CN109985027A

CN109985027A - 杨梅醇在制备抗革兰阴性细菌毒力药物中的应用

Info

Publication number: CN109985027A
Application number: CN201910293960.4A
Authority: CN
Inventors: 鲁春华; 沈月毛; 吴杨
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2019-07-09
Anticipated expiration: 2039-04-12
Also published as: CN109985027B

Abstract

本发明涉及杨梅醇在制备抗细菌毒力药物中的应用，所述化合物1结构式如下所示。杨梅醇为二芳基庚烷类化合物，具有显著抑制沙门菌III型分泌系统(T3SS)毒力蛋白分泌的作用。该类抑制剂不抑制沙门菌的生长，但能抑制沙门菌对宿主细胞的侵袭，因此该化合物可作为制备抗革兰阴性细菌毒力的药物。

Description

杨梅醇在制备抗革兰阴性细菌毒力药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种新型革兰阴性细菌毒力因子抑制剂的应用，具体涉及化合物杨梅醇(myricanol)在制备抗革兰阴性细菌毒力药物中的应用，属于天然药物化学与医药应用技术领域。

背景技术

抗生素在治疗感染性疾病的同时，产生了越来越多的药源性疾病和耐药性，对公共健康造成了巨大的威胁。因此，迫切需要寻找新的途径化解这些危机与挑战。另外，广谱抗生素在抑制病原微生物的同时，也抑制了人体内生理性微生物，扰乱了微生物生态系统中菌群或群落间正常的格局，破坏了人体的生理机能和健康。因此，如何保证药物对耐药细菌的抑制作用，同时又降低药物对人体内正常菌群的破坏，现已成为抗菌药物研究亟待解决的重要课题。

抗毒力(antivirulence)药物是应对这些挑战的理想选择，其作用靶标是病原菌的毒力蛋白(virulence factors)。与常规抗菌药物不同，抗毒力药物的作用机制是解除病原菌的“武装”，使其丧失毒力、致病能力和生存竞争优势，而不是杀死或抑制病原菌的生长。病原菌，尤其是革兰阴性致病菌依赖毒力蛋白感染宿主，从而产生致病作用。因此，开发新的抗耐药菌和新型抗毒力疗法，是替代传统抗生素治疗的新选择，是当前抗致病菌感染药物研究的前沿。

革兰阴性致病菌在致病过程中，存在多种致病因子，包括毒素(toxins)、粘附素(adhesins)、侵入素(invasins)、铁载体(siderophores)、免疫逃逸和调节因子(immuneevasion and modulation factors)、群体感应(quorum sensing)和蛋白质分泌系统(protein secretion systems)。在过去的十年里，多种抗毒力策略已经成为研究热点。其中，III型分泌系统(T3SS)产生的毒力蛋白是许多革兰阴性致病菌最重要的毒力，在病原菌对宿主细胞的粘附、侵袭等致病过程中起着非常重要的作用。T3SS在革兰阴性致病菌中存在广泛性和结构的保守型，同时在宿主正常菌群中不存在，因此成为一个新颖的抗菌靶点。

民族药用植物具有疗效确切、毒性和不良反应小等优点，越来越引起重视，成为现代药物发现的资源库。然而，民族药用植物抗感染的有效性、物质基础和药理机制仍然有待深入研究。傣药是我国四大民族药之一，据统计，傣药用于胃肠道感染性疾病的药用植物种类几乎占傣药种类的一半，这可能与傣族居民聚集地的气候饮食习惯有关，故腹泻、痢疾、胃肠不适等胃肠道感染疾病是在西双版纳等地发病率较高的原因。

传统的抗菌、抗感染活性筛选和药理模型是基于抑菌或杀菌作用，傣药提取物虽然抗感染，但对病原细菌不一定有抑制作用，提示傣药中的抗感染活性成分可能是通过靶向病原细菌毒力蛋白识别宿主，或抑制病原细菌毒力蛋白的表达和功能，使细菌定植宿主的能力大大减弱，失去致病能力。因此，从传统治疗胃肠感染疾病的傣药中，挖掘抗毒力活性成分有广阔的前景。“药食同源”是傣药的特色，傣族地区许多野生蔬菜和水果具有抗胃肠感染的作用，但是没有显著的抑菌或杀菌作用。本发明即在此背景下创制，即从云南傣药中寻找抗细菌毒力的新型药物。

毛杨梅(Myrica esculenta Buchanan-Hamilton ex D.Don)，杨梅科植物毛杨梅的根皮和树皮，傣医傣药中用作接短鲁短，拢蒙沙嘿和习哦勒(即红白痢疾，腹痛腹泻)，但其药效物质基础没有相关报道。毛杨梅树皮中含有黄酮类、丹宁类、三萜类和二芳基庚烷类等多种化学成分，该植物在云南的西双版纳州资源充足，傣医也是随采随用或晒干储存。

