CN108434127A - 一种杨梅醇和/或杨梅酮在制备具有预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种杨梅醇和/或杨梅酮在制备具有预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用，即通过杨梅醇和/或杨梅酮治疗炎症性肠病。杨梅醇和/或杨梅酮在体外具有对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分泌的IL‑6和TNF‑α、IL‑1β炎症因子的抑制作用，即具有对于炎症因子的表达产生抑制，更具体地为对于炎症性肠病的抑制作用，并且在发挥药效的过程中，无明显的毒副作用，有效减少了溃疡面积。相比于现有的氨基水杨酸类药物，杨梅醇和/或杨梅酮具有更优的疗效，适合大规模生产，具有广阔的应用前景与较高的应用价值。

Description

一种杨梅醇和/或杨梅酮在制备具有预防和/或治疗炎症性肠 病的药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种杨梅醇和/或杨梅酮在制备具有预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用。
背景技术
炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一组病因尚不十分清楚的慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)。发病机制不明，但已发现的相关致病因素包括：遗传、感染、环境污染、饮食、肠道微生态等。IBD是北美和欧洲的常见病，溃疡性结肠炎在欧洲和美国的患病率240/10万，发病率为10/10万～20/10万，克罗恩病患病率200/10万，发病率为5/10万～10/10万。近30年来日本IBD发病率亦呈逐步增高的趋势。我国虽尚无普通人群的流行病学资料，但近十余年来本病就诊人数呈逐步增加趋势非常明显。综合多家医院病例的统计推测，溃疡性结肠炎的患病率为11.6/10万，发病率大约在3/10万；克罗恩病的患病率为1.4/10万，发病率大约在0.4/10万，实际病例可能更多。
以氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂等为基础的传统IBD治疗方案目前仍是主流，由于病因复杂，疗效欠佳，许多接受治疗的患者没有得到缓解，高达80％的克罗恩病患者和30％的UC患者最终需要接受手术，这一领域还有巨大的医疗需求未被满足。近些年，粪菌移植的临床试验和应用方兴未艾，但患者接受度低，需进一步探索。
杨梅醇和/或杨梅酮存在于杨梅树中，以杨梅树皮较多。杨梅(通称)，系杨梅科、杨梅属植物，常绿乔木，主要产于江苏、浙江、台湾、福建、江西、湖南、贵州、四川、云南、广西和广东，日本、朝鲜和菲律宾也有分布，生长在海拔125～1500米的山坡或山谷林中，喜酸性土壤。
因此，目前仍需要探索开发一种新型的治疗炎症性肠病的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杨梅醇和/或杨梅酮在制备具有预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种杨梅醇和/或杨梅酮在制备具有预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用。
其中，杨梅醇的分子式为C21H26O5，结构式如下：
杨梅酮的分子式为C21H24O5，结构式如下：
本发明开发出一种新的治疗IBD的方法，即通过杨梅醇和/或杨梅酮治疗炎症性肠病。目前关于IBD的治疗药物主要为氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂这四种药物，但是疗效欠佳，并且价格昂贵。而本发明使用的杨梅醇和/或杨梅酮，在体外具有对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分泌的IL-6和TNF-α、IL-1β炎症因子的抑制作用，即具有对于炎症因子的表达产生抑制，更具体地为对于炎症性肠病的抑制作用，并且在发挥药效的过程中，无明显的毒副作用，有效减少了溃疡面积。
优选地，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和/或克罗恩病。
在本发明中，优选将杨梅醇和/或杨梅酮用于制备治疗炎症性肠病的药物中，相比于氨基水杨酸类药物对于IBD的治疗效果，杨梅醇具有显著缩小模型结直肠损伤面积的作用，效果优于氨基水杨酸类药物。
此外，由于杨梅树种植广泛，因此杨梅醇和/或杨梅酮来源充足，价格较低，利于大规模生产，降低了生产成本。
优选地，所述药物还包括由杨梅醇与辅料组成的药物组合物或由杨梅酮与辅料组成的药物组合物。
优选地，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的任意一种。
