸乙酯萃取至上清液无色，得到乙酸乙酯部位浸膏；

4)步骤3)所得的乙酸乙酯部位浸膏溶解后过大孔树脂进行杨梅醇的富集，洗脱后浓缩得到浸膏；

5)采用高速逆流色谱纯化杨梅醇。

进一步地，步骤1)中杨梅树皮风干后粉碎备用，粉碎粒径范围0.5-5.0mm，优选1-2mm，最优选1.5mm。

进一步地，步骤2)中采用丙酮、甲醇或者75-95％乙醇溶液浸提，乙醇溶液浓度优选90-95％，最优选95％，优选渗漉浸提。

进一步地，步骤2)的具体过程如下：

将粉碎后的杨梅树皮粉末加入渗漉罐，加入浸提溶剂，料液比1：2-1：5，优选1:4，浸提12-24小时，优选18-24h，最优选24h，后浓缩成含水率5-10％的浓缩浸膏，优选浓缩浸膏在45-55℃烘干到含水率1％以下。

进一步地，步骤3)的具体过程如下：

将步骤2)获得的浓缩浸膏或者烘干后的浓缩浸膏用去离子水搅拌溶解，质量体积比为1:10-1:50g/ml，优选1:20-1:30g/ml，最优选1:25g/ml，溶解后按体积比1:1-1:3，优选1:2，加入石油醚萃取，静止去乳化层，收集上清，用石油醚萃取至上清液无色后，将下层杨梅树皮提取物用乙酸乙酯按照体积比1：1-1：3，优选1:2，萃取，离心去除乳化层，收集上清，待乙酸乙酯萃取至上清液无色后，浓缩成含水率1-5％的乙酸乙酯萃取部位浸膏，优选继续在45-55℃烘干到含水率1％以下。

进一步地，用乙酸乙酯萃取时，2000rpm-5000rpm/min，优选3000-4000rpm/min离心3-5分钟来去除乳化层。

进一步地，步骤4)的具体过程如下：

步骤3)所得的乙酸乙酯部位浸膏或者烘干的乙酸乙酯萃取部位浸膏溶解后过大孔树脂，树脂型号D101、AB-8或HPD-100，优选D101进行杨梅醇的富集，依次用去离子水、递增梯度10-30％的各浓度的乙醇溶液洗脱；70-90％乙醇溶液洗脱部位浓缩得到含水率1-5％的浸膏，优选继续45-55℃烘干到含水率1％以下。

进一步地，依次用去离子水、30％、50％、70％、90％和100％乙醇洗脱。

进一步地，步骤3)所得的乙酸乙酯部位浸膏或者烘干的乙酸乙酯萃取部位浸膏80-120g，优选90-110g，最优选100g；用800-1500ml 7％-15％乙醇水溶液溶解后用2000-3000g，优选2500g大孔树脂进行杨梅醇的富集。

本发明采用的大孔树脂能够很好的对杨梅醇进行富集，这是后续进行高速逆流色谱分离纯化的基础。

进一步地，步骤5)的具体过程如下：

使用以下任一种不同的两相溶剂体系分离得到杨梅树皮中杨梅醇：

高速逆流色谱分离的溶剂体系为二氯甲烷：甲醇：水＝5:3.5-4.5:2，优选5:3.8-4.2:2，最优选5:4:2，称取步骤4)中70％-90％乙醇，优选80-90％乙醇洗脱乙酸乙酯部位浸膏或者烘干的乙酸乙酯部位浸膏300-500mg，优选350-450mg，将5-10ml配制好的溶剂体系中的上相取30％-70％，下相取30％-70％，优选上、下相各取50％，溶解后上机分离；分离条件为：循环水浴温度为25-30℃，流速为1-5.0mL/min，优选3.0mL/min，转速为800～900rpm/min；

或者，

高速逆流色谱分离的溶剂体系为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:0.5-1.5:0.5-1.5:1，优选1:0.8-1.2:0.8-1.2:1，最优选1:1:1:1，称取步骤4)中70％-90％乙醇，优选80-90％乙醇洗脱乙酸乙酯部位浸膏或者烘干的乙酸乙酯部位浸膏300-500mg，优选350-450mg，将5-10ml配制好的溶剂体系中的上相取30％-70％，下相取30％-70％，优选上、下相各取50％，溶解后上机分离；分离条件为：循环水浴温度为25-30℃，流速为1-5.0mL/min，优选3.0mL/min，转速为800～900rpm/min。

