CN115125171B - 谷氨酸发酵菌的高温培养工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了谷氨酸发酵菌的高温培养工艺，该工艺使用耐高温发酵培养基进行发酵，采用38℃以上的温度，提高了菌体浓度，发酵效率也相应提高。

Description

谷氨酸发酵菌的高温培养工艺
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及谷氨酸发酵菌的高温培养工艺。
背景技术
L-谷氨酸，又名α-氨基戊二酸，是一种酸性氨基酸，是世界上最大的氨基酸产品，其既可以缓解肝毒，治疗肝昏迷症，又是制取味精、食品添加剂、化妆品等产品的前体物质，因此被广泛应用于食品、医药、化工和饲料行业。
目前谷氨酸年产量近200多万吨，各种产品出口50多个国家，产值近200亿，市场潜力巨大，前景广阔。目前L-谷氨酸大规模工业化生产的方法是微生物发酵法，发酵最常利用的菌株为生物素亚适量型菌株和温度敏感型菌株，其中由于温度敏感型菌株在产酸速率、产酸量和糖酸转化率上相较于生物素亚适量菌株具有明显优势，因此逐渐成为了各大发酵公司备受关注的L-谷氨酸发酵菌株。虽然温度敏感型谷氨酸棒杆菌潜力巨大，但是在其发酵过程中仍然存在着，在发酵后期菌体产酸能力下降，发酵罐内溶氧不足，导致流加糖消耗不完全，转化率降低，发酵速率降低，进而造成能物浪费，发酵周期提前进入半衰期等问题。
目前，国内一般的生产厂家在谷氨酸发酵控制方面还在使用传统的发酵控制策略，如pH值的控制、发酵通风量的控制、发酵温度的控制、发酵罐压力控制等，这些控制策略虽然对于谷氨酸的发酵很重要，但是仅仅采用这几种控制方式对于谷氨酸产酸量、产酸速率和糖酸转化率日益提高的今天来说显然是不够的。因此，如何用更加精细的谷氨酸发酵控制策略来取代传统的粗放的谷氨酸发酵控制，从而使得谷氨酸在产酸量、产酸速率以及糖酸转化率方面取得突破就显得尤为重要。谷氨酸发酵中后期因高温导致的菌体受抑制，如何解除这种抑制，继续提升发酵速率和单罐发酵产能，是我们需要解决的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供谷氨酸发酵菌的高温培养工艺，降低了谷氨酸发酵中后期因高温导致的菌体受抑制，提升了菌体浓度和发酵产能，增加了经济效益。
本发明是通过如下技术方案来实现的。
谷氨酸发酵菌的高温培养工艺，其包括如下步骤：
使用高温发酵培养基进行培养。
进一步地，
所述高温发酵培养基含有葡萄糖，乳糖，MnSO4·H2O，FeSO4·7H2O，MgSO4·7H2O，Na2HPO4·12H2O，KCl，VB1，生物素，生物氮素，甲硫氨酸。
优选地，
所述高温发酵培养基含有葡萄糖，乳糖，MnSO4·H2O，FeSO4·7H2O，MgSO4·7H2O，Na2HPO4·12H2O，KCl，VB1，生物素，生物氮素，甲硫氨酸，吐温-80。
更优选地，
所述高温发酵培养基含有：葡萄糖80g/L，乳糖5g/L，MnSO4·H2O 3mg/L，FeSO4·7H2O 3mg/L，MgSO4·7H2O 2g/L，Na2HPO4·12H2O 4g/L，KCl 2g/L，VB110mg/L，生物素7μg/L，生物氮素2g/L，甲硫氨酸0.6g/L，吐温-80 0.2g/L。
最优先地，
所述高温发酵培养基的组分为：葡萄糖80g/L，乳糖5g/L，MnSO4·H2O 3mg/L，FeSO4·7H2O 3mg/L，MgSO4·7H2O 2g/L，Na2HPO4·12H2O 4g/L，KCl 2g/L，VB110mg/L，生物素7μg/L，生物氮素2g/L，甲硫氨酸0.6g/L，吐温-80 0.2g/L。
具体地，所述高温培养工艺包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌种子液接入到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为32℃；待发酵液OD600＝30时，提高发酵温度为38-39℃，直至发酵结束；整个发酵过程中，控制通风比1∶0.8，搅拌转速200rpm，溶氧维持在20％，流加葡萄糖溶液维持残糖为1％，流加消泡剂消泡，同时流加氨水调节发酵液的pH值至7.2，直至发酵结束；发酵总时间36h。