进一步优选地，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、栓剂或灌肠剂中的任意一种。
在本发明中，杨梅醇和/或杨梅酮制备的药物或药物组合物可以被制成缓释制剂或控释制剂等。
当药物制备成缓释制剂或控释制剂时，可将释放速率调节剂与药物或药物组合物搭配使用，例如释放速率调节剂可包括羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素、聚氧乙烯、异丁烯酸共聚物及其混合物或黄原胶等，释放速率调节剂可以存在于剂型内部(基料内)和/或剂型外部(包衣)。
在本发明中，杨梅醇和/或杨梅酮可单独给药，但是一般将其与适合的辅料进行混合给药。
在本发明中，例如当杨梅醇和/或杨梅酮制备的药物组合物为片剂时，可包含有赋形剂，例如微晶纤维素、淀粉或碳酸钙等；也可以包含崩解剂，例如可以是交联羧甲基纤维素钠等；也可以包含润滑剂，如硬脂酸镁或滑石等。此外，本领域技术人员可根据杨梅醇和/或杨梅酮制备的药物或药物组合物为不同的剂型时，进行辅料的适当调整，以达到最佳的药效。
在本发明中，杨梅醇和/或杨梅酮制备的药物或药物组合物可以被肠胃外给药，例如腔内、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内或皮下等；当进行肠胃外给药时，一般为无菌水溶液的形式，同时可以包含其他物质，例如盐或葡萄糖等，可调节血液渗透压；此外，如果本领域技术人员可根据需要，在水溶液中适当地添加缓冲试剂调节pH值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明开发出一种新的治疗IBD的方法，即通过杨梅醇和/或杨梅酮治疗炎症性肠病。杨梅醇和/或杨梅酮在体外具有对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分泌的IL-6和TNF-α、IL-1β炎症因子的抑制作用，即具有对于炎症因子的表达产生抑制，更具体地为对于炎症性肠病的抑制作用，并且在发挥药效的过程中，无明显的毒副作用，有效减少了溃疡面积。相比于现有的氨基水杨酸类药物，杨梅醇和/或杨梅酮具有更优的疗效，具有广阔的应用前景与较高的应用价值。
附图说明
图1A是本发明实施例1中杨梅醇在0-20μM范围内对小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖活性影响图(其中，NS代表无显著性差异)。
图1B是本发明实施例1中杨梅酮在0-20μM范围内对小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖活性影响图。
图2A是本发明实施例1中杨梅酮在各浓度下对小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-6转录水平的影响图(n＝3)。
图2B是本发明实施例1中杨梅醇在各浓度下对小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-6蛋白水平的影响图(n＝3)。
图2C是本发明实施例1中杨梅醇在各浓度下对小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-6转录水平的影响图(n＝3)。
图3A是本发明实施例1中杨梅酮对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌的TNF-α转录水平的影响图(n＝3)。
图3B是本发明实施例1中杨梅醇对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌的TNF-α转录水平的影响图(n＝3)。
图3C是本发明实施例1中杨梅醇对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌的TNF-α蛋白水平的影响图(n＝3)。
图4A是本发明实施例1中杨梅酮对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌的IL-1β转录水平的影响图(n＝3)。
图4B是本发明实施例1中杨梅醇对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌的IL-1β转录水平影响图(n＝3)。
图4C是本发明实施例1中杨梅醇对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌的IL-1β蛋白水平的影响图(n＝3)。
图5是本发明实施例3中杨梅醇对4％DSS诱导的小鼠急性IBD模型的体重变化率的影响图(n＝10)。
图6是本发明实施例3中杨梅醇对4％DSS诱导的小鼠急性IBD模型的肠湿重的影响图(n＝10)。
图7是本发明实施例3中杨梅醇对4％DSS诱导的小鼠急性IBD模型的DAI评分的影响图(n＝10)。
图8是本发明实施例3中杨梅醇对4％DSS诱导的小鼠急性IBD模型的肠道HE染色部分代表图(n＝5)。
图9是本发明实施例3中杨梅醇对4％DSS诱导的小鼠急性IBD模型的肠道髓过氧化物酶的影响图(n＝8)。