杨梅醇(myricanol)在杨梅(Myrica rubra)(Nat Prod Commun,2009,4,513-516；J.Nat.Prod,2012,75,1798-1802)、毛杨梅(Myrica esculenta)(云南大学学报(自然科学版)2011，33(4),453-457)、矮杨梅(Myrica nana Cheval)(青岛科技大学硕士毕业论文，2009，王俊峰))、蜡杨梅(Myrica cerifera)(J.Nat.Prod,1996,59,759-764；2011,4,8-44)和核桃楸(Juglans mandshurica)(中草药,2016,47(17):2979-2983)未成熟的外果皮等植物中都被分离得到，文献报道该化合物可以靶向微管相关蛋白Tau，对老年痴呆有治疗作用(J.Nat.Prod.2011,74,38–44)；可以体内诱导非小细胞肺癌细胞的程序化死亡从而抑制肿瘤的生长(Int.J.Mol.Sci.2015,16,2717-2731)；还可以靶向激活脂肪细胞的AMPK，可能可以作为治疗肥胖的新策略(Food Chemistry,2019,270)。但对抗病原菌毒力的活性本发明首次报道。

发明内容

本发明首次利用活性跟踪的方法从毛杨梅(Myrica esculenta)中分离到活性成分杨梅醇(myricanol)，该化合物对沙门菌T3SS的毒力蛋白SipA、B、C和D的分泌具有较好的抑制作用，且对沙门菌的生长没有抑制作用，能够抑制沙门菌对HeLa细胞的侵袭。因此，本发明旨在提供杨梅醇(myricanol)在制备抗革兰阴性细菌毒力药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供杨梅醇(myricanol，化合物1)在制备抗革兰阴性细菌毒力药物中的应用，所述化合物结构式如下：

根据本发明优选的，本发明所述的应用，其中杨梅醇(myricanol)是从毛杨梅的干燥树皮中分离出来的；分离方法如下：

(1)称取毛杨梅干燥树皮1.0kg，粉碎后用乙酸乙酯浸泡提取3次，每次提取两天，合并提取液后，40℃减压浓缩至干，得粗提物；

(2)将粗提物溶于水，总提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、甲醇进行萃取，回收溶剂后得到石油醚组分，乙酸乙酯组分和甲醇组分；

(3)将甲醇组分首先经Sephadex LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱得到9个组分Fr.1-Fr.9，活性跟踪Fr.3有较好的活性，继续经反相硅胶柱色谱分离，以甲醇-水系统按照体积比30％，50％，70％和100％MeOH各2L分别洗脱，每200mL分管接收，合并相同流分得到Fr.31—Fr.38，其中Fr.35经过正相硅胶柱色谱分离，石油醚-丙酮系统按体积比50:1，25:1,20:1各分别洗脱200mL，得化合物1杨梅醇。

根据本发明优选的，所述的抗细菌毒力药物包括杨梅醇(myricanol)以及药学上可接受的辅料。

根据本发明优选的，本发明的化合物可作为革兰阴性致病菌的III型分泌系统抑制剂用于制备抗革兰阴性细菌毒力的药物。

有益效果

本发明以采集自西双版纳州勐海县章朗村的毛杨梅(Myrica esculenta)树皮为材料，利用活性跟踪的方法，从提取物中分离到具有抗沙门菌III型分泌系统毒力蛋白分泌的活性成分杨梅醇(myricanol)，该化合物对III型分泌系统毒力蛋白SipA、B、C和D的分泌具有浓度梯度依赖性，为活性较好的T3SS抑制剂。我们首次发现杨梅醇(myricanol)抑制沙门菌III型分泌毒力蛋白的分泌，且能显著降低沙门菌对宿主细胞的侵袭，这对发现广谱高效且具有自主知识产权的新型抗细菌毒力药物具有重要意义。鉴于III型分泌系统在革兰阴性致病菌中广泛存在且具有高度保守性，因此该化合物可作为制备抗革兰阴性细菌毒力的药物。

附图说明

图1：杨梅醇(myricanol)抑制沙门菌III型分泌系统毒力蛋白SipA、B、C和D的分泌且具有浓度梯度依赖性；

图2:杨梅醇(myricanol)抑制沙门菌培养上清中SipC的含量，可能抑制SipC的转运；

图3：杨梅醇(myricanol)对沙门菌生长曲线的影响；

图4：杨梅醇(myricanol)对沙门菌侵袭HeLa细胞的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。所述百分比数没有特别说明的均为质量百分比，所使用原料没有特别说明的均为市售。