采用高速逆流色谱分离的溶剂体系为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水时，采用正向洗脱和反向洗脱的方式进行。

上述方法中杨梅树皮优选采自7月份。

本发明有益效果在于：本发明公开了一种从杨梅树皮中提取杨梅醇的方法，将杨梅树皮烘干、粉碎，用工业酒精渗漉提取后通过用石油醚、乙酸乙酯依次萃取。然后用大孔树脂富集杨梅醇，结合高速逆流色谱进一步纯化即可得到杨梅醇单体。该方法具有简单、高效、低成本、污染少等优点。所制备的杨梅醇纯度能达到95％以上，可开发成具有抗心血管疾病、抗癌、改善肌损伤、抗阿尔兹海默症等功效的药品、食品、保健品和化妆品。使用该法纯化杨梅醇生产成本低，效率高，可以应用于工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1制备得到的杨梅醇氢谱图；

图2为本发明实施例1制备得到的杨梅醇碳谱图；

图3为本发明实施例1制备得到的杨梅醇化学结构式。

图4为本发明实施例1用二氯甲烷：甲醇：水＝5:4:2制备杨梅醇的高速逆流色谱结果图；

图5为本发明实施例1用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:1:1:1制备杨梅醇的高速逆流色谱结果图；

图6为本发明实施例1制备得到的乙酸乙酯总浸膏和70％、90％乙醇大孔树脂分离组分和杨梅醇的HPLC图；

图7为实施例2中二氯甲烷：甲醇：水＝5:4.5:2分离杨梅树皮中杨梅醇成分的高速逆流色谱结果图；

图8为实施例3中二氯甲烷：甲醇：水＝5:3.5:2分离杨梅树皮中杨梅醇成分的高速逆流色谱结果图；

图9为实施例2中正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:0.5:0.5:1分离杨梅树皮中杨梅醇成分的高速逆流色谱结果图；

图10为实施例3中正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:1.5:1.5:1分离杨梅树皮中杨梅醇成分的高速逆流色谱结果图。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1

1.杨梅树皮7月份采自湖南怀化市靖州，风干后粉碎备用，粉碎粒径1.5mm。

2.采用95％乙醇渗漉浸提，料液比1:4，室温下浸提24小时后放液并浓缩，依照此法浸提1-3次合并提取液，旋转蒸发仪浓缩至含水率8％，浓缩浸膏在50℃烘箱中烘干成块，含水率1％以下。

3.将步骤2所得烘干的杨梅树皮乙醇浸膏用去离子水搅拌溶解，质量体积(g/ml)比为1:25，溶解后按体积比1:2加入石油醚萃取，静止去乳化层，收集上清，用石油醚萃取至上清液无色后，将下层杨梅树皮提取物用乙酸乙酯按照体积比1：2萃取，3000rpm/min离心5分钟去除乳化层，收集上清，待乙酸乙酯萃取至上清液无色后，减压浓缩成含水率5％的膏状物后，在50℃烘干得到含水率1％以下的乙酸乙酯部位浸膏。

4.称取烘干的乙酸乙酯部位浸膏100g用1500ml 10％乙醇水溶液溶解后，湿法上样至D101大孔树脂柱进行杨梅醇的富集。用去离子水清洗4个柱体积后(每个柱体积3000ml左右)，依次用纯水，30％乙醇，50％乙醇，70％乙醇，90％乙醇和100％乙醇洗脱，每个梯度洗脱2-4个柱体积，减压浓缩得到各洗脱部位得到膏状物后，50℃烘干得到各组分浸膏。即可得到杨梅树皮乙酸乙酯浸膏的30％乙醇，50％乙醇，70％乙醇，90％乙醇和100％乙醇洗脱部位。经HPLC分析70％乙醇洗脱部位的杨梅醇纯度为46％，90％乙醇洗脱部位的杨梅醇纯度为63％。杨梅醇得到了较好的富集。

5.采用高速逆流色谱进一步分离纯化杨梅醇

高速逆流色谱的溶剂系统是通过以下方式筛选和确定的：

目标物的分配系数K在0.5到2之间时则可使样品实现较好的分离。分配系数K的测定方法：配备不同比例的溶剂系统，分层后得到上相、下相备用。精确称量300mg杨梅树皮乙酸乙酯浸膏的70％乙醇洗脱浸膏烘干粉末，用上述两相溶剂系统中的5mL下相和5mL上相进行充分溶解、萃取，静置分层后，取等量的上、下相(1ml)溶液真空干燥后用色谱纯甲醇定容到原体积，过膜，用HPLC法测定上、下相中目标峰面积AU；分配系数K＝上相中目标物AU/下相中目标物AU。