图10是本发明实施例4中杨梅醇治疗大鼠结直肠湿重变化示意图(n＝5)。
图11是本发明实施例4中杨梅醇治疗大鼠结直肠损伤面积示意图(n＝5)。
图12是本发明实施例4中杨梅醇治疗大鼠结直肠解剖损伤示意图。
图13是本发明实施例4中杨梅醇治疗大鼠结肠HE病理示意图。
在细胞实验中，n为实验次数，每次有3个复孔(重复数)；在动物实验中，n为每组动物的只数(样本量)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，对作为抗炎症性肠病药物的杨梅醇和杨梅酮进行体外抗炎活性测试
杨梅醇和杨梅酮对细菌脂多糖(以下简称LPS)刺激诱导的小鼠巨噬细胞株RAW264.7所分泌的IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症因子的表达影响：取预先制备好的细胞悬液，以20000个细胞/孔、100μL/孔接种96孔板，置37℃、5％CO2培养箱中培养过夜，弃去原有培养液，每孔加配制好的不同浓度受试药液的培养基100μL，培养1h后加入LPS，培养体系中LPS终浓度为100μg/mL。各浓度设平行3孔，同时设细胞对照组(无药、无溶媒)、以及空白培养基对照组(无细胞，调零孔)，继续培养24h。吸取细胞培养上清，首先采用MTT(SIGMA；MKB0025V)检测受试药物对细胞活性的影响，其次采用Q-PCR(LPS刺激6h)(TAKARA)、R&DELISA(LPS刺激24h)检测试剂盒(M6000B；MTA00B；VAL601)，检测各组的IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症因子的表达。
由图1A(图中-LPS含义为“不含有LPS”；+LPS含义为“含有LPS”)和图1B的结果可以看出，杨梅醇和杨梅酮在0-20μM的浓度范围内对小鼠巨噬细胞RAW 264.7的增殖活性没有明显影响(n＝3)，后续实验均使用该药物最高无毒性浓度下浓度来检测其活性。
图2A、图2B和2C显示出了杨梅醇和杨梅酮各浓度下对小鼠巨噬细胞RAW264.7的抗炎活性影响(n＝3)。结果显示：杨梅酮(图2A)和杨梅醇(图2C)均表现出显著抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分泌的IL-6的mRNA的表达，同时杨梅醇显著抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分泌的IL-6的(图2B)蛋白表达。由图3A、图3B和图3C的结果可以看出，杨梅酮(图3A)和杨梅醇(图3B)均表现出显著抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分泌的TNF-α的mRNA的表达，同时杨梅醇显著抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分泌的TNF-α的(图3C)蛋白表达。由图4A、图4B和图4C的结果可以看出，杨梅酮(图4A)和杨梅醇(图4B)均表现出显著抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分泌的IL-1β的mRNA的表达，同时杨梅醇显著抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分泌的IL-1β的(图4C)蛋白表达。
综上所述：杨梅酮和杨梅醇在体外具有很好的抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分泌IL-6和TNF-α、IL-1β的作用，具有显著的抗炎效果。
实施例2
在本实施例中，对作为抗炎症性肠病药物的杨梅醇、杨梅酮，进行急性毒性测试，以对杨梅醇和杨梅酮的安全性进行测试
采用SD大鼠30只，雌雄各半，分组时体重均数为雌性160～200g、雄性180～220g，个体体重应在平均体重±20％范围内。试验前动物需先适应环境至少5天，选择健康(雌性须未孕)大鼠作为受试动物。适应期的主要检查内容：是否与订购时要求的质量指标一致；一般状态检查；体重是否达到试验要求的体重范围。不合格的异常动物不纳入本试验。大鼠灌胃单次给药，给予低、中、高剂量，分别为100mg/kg、300mg/kg、600mg/kg、1000mg/kg。
观察方法：(1)一般状态观察：观察动物包括大鼠外观体征、给药部位(有无出血、红肿、瘀紫、硬结、化脓、溃烂)、被毛、一般行为活动、精神状态、腺体分泌、皮肤和粘膜颜色、呼吸状态、粪便性状、生殖器、死亡等情况及其它毒性症状；每次给药后约0～2小时、4～6小时各观察1次；若有毒性症状可增加观察次数，给药结束后观察14天。(2)大体解剖观察：于试验第15天将各组所有存活大鼠解剖观察，对大体及给药部位解剖观察，发现可能与供试品相关的异常脏器组织进行拍照记录。(3)濒死动物的处置：记录大鼠状态及观察时间，同时测定体重。(4)死亡动物的处置：记录大鼠死亡时间或发现死亡时间，测定体重后迅速解剖进行大体观察，并推测其死因。下表1记载了化合物杨梅醇、杨梅酮的急性毒性剂量及结果
表1