更具体地，所述高温培养工艺包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌种子液按10％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为32℃；待发酵液OD600＝30时，提高发酵温度为38.5℃，直至发酵结束；整个发酵过程中，控制通风比1∶0.8，搅拌转速200rpm，溶氧维持在20％，流加800g/L的葡萄糖溶液维持残糖为1％，流加消泡剂消泡，同时流加氨水调节发酵液的pH值至7.2，直至发酵结束；发酵总时间36h。
优选地，所述谷氨酸棒杆菌种子液按照如下方法制备：
活化好的菌株用无菌水洗脱，洗脱后全部接种到配置好的种子培养基中进行种子培养；
所述的种子培养基为：葡萄糖40g/L，玉米浆干粉10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，MnSO4 5mg/L，FeSO4 5mg/L，苏氨酸1g/L，VH10 mg/L；
优选地，所述种子培养条件为：温度维持在32℃左右，溶氧控制在20％，pH通过氨水控制在7.0左右。
作为本发明的另一个发明点，一种耐高温发酵培养基，组分如下：葡萄糖80g/L，乳糖5g/L，MnSO4·H2O 3mg/L，FeSO4·7H2O 3mg/L，MgSO4·7H2O 2g/L，Na2HPO4·12H2O 4g/L，KCl 2g/L，VB110mg/L，生物素7μg/L，生物氮素2g/L，甲硫氨酸0.6g/L，吐温-80 0.2g/L。
与现有技术相比，本发明的研究出发点和取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本研究从谷氨酸发酵的基础理论出发，通过对谷氨酸发酵环境的研究，在传统的谷氨酸发酵控制策略的基础上，针对发酵中后期谷氨酸累积而导致的培养温度偏高影响发酵生产运行，导致发酵罐内溶氧不足，导流加糖消耗不完全，转化率降低，发酵速率降低，造成能物耗浪费，使发酵周期提前进入半衰期等问题。
高温对温度敏感型谷氨酸棒杆菌产酸有正向调节作用，但是过高的温度对菌株本身会造成损害，不利于菌株增殖；而且，发酵中后期，发酵罐中谷氨酸累积而导致的瞬时内部培养温度提高1-2℃，温度偏高影响菌株的活力，甚至造成部分菌株死亡，从而影响发酵效率；通过优化培养基的组分，提高菌株的高温耐受能力，获得高热耐受的菌株，从而有利于提高菌体浓度和发酵效率。
附图说明
图1：温度对菌体浓度的影响；
图2：乳糖对菌体浓度的影响；
图3：吐温-80对菌体浓度的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
谷氨酸发酵菌的高温培养工艺，其包括如下步骤：
菌体活化：将冷冻保藏的谷氨酸棒杆菌GDK-9接种到斜面上传代活化，传代两次。
所述斜面培养基为蛋白胨5g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉4g/L，玉米浆干粉25g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl1 g/L，琼脂粉25g/L，甲硫氨酸0.2g/L，pH＝6.8；
种子培养：将活化好的菌株用无菌水洗脱，洗脱后全部接种到配置好的种子培养基中进行种子培养。
所述的种子培养基为：葡萄糖40g/L，玉米浆干粉10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，MnSO4 5mg/L，FeSO4 5mg/L，苏氨酸1g/L，VH10 mg/L。
所述种子培养条件为：温度维持在32℃左右，溶氧控制在20％，pH通过氨水控制在7.0左右。
发酵培养：将谷氨酸棒杆菌GDK-9种子液(OD600＝20)按10％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为32℃。
高温培养：待发酵液OD600＝30时，提高发酵温度为38.5℃，直至发酵结束；整个发酵过程中，控制通风比1∶0.8，搅拌转速200rpm，溶氧维持在20％，流加800g/L的葡萄糖溶液维持残糖为1％，流加消泡剂消泡，同时流加氨水调节发酵液的pH值至7.2，直至发酵结束；发酵总时间36h。
所述发酵培养基为：葡萄糖80g/L，乳糖5g/L，MnSO4·H2O 3mg/L，FeSO4·7H2O3mg/L，MgSO4·7H2O 2g/L，Na2HPO4·12H2O 4g/L，KCl 2g/L，VB110mg/L，生物素7μg/L，生物氮素2g/L，甲硫氨酸0.6g/L，吐温-80 0.2g/L。
对比例1