实施例1.杨梅醇(myricanol)的分离

杨梅醇(myricanol)是从毛杨梅的干燥树皮中分离出来的，所述分离方法如下：

(2)将粗提物溶于水，总提取物依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇进行萃取，回收溶剂后得到石油醚组分，乙酸乙酯组分和甲醇组分；

(3)抗沙门菌T3SS活性测试结果表明，甲醇组分具有较好的抑制沙门菌毒力蛋白分泌的活性，所以对甲醇组分进行分离。首先经Sephadex LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱得到9个流分(Fr.1-Fr.9)，活性跟踪Fr.3有较好的活性，继续经反相硅胶柱色谱分离，以甲醇-水系统按照体积比30％，50％，70％和100％MeOH各2L分别洗脱，合并相同流分得到Fr.31—Fr.38，Fr.35经过正相硅胶柱色谱，石油醚-丙酮系统按体积比50:1，25:1,20:1各200mL分别洗脱，分离得到化合物1(1.3g)。

实施例2.杨梅醇(myricanol)的结构鉴定

化合物1：ESI-MS测得实施例1的化合物1的准分子离子峰为m/z 359.2[M+H]⁺；白色无定形粉末；¹H，¹³C NMR和HMQC谱图显示化合物有21个碳原子，包括12个sp²杂化的烯碳，6个sp³杂化的次甲基碳，1个sp³杂化亚甲基碳原子和2个甲基碳。¹H NMR数据表明结构中含有一个三取代苯环和一个5取代苯环，根据¹H-¹H COSY和HMQC确定了C-H的直接相关关系；进一步通过HMBC关键质子与相关碳的远程相关关系，确定了化合物1的结构为环状二芳基庚烷类化合物杨梅醇(myricanol)。其核磁数据如下，¹³CNMR(400MHz，in acetone-d₆)：δ125.0(C-1)，123.6(C-2)，147.6(C-3)，140.4(C-4)，149.8(C-5)，123.9(C-6)，26.3(C-7)，26.5(C-8)，23.8(C-9)，40.4(C-10)，35.5(C-12)，27.6(C-13)131.6(C-14)，130.4(C-15)，117.2(C-16)，152.5(C-17)，134.2(C-18)，130.0(C-19)；¹H-NMR(400MHz，in acetone-d₆)：δ7.05(1H，dd，J＝8.0，2.0Hz，H-15)，6.81(1H,d，J＝8.0Hz，H-16)，7.21(1H，d，J＝2.0Hz),6.90(1H，s),其波谱数据与文献[J.Nat.Prod,1996，59：759-764]基本一致,因此，其结构鉴定为杨梅醇(myricanol)。

实施例3.杨梅醇(myricanol)体外对沙门菌III型分泌系统毒力蛋白分泌SipA、B、C和D的抑制作用

测试原理：

III型分泌系统是革兰阴性菌致病过程中非常重要的一种毒力因子，其借助于III型分泌系统分泌毒力蛋白促进对宿主细胞的黏附和侵袭以及在宿主细胞内的繁殖与扩散。因此阻断毒力蛋白的分泌可以抑制革兰阴性致病菌对宿主细胞的入侵。本实验以鼠伤寒沙门菌UK-1(χ8956)为研究对象，通过温度诱导法，促使鼠伤寒沙门菌通过III型分泌系统分泌毒力蛋白至培养液中，利用SDS-PAGE和Western Blot进行检测，评价杨梅醇(myricanol)对毒力蛋白分泌的抑制作用。

测试材料：

鼠伤寒沙门氏菌UK-1(χ8956),现保存于申请者实验；丙烯酰胺-双丙烯酰胺(40％)，APS，TEMED，考马斯亮蓝R250，硝酸纤维素PVDF膜均为市售品；SipC鼠单克隆抗体：tgcBioMICS公司产品；所有样品均溶于DMSO配成适当浓度；阳性对照CsnB为申请人现有技术合成。

测试方法：

新鲜的沙门菌菌液，按1:100转接至LB(0.2％L-ara)中，25℃/220rpm振荡培养过夜。过夜培养物，按1:10转接至1mL新鲜LB(0.2％L-ara)培养基中，加入1μl适当浓度的药物，37℃/220rpm振荡培养4h。取各培养物，稀释10倍，测定OD₆₀₀值。其余培养物12 000g，4℃离心5min。轻轻吸取上清800μl，然后加入88μl 100％TCA至终浓度10％，轻轻振荡几次，冰上放置30min。12 000g，4℃离心5min，倒掉上清，每管加入400μl-20℃保存的丙酮，轻轻振荡几次，冰上10min，12 000g，4℃离心5min。丙酮挥干后，根据OD₆₀₀值，加入1倍量上样缓冲液溶解蛋白，95℃加热5min，促进蛋白变性。取适量制备好的蛋白样品，进行10％SDS-PAGE，然后用0.1％(w/v)考马斯亮蓝R250染色、脱色，利用凝胶成像系统成像观察(图1)。