按照K值的最佳范围，结合分层时间，得出分离杨梅醇的最佳HSCCC溶剂体系为二氯甲烷：甲醇：水＝5:4:2(K值为0.52)和正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:1:1:1(K值为1.2)

因此选取二氯甲烷：甲醇：水＝5:4:2(K值为0.52)和正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:1:1:1(K值为1.2)作为杨梅醇的高速逆流色谱溶剂体系。

二氯甲烷：甲醇：水＝5:4:2分离条件：上样量400mg(70％乙醇洗脱杨梅树皮乙酸乙酯部位烘干浸膏)，用10ml二氯甲烷：甲醇：水＝5:4:2的两相体系中的上、下相各5ml溶解样品后上机分离；分离条件为：循环水浴温度为25℃，流速为3.0mL/min，转速为850rpm/min；该体系的固定相保留率为57.3％，待样品流出时，每9ml洗脱液装一管，35-45分钟之间的洗脱流动相中含有杨梅醇成分。整个分离过程在进样后130分钟结束，节约试剂和时间。将35-45分钟所得的洗脱液在50℃真空干燥后，用15ml乙酸乙酯完全溶解后，重结晶即得纯度为95％的杨梅醇(根据HPLC谱图的保留时间与峰面积计算)。

正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:1:1:1的分离条件：上样量400mg(90％乙醇洗脱杨梅树皮乙酸乙酯部位烘干浸膏)，用10ml正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:1:1:1的两相体系中的上、下相各5ml溶解样品后上机分离；分离条件为：循环水浴温度为25℃，流速为3.0mL/min，转速为850rpm/min；该体系的固定相保留率为72.1％，待样品流出时，每9ml洗脱液装一管。第90分钟开始反向洗脱(反向洗脱即转换分离柱至“out”端，以固定相作为流动相洗脱方向相反，其他条件与正向洗脱一样，这样可将固定相中不易洗脱出来的物质洗脱出来，下同)，160-180分钟之间的洗脱流动相中含有杨梅醇成分。整个分离过程在进样后200分钟结束，节约试剂和时间。将160-180分钟所得的洗脱液在50℃真空干燥后，用50ml乙酸乙酯完全溶解后，重结晶即得纯度为97％的杨梅醇(根据HPLC谱图的保留时间与峰面积计算)。

实施例2

1.杨梅树皮7月份采自湖南怀化市靖州，风干后粉碎备用，粉碎粒径范围0.5mm。

2.采用80％乙醇渗漉浸提，料液比1:5，室温下浸提20小时后放液并浓缩，依照此法浸提1-3次合并提取液，旋转蒸发仪浓缩至含水率6％，浓缩浸膏在45℃烘箱中烘干成块，含水率1％以下。

3.将步骤2所得烘干的杨梅树皮乙醇浸膏用去离子水搅拌溶解，质量体积(g/ml)比为1:20，溶解后按体积比1:1加入石油醚萃取，静止去乳化层，收集上清，用石油醚萃取至上清液无色后，将下层杨梅树皮提取物用乙酸乙酯按照体积比1：1萃取，2500rpm/min离心5分钟去除乳化层，收集上清，待乙酸乙酯萃取至上清液无色后，减压浓缩成含水率2％的膏状物后，在45℃烘干得到含水率1％以下的乙酸乙酯部位浸膏。

4.称取烘干的乙酸乙酯部位浸膏90g用1000ml 8％乙醇水溶液溶解后，湿法上样至AB-8大孔树脂柱进行杨梅醇的富集。用去离子水清洗4个柱体积后(每个柱体积3000ml左右)，依次用纯水，30％乙醇，50％乙醇，70％乙醇，90％乙醇和100％乙醇洗脱，每个梯度洗脱2-4个柱体积，减压浓缩得到各洗脱部位得到膏状物后，45℃烘干得到各组分浸膏。即可得到杨梅树皮乙酸乙酯浸膏的30％乙醇，50％乙醇，70％乙醇，90％乙醇和100％乙醇洗脱部位。