谷氨酸发酵菌的高温培养工艺，其包括如下步骤：
种子液制备同实施例1。
发酵培养：将谷氨酸棒杆菌GDK-9种子液(OD600＝20)按10％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为32℃。
高温培养：待发酵液OD600＝30时，提高发酵温度为38.5℃，直至发酵结束；整个发酵过程中，控制通风比1∶0.8，搅拌转速200rpm，溶氧维持在20％，流加800g/L的葡萄糖溶液维持残糖为1％，流加消泡剂消泡，同时流加氨水调节发酵液的pH值至7.2，直至发酵结束；发酵总时间36h。
所述发酵培养基为：葡萄糖80g/L，MnSO4·H2O 3mg/L，FeSO4·7H2O 3mg/L，MgSO4·7H2O 2g/L，Na2HPO4·12H2O 4g/L，KCl 2g/L，VB110mg/L，生物素7μg/L，生物氮素2g/L，甲硫氨酸0.6g/L。
实施例2
对比例1使用的发酵培养基是申请人之前的研究成果，以其作为对照，验证实施例1的发酵培养基的高温培养效果。
分别设置高温培养的温度为：37，37.5,38,38.5,39,39.5,40，单位是℃；
高温对温度敏感型谷氨酸棒杆菌产酸有正向调节作用，但是过高的温度对菌株本身会造成损害，不利于菌株增殖；而且，发酵中后期，发酵罐中谷氨酸累积而导致的瞬时内部培养温度提高1-2℃，温度偏高影响菌株的活力，甚至造成部分菌株死亡，从而影响发酵效率；如图1所示，实施例1的最适高温为38.5℃，而对比例1的最适高温为37.5℃，通过比较峰值，实施例1较对比例1菌体浓度提高了2.5％左右。相应的，谷氨酸产量的趋势和菌体浓度的趋势几乎保持一致。
实施例3
在对比例1的基础上，设置高温为38.5℃，验证乳糖对菌体浓度的影响，如图2所示，随着乳糖添加量的增加，菌体浓度有所提升，乳糖浓度达到5g/L时，菌体浓度达到峰值，继续增加乳糖浓度，对菌体浓度影响不大。
设定乳糖浓度为5g/L，验证吐温-80对菌体浓度的影响，如图3所示，低浓度的吐温-80与菌体浓度正相关调节作用，但是当吐温-80浓度超过0.2g/L后，菌体浓度范围有所下降，提示，过量的吐温-80对温度敏感型谷氨酸棒杆菌GDK-9的增殖有不利影响。
以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种高温培养谷氨酸棒杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌GDK-9的种子液接入到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为32℃；待发酵液OD600＝30时，提高发酵温度为38.5-39℃，直至发酵结束；整个发酵过程中，控制通风比1∶0.8，搅拌转速200rpm，溶氧维持在20％，流加葡萄糖溶液维持残糖为1％，流加消泡剂消泡，同时流加氨水调节发酵液的pH值至7.2，直至发酵结束，发酵总时间36h；所述发酵培养基的组分及其浓度为：葡萄糖80g/L，乳糖5g/L，MnSO4·H2O 3mg/L，FeSO4·7H2O 3mg/L，MgSO4·7H2O 2g/L，Na2HPO4·12H2O 4g/L，KCl 2g/L，VB110mg/L，生物素7μg/L，生物氮素2g/L，甲硫氨酸0.6g/L，吐温-80 0.2g/L。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌GDK-9种子液按10％接种量接入发酵罐，待发酵液OD600＝30时，提高发酵温度为38.5℃，所述流加的葡萄糖溶液的浓度为800g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌种子液按照如下方法制备：活化好的菌株用无菌水洗脱，洗脱后全部接种到配置好的种子培养基中进行种子培养；所述的种子培养基为：葡萄糖40g/L，玉米浆干粉10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，MnSO4 5mg/L，FeSO4 5mg/L，苏氨酸1g/L，VH 10mg/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述种子培养条件为：培养温度为32℃，溶氧控制在20％，通过氨水控制pH在7.0。
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