测试结果：

由图1可以看出，与阳性对照CsnB(100μM)相比较，杨梅醇(myricanol)对沙门菌Ⅲ型分泌系统毒力蛋白SipA、B、C和SipD均具有不同程度的抑制作用，且具有浓度梯度依赖性，在100μM浓度下，其抑制作用与阳性对照相当。进一步通过Western blot(图2)进行检测，发现加入杨梅醇(myricanol)后，培养上清中的Sip C明显降低，表明可能抑制SipC的转运过程。

实施例4：杨梅醇(myricanol)对鼠伤寒沙门菌生长的影响

测试方法:

取鼠伤寒沙门菌25℃过夜培养物，按1:10转接至1mL LB(0.2％L-ara)中，同时加入杨梅醇(myricanol)，置于37℃震荡培养。每个样品设三个重复。每隔1h，测定

OD₆₀₀，然后绘制沙门菌生长曲线(图3)。

测试结果：

结果表明，杨梅醇(myricanol)在100μM浓度下对沙门菌的生长几乎没有影响。

实施例5：杨梅醇(myricanol)对沙门菌侵袭HeLa细胞的影响

(1)将HeLa细胞消化后接种于小盘培养皿中，每盘2×10⁵个细胞，置于细胞培养箱中过夜(37℃，5％CO₂)。

(2)同时将沙门菌接种于LB培养基(0.2％L-ara)中，于摇床25℃/220rpm振荡过夜。次日测定菌浓OD₆₀₀值。

(3)次日将HeLa细胞换1mL DMEM培养基(无FBS)，培养适应30min后，MOI为1000，加入相应的菌液，同时加入药物(终浓度100μM)与等体积的DMSO，37℃培养15/30/45/60min。

(4)待培养时间到达后，将菌液吸入EP(1.5mL)管中，再各加入PBS(500μL)清洗胞外的细菌，加入EP管中，然后离心，12000g，5min收集上清。

(5)将细胞置于冰上，加入细胞裂解液(210μL，临用前加入PMSF，终浓度1mM)冰上放置5min，刮下细胞收集于EP管中，并超声破碎(超1s停1s)，破碎完的细胞液加入4×loading buffer(70μL)溶解。

(6)对上述得到的细胞培养液与细胞裂解液分别于95℃煮沸5min，然后WesternBlotting检测，以GAPDH为内参。

结果表明：随着侵袭时间的增长，HeLa细胞内毒力因子SipC水平，相比于对照组DMSO，在不同培养时间，相同的侵染指数下表现出明显的抑制作用，在培养基中毒力蛋白SipC水平相比于对照组DMSO，没有明显变化，因此可以判断杨梅醇(myricanol)可以抑制SipC的分泌，从而导致沙门菌侵袭能力降低。(图4)

综上所述，杨梅醇(myricanol)对沙门菌T3SS毒力蛋白的分泌具有较好的抑制作用，且具有浓度梯度依赖性；对沙门菌自身的生长没有抑制作用，且能够抑制沙门菌对HeLa细胞的侵袭，可以作为一种新型的抗毒力药物。

Claims

1.杨梅醇在制备抗细菌毒力药物中的应用，所述化合物结构式如下：

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述杨梅醇是从毛杨梅的干燥树皮中分离出来的；分离方法如下：

(1)称取毛杨梅干燥树皮1.0kg，粉碎后用乙酸乙酯浸泡提取三次，每次提取两天，合并提取液后，40℃减压浓缩至干，得粗提物；

(3)将甲醇组分首先经Sephadex LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱得到9个组分Fr.1-Fr.9，活性跟踪Fr.3有较好的活性，继续经反相硅胶柱色谱分离，以甲醇-水按体积比30％，50％，70％和100％MeOH各2L分别洗脱，合并相同流分得到Fr.31—Fr.38，其中Fr.35经过正相硅胶柱色谱，石油醚-丙酮系统按体积比50:1，25:1,20:1各分别洗脱200mL洗脱，分离得到化合物1杨梅醇。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的抗细菌毒力药物包括杨梅醇以及药学上可接受的辅料。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于杨梅醇可作为革兰阴性致病菌的III型分泌系统抑制剂用于制备抗革兰阴性细菌毒力的药物。