5.采用高速逆流色谱进一步分离纯化杨梅醇

二氯甲烷：甲醇：水＝5:4.5:2分离条件：上样量300mg(75％乙醇洗脱杨梅树皮乙酸乙酯部位烘干浸膏)，用8ml二氯甲烷：甲醇：水＝5:4.5:2的两相体系中的上相3ml、下相5ml溶解样品后上机分离；分离条件为：循环水浴温度为28℃，流速为2.0mL/min，转速为850rpm/min；该体系的固定相保留率为52.4％，待样品流出时，每9ml洗脱液装一管，50-60分钟之间的洗脱流动相中含有杨梅醇成分。整个分离过程在进样后95分钟结束，节约试剂和时间。将50-60分钟所得的洗脱液在45℃真空干燥后，用15ml乙酸乙酯完全溶解后，重结晶即得纯度为95％的杨梅醇(根据HPLC谱图的保留时间与峰面积计算)。

正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:0.5:0.5:1的分离条件：上样量300mg(75％乙醇洗脱杨梅树皮乙酸乙酯部位烘干浸膏)，用8ml正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:0.5:0.5:1的两相体系中的上相3ml、下相5ml溶解样品后上机分离；分离条件为：循环水浴温度为28℃，流速为2.0mL/min，转速为800rpm/min；该体系的固定相保留率为78.7％，待样品流出时，每9ml洗脱液装一管。第77分钟开始反向洗脱，89-95分钟之间的洗脱流动相中含有杨梅醇成分。整个分离过程在进样后120分钟结束，节约试剂和时间。将90-95分钟所得的洗脱液在45℃真空干燥后，用50ml乙酸乙酯完全溶解后，重结晶即得纯度为95.4％的杨梅醇(根据HPLC谱图的保留时间与峰面积计算)。

实施例3

1.杨梅树皮7月份采自湖南怀化市靖州，风干后粉碎备用，粉碎粒径范围4.0mm。

2.采用85％乙醇渗漉浸提，料液比1:2，室温下浸提15小时后放液并浓缩，依照此法浸提1-3次合并提取液，旋转蒸发仪浓缩至含水率10％，浓缩浸膏在55℃烘箱中烘干成块，含水率1％以下。

3.将步骤2所得烘干的杨梅树皮乙醇浸膏用去离子水搅拌溶解，质量体积(g/ml)比为1:40，溶解后按体积比1:3加入石油醚萃取，静止去乳化层，收集上清，用石油醚萃取至上清液无色后，将下层杨梅树皮提取物用乙酸乙酯按照体积比1：3萃取，4000rpm/min离心5分钟去除乳化层，收集上清，待乙酸乙酯萃取至上清液无色后，减压浓缩成含水率4％的膏状物后，在55℃烘干得到含水率1％以下的乙酸乙酯部位浸膏。

4.称取烘干的乙酸乙酯部位浸膏120g用1400ml 12％乙醇水溶液溶解后，湿法上样至HPD-100大孔树脂柱进行杨梅醇的富集。用去离子水清洗4个柱体积后(每个柱体积3000ml左右)，依次用纯水，30％乙醇，50％乙醇，70％乙醇，90％乙醇和100％乙醇洗脱，每个梯度洗脱2-4个柱体积，减压浓缩得到各洗脱部位得到膏状物后，55℃烘干得到各组分浸膏。即可得到杨梅树皮乙酸乙酯浸膏的30％乙醇，50％乙醇，70％乙醇，90％乙醇和100％乙醇洗脱部位。

5.采用高速逆流色谱进一步分离纯化杨梅醇

二氯甲烷：甲醇：水＝5:3.5:2分离条件：上样量300mg(85％乙醇洗脱杨梅树皮乙酸乙酯部位烘干浸膏)，用8ml二氯甲烷：甲醇：水＝5:3.5:2的两相体系中的上相5ml、下相3ml溶解样品后上机分离；分离条件为：循环水浴温度为25℃，流速为3.0mL/min，转速为900rpm/min；该体系的固定相保留率为67.2％，待样品流出时，每9ml洗脱液装一管，34-40分钟之间的洗脱流动相中含有杨梅醇成分。整个分离过程在进样后65分钟结束，节约试剂和时间。将36-39分钟所得的洗脱液在55℃真空干燥后，用15ml乙酸乙酯完全溶解后，重结晶即得纯度为96％的杨梅醇(根据HPLC谱图的保留时间与峰面积计算)。