实验结果：SD大鼠单次灌胃给予上述化合物后未出现明显毒副作用，未见明显体重下降和饮食量下降趋势。说明杨梅醇和杨梅酮的单次急性毒性耐受量MTD＞600mg/kg，其中杨梅醇的MTD＞1000mg/kg。
实施例3
在本实施例中，对作为抗炎症性肠病药物的杨梅醇在体内对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠体内IBD模型的药效学进行测试
SPF级别C57BL/6小鼠，雌性，6～8周龄，适应性饲养3～7天后，以4％葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液饲喂小鼠，采取自由饮水的方式饲喂(day0)，每2天更换一次新鲜的DSS水溶液，自由饮DSS水溶液7天(day7)后，更换新鲜的纯化水饲喂。在造模4天后，于造模第5天开始进行给药，以尾静脉给药，分别给予动物10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg药物进行治疗。连续给药4天，然后观察1天，最后一次给药24小时后结束实验。
检测指标：观察每天记录各组动物体重，并同时收集每只动物粪便，检测便隐血情况，如不能判断明显便血，则用隐血检测试剂盒确认隐血情况，记录在实验记录纸上，并拍照记录。待实验结束，对每只动物的粪便性状、隐血情况、体重变化率进行评分，所得分数相加得该只动物的DAI(Disease activity index，疾病活动指数)分数。收集动物结直肠组织样本，量取结肠湿重，并进行后续组织病理学检测及组织内MPO(myeloperoxidase，髓过氧化物酶)等检测。
由图5的结果可以看出，杨梅醇表现出对4％DSS诱导的小鼠急性IBD体重下降趋势具有减缓的作用。说明其具有改善炎症性肠病病人体重减轻的作用。
由图6的结果可看出小鼠给予4％DSS自由饮水后7天其肠湿重明显增加，而给予药物治疗后小鼠肠湿重明显下降。揭示杨梅醇/杨梅酮治疗能改善DSS引发的小鼠结直肠水肿(变重的趋势)。
由图7的结果可以看出，杨梅醇表现出显著降低小鼠DAI评分的作用，说明其具有改善炎症性肠病病人整体疾病状态，具有改善病症的作用。
由图8的结果可以看出杨梅醇对4％DSS诱导的小鼠急性IBD模型的肠道粘膜损伤表现出明显的修复作用，说明其具有改善炎症性肠病病人肠道损伤的作用。
MPO的指标说明:组织髓过氧化物酶水平，中性粒细胞浸润越严重，MPO指标越高，由图9的结果可以看出：杨梅醇有一定减少4％DSS造成的小鼠结肠部位中性粒细胞浸润的作用。
实施例4
在本实施例中，对作为抗炎症性肠病药物的杨梅醇在体内对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的IBD大鼠体内模型的药效学活性进行测试
SPF级别SD大鼠，雌性，180～200g，适应性饲养5～7天后，开始造模，造模时首先麻醉大鼠，将预先标记好的猫导管穿过肛门进入结肠8厘米，然后慢慢地将250μL的2.5％(wt/vol)TNBS溶液注入结肠的内腔并倒置大鼠1分钟，1分钟后从肠道缓慢取出导管，将鼠头朝下放置1分钟然后将鼠放回笼子里，空白组大鼠给予相同体积的生理盐水。造模第二天即D1以灌胃方式进行给予，连续给药6天。
检测指标：观察每天记录各组动物体重，实验开始即收集每只动物粪便，检测便隐血情况，如不能判断明显便血，则用隐血检测试剂盒确认隐血情况，记录在实验记录纸上，并拍照记录。待实验结束时，对每只动物的粪便性状、隐血情况、体重变化率进行评分，所得分数相加得最终每只动物的DAI分数。收集动物结直肠组织样本，进行后续检测。
由图10的结果可以看出2.5％TNBS处理大鼠后大鼠肠湿重较与空白组与治疗组均有增加，给药组具有明显减轻大鼠水肿的趋势。
由图11的结果可以看出口服杨梅醇具有显著缩小2.5％TNBS诱导的IBD模型结直肠损伤面积的作用，在该指标上疗效比阳性对照药5-氨基水杨酸(5-ASA)要好。
由图12的大体解剖图和图13病理结果，均可以看出杨梅醇具有明显降低2.5％TNBS诱导的IBD模型结直肠溃疡损伤的作用，说明杨梅醇具有对IBD模型溃疡损伤的保护作用。
本发明中杨梅醇和杨梅酮均能够用作治疗炎症性肠病药物，并且未见明显副作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的杨梅醇和/或杨梅酮在制备具有预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (5)

1.一种杨梅醇和/或杨梅酮在制备具有预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和/或克罗恩病。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物还包括由杨梅醇与辅料组成的药物组合物或由杨梅酮与辅料组成的药物组合物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的任意一种。
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