正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:1.5:1.5:1的分离条件：上样量500mg(85％乙醇洗脱杨梅树皮乙酸乙酯部位烘干浸膏)，用8ml正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:1.5:1.5:1的两相体系中的上相5ml、下相3ml溶解样品后上机分离；分离条件为：循环水浴温度为25℃，流速为5.0mL/min，转速为900rpm/min；该体系的固定相保留率为70.5％，待样品流出时，每9ml洗脱液装一管。第57分钟开始反向洗脱，145-152分钟之间的洗脱流动相中含有杨梅醇成分。整个分离过程在进样后180分钟结束，节约试剂和时间。将146-150分钟所得的洗脱液在55℃真空干燥后，用50ml乙酸乙酯完全溶解后，重结晶即得纯度为96％的杨梅醇(根据HPLC谱图的保留时间与峰面积计算)。

Claims

1.一种使用高速逆流色谱分离杨梅醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）杨梅树皮粉碎备用；

2）将步骤1）粉碎的杨梅树皮加入乙醇溶液或丙酮、甲醇浸提，浸提液浓缩得浸膏；

3）将步骤2）得到的杨梅树皮提取浸膏用水溶解，加入石油醚或正己烷萃取至上清液无色，然后将石油醚或正己烷萃取后分离的下层杨梅树皮提取物用乙酸乙酯萃取至上清液无色，得到乙酸乙酯部位浸膏，然后将乙酸乙酯部位浸膏烘干；

4）步骤3）所得的烘干的乙酸乙酯萃取部位浸膏溶解后过大孔树脂进行杨梅醇的富集，树脂型号D101、AB-8或HPD-100，，依次用去离子水、递增梯度10-30%的各浓度的乙醇溶液洗脱；70-90%乙醇溶液洗脱部位浓缩得到含水率1-5%的浸膏；

5）使用以下任一种不同的两相溶剂体系分离得到杨梅树皮中杨梅醇：

高速逆流色谱分离的溶剂体系为二氯甲烷：甲醇：水=5:3.5-4.5:2，称取步骤4）中70%-90%乙醇洗脱烘干的乙酸乙酯部位浸膏300-500mg，将5-10 ml配制好的溶剂体系中的上相取30%-70%，下相取30%-70%，溶解后上机分离；分离条件为：循环水浴温度为 25-30℃，流速为1-5.0mL/min，转速为800～900rpm/min；

或者，

高速逆流色谱分离的溶剂体系为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水=1:0.5-1.5:0.5-1.5:1，称取步骤4）中70%-90%乙醇洗脱烘干的乙酸乙酯部位浸膏300-500mg，将5-10 ml配制好的溶剂体系中的上相取30%-70%，下相取30%-70%，溶解后上机分离；分离条件为：循环水浴温度为25-30℃，流速为1-5.0mL/min，转速为800～900rpm/min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤1）中杨梅树皮风干后粉碎备用，粉碎粒径范围0.5-5.0mm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤2）中采用丙酮、甲醇或者75-95%乙醇溶液浸提。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，

步骤2）的具体过程如下：

将粉碎后的杨梅树皮粉末加入渗漉罐，加入浸提溶剂，料液比1：2-1：5，浸提12-24小时，后浓缩成含水率5-10%的浓缩浸膏。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤3）的具体过程如下：

将步骤2）获得的浓缩浸膏或者烘干后的浓缩浸膏用去离子水搅拌溶解，质量体积比为1:10-1:50 g/ml，溶解后按体积比1:1-1:3，加入石油醚萃取，静止去乳化层，收集上清，用石油醚萃取至上清液无色后，将下层杨梅树皮提取物用乙酸乙酯按照体积比1：1-1：3，萃取，离心去除乳化层，收集上清，待乙酸乙酯萃取至上清液无色后，浓缩成含水率1-5%的乙酸乙酯萃取部位浸膏，继续在45-55℃烘干到含水率1%以下。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

用乙酸乙酯萃取时，2000 rpm-5000 rpm/min，离心3-5分钟来去除乳化层。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤4）依次用去离子水、30%、50%、70%、90%和100%乙醇洗脱。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤3）所得的烘干的乙酸乙酯萃取部位浸膏80-120g；用800-1500ml 7%-15%乙醇水溶液溶解后用2000-3000g大孔树脂进行杨梅醇的